志贺氏菌检测

志贺氏菌的检验（国标法）一、增菌称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6~8h。

培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。

二、分离和初步生化试验取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36℃培养18~24h。

志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。

挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。

一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18~24h，分别观察结果。

下述培养物可以弃去：a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；b. 在18~24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；d. 产气的培养物；e. 有动力的培养物；f. 产生硫化氢的培养物。

凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。

三、血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。

先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。

如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。

福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。

可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。

4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1~15各型因子血清检查。

如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3~12型多价血清及各型因子血清检查。

四、进一步的生化试验在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖铵西蒙氏柠檬酸盐赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶pH7.2尿素KCN生长水杨苷和七叶苷的分解除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。

必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。

生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。

已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵甘露醇棉子糖甘油的发酵靛基质试验志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。

但福氏6型的生化特性与A群或C群相似。

五、结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。

志贺氏菌PCR检测技术进展志贺菌又称痢疾杆菌，能侵袭结肠膜上皮细胞，引起人类细菌性痢疾。

按抗原结构和生化反应的不同可分为痢疾、福氏、鲍氏和宋内氏志贺菌。

传统的检测方法必须经过增菌培养、分离培养和初步生化实验等步骤，操作烦琐费时。

分子杂交不但技术复杂，而且克隆培养时其大质粒极易丢失和基因突变，阳性率不高。

聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR），是一种体外DNA扩增技术，在体外利用模板DNA、特定的寡聚核苷酸引物和DNA聚合酶，通过DNA变性、复性和延伸过程合成一条互补的DNA链。

反复重复这一过程，模板DNA 就可得到大量扩增。

随着微生物基因组学的发展，对志贺菌的基因结构已经清楚，1987年Buysse等［1］发现志贺菌侵袭性质粒抗原H（invasive plasmid, ipaH）存在于各型志贺菌，同时多拷贝存在于染色体和侵袭性大质粒上，不随传代而丢失。

1995年，Fasano等［2］报道两种志贺菌肠毒素SHET1、SHET2编码基因。

根据志贺氏菌特异性基因片段中的开放框架部分序列设计引物，可进行PCR检测。

现将志贺氏菌PCR检测技术研究进展综述如下。

1 常规PCR常规PCR必须知道待扩增目的片段的序列，根据这一序列设计一对相应的引物。

1998年，Islam 等［3］以志贺菌ipaH基因序列为靶目标，设计一对引物（5′-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGA TAC-3′和5′-GCCGGTCAGCCACCCTA-3′），扩增产物为700 bp, 他们对临床上疑似菌痢的粪便标本进行检测，以PCR为金标准，培养法的敏感性和特异性分别为72%和100%。

他们对123株侵袭性大肠杆菌进行PCR检测，没有产生阳性结果。

常规PCR扩增后需做凝胶电泳鉴定，比较繁琐，而且扩增产物极易受到污染造成假阳性。

2 多重PCR多重PCR 是在同一个反应管中用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

由于志贺菌有4个种群，具不同的抗原基因，只针对一种抗原基因的单一PCR，有时会漏检也不利于分群。

多重PCR能全方位高效率地检测志贺菌。

Thong等［4］针对志贺菌的set1A、set1B、ial、ipaH基因，设计不同的引物对，扩增序列分别为set1A（5′-TCA CGC TAC CAT CAAAGA-3′和5′-TAT CCC CCT TTG GTGGTA-3′）、set1B（5′-GTG AAC CTG CTG CCGA TA TC-3′和5′-ATT TGT GGA TAA AAATGA CG-3′）、ial(5′-CTG GAT GGT A TG GTGAGG-3′和5′-GGA GGC CAA CAA TTATTT CC-3′)、ipaH(5′-TGG AAA AAC TCA GTGCCT CT-3′和5′-CCA GTC CGT AAA TTCA TT CT-3′)在同一PCR反应体系内同时扩增set1A、set1B、ial、ipaH基因，对110株志贺菌其中福氏84株、宋内氏15株、痢疾10株、鲍特氏1株进行检测。

结果显示，重现性为100%，最低检测浓度为100 cfu/ml，并且不出现假阳性和假阴性。

与其他常规方法相比，多重PCR省时、省力、灵敏性更高，在做更多基因靶点时优势更突出，也可用于志贺菌的鉴定。

3 免疫磁珠分离PCR（IMS-PCR）免疫磁珠（immunomagnetic bead, IMB）就是将直径0.05～4 μm具有超顺磁性的微粒表面经化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能与特异性抗原结合且有磁性的磁珠。

被检测样品在磁板背景下与IMB混合，若有相应的抗原存在，IMB就会将其捕获，利用磁性将IMB聚集，然后进行分离，用于PCR测定。

Islam 等［5］用志贺菌单克隆抗体包被环氧超顺磁珠，然后再采用IMB对标本中的志贺菌进行IMS，用于下一步的PCR检测。

他们根据志贺菌ial基因序列，设计一对引物（5′-CTGGATGGTATGGTGAGG-3′和5′-GGAGGCCAACAATTATTTCC-3′），探针（5′-CCATCTATTAGAA TACCTGTG-3′），预期的扩增产物为320 bp。

对248份粪便标本进行IMS-PCR检测，同时用基因探针平行检测。

结果57份痢疾1型和68份福氏菌全部检出，最低检出量分别为10个细菌/克。

与探针检测结果相符。

IMS-PCR技术最突出的优点是特异性强，可以明显提高准确性，快速仅用7 h就能完成检测结果。

4 免疫捕捉PCR（Immunocapture PCR）通过免疫捕捉结合PCR扩增来检测微量抗原的方法。

Peng等［6］在固相载体（聚苯乙烯）上包被志贺菌特异性抗体，捕获志贺菌后，用于下一步的PCR检测。

他们以志贺菌16 S核糖体rRND保守区域作为靶目标，设计引物（5′-AAACTCAAAGGAATTGAC-3′和5′-GACGGGCGGTGTGTACAA-3′），预期扩增片断为500 bp，对35份样本进行检测，同时用常规PCR法和培养法平检测。

结果Immunocapture PCR 有23份阳性，培养法5份阳性，该法灵敏度高于常规PCR 4倍以上。

免疫捕捉PCR检测对象是完整的病原体,具有非常高的特异性和敏感性,在传染病的诊断、流行病学调查以及环境微生物的检测等诸多领域有着广阔的应用前景。

5 实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR包括探针类和染料类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，染料类如SYBR Green I 则是利用与双链DNA 小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。

前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高；但后者则简便易行，成本较低。

荧光探针技术是基于标记基团的荧光共振能转移原理（FRET）而实现的，当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称FRET。

按其基团标记和能量转移的方式，目前已经开发出几种相关的技术，如Taq Man TM探针、双杂交探针、分子信标、Amplisensor 和LUX TM Primers等。

5.1 Taq Man TM技术Taq Man TM技术是在一条20多bp的寡核苷酸探针的两端分别标记上荧光发射基团和淬灭基团，在PCR反应中设立标准品模板系列和阴性对照，根据FRET原理，探针完整时发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；当PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个游离的荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，并计算出Rn值、△Rn值、Ct值和阈值。

Ct值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR反应循环数。

同时利用标准品模板系列绘制出标准曲线，结合各样品的Ct值，就可以确定样品的起初模板量。

Thiem等［7］以ipaH基因为靶目标，设计引物（5′-CCT TTT CCG CGT TCC TTG A-3′和5′-CGG AAT CCG GAG GTA TTG C-3′）和TaqMan探针(6-carboxyfluorescein-CGCCTTTCCGATACCGTCTCTGCA-6-carboxytetramethylrhodamine)对肛拭标本进行实时PCR检测，同进行细菌培养，结果实时PCR与培养法符合率为93%，在培养法阴性的疑似细痢的标本中，实时PCR检出率为36%。

5.2 分子信标PCR 分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，环形部分的碱基可与目标核苷酸序列互补，一般为15～30个核苷酸长；茎部是由互相配对的碱基组成，不能与目标基因相配对结合，一般5～7个核苷酸长；在3′和5′端分别接上发光基团和淬灭基团，当溶液中有特异模板时分子信标与模板杂交，从而破坏了发卡结构即实现了FRET，释放出荧光信号，荧光的强度与溶液中分子信标的量成正比，从而实现了对目的基因的定量检测。