含氮大环内酯类抗生素生物合成及其研究进展.

含氮大环内酯类抗生素及其生物合成研究进展雷帕霉素、他克莫司等一类含氮大环内酯类微生物代谢产物是目前临床重要的药物，它们具有特殊的结构基团，即内酯环上含有1分子非蛋白质组成氨基酸——哌可酸，通过哌可酰基与细胞内一类具有脯氨酰顺反异构酶活性的免疫亲合蛋白（immunophilin）FKBPs（FK506 bingding proteins）相互作用形成复合物，作用于细胞不同靶位，发挥多种不同的生物学功能[1]。

这类化合物具有广泛的生物学活性，除抗真菌活性外，临床已用作器官移植抗排斥药物、血管扩张支架涂层药物[2]、靶向抗肿瘤药物[3-4]、炎症治疗药物[5]，同时，这类化合物还具有潜在的治疗中风[6]、神经退行性疾病[7]、帕金森综合症[8]、老年痴呆[9]等作用，Harrison等人2009年7月在《Nature》杂志上报道雷帕霉素可以延长哺乳类动物老龄小鼠寿命的研究成果[10]，立即引起各国科学家的广泛关注和高度兴趣[11]，美国《Science》杂志把此项研究成果评选为当年十大科学进展之一，预计10年左右可望应用于人体。

含有哌可酰基的含氮大环内酯类微生物代谢产物具有相似的生物合成途径，它们都属大环内酯类化合物，由典型的具有模块结构的I型聚酮合酶（Polyketide synthase, PKS）催化合成内酯环碳链骨架，由单模块的非核糖体肽合成酶（Non-ribosomal peptide synthetase, NRPS）催化把哌可酸整合到内酯环骨架，并通过环化酶活性域使含哌可酰基的聚酮链内酯化从PKS/NRPS杂合酶上脱离，最后通过一些列氧化酶、甲基转移酶等进行侧链基团的修饰形成最后的活性产物，由于这类化合物具有相似的结构和合成机制，特别是它们的作用机制独特带来广泛的生物学活性和临床应用前景，已经成为目前国内外关注和研究的热点。

一、微生物产生的含氮大环内酯类化合物1、Rapamycin（雷帕霉素, 西罗莫司/sirolimus）1975年，加拿大Ayerst试验室Vezina等在筛选抗真菌抗生素中，从太平洋复活岛土壤样品中分离到一株具有抗白色念珠菌（Candida albicans）等酵母样真菌和石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)等丝状真菌活性的吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicusNRRL5491）[12]，并从其发酵液中分离得到一个新的含氮三烯36元环大环内酯类抗真菌化合物（图1），即雷帕霉素。

1988年Delin 和Hargrave 受FK506独特大环内酯结构的启发, 根据FK506和雷帕霉素化学结构的相似性和均具有免疫抑制作用的特点，提出详细比较两种化合物的生物学功能，重新对雷帕霉素的免疫抑制活性进行研究。

历经25年，1999年9月FDA 批准美国家用产品公司（AHP ）的雷帕霉素及其口服液作为器官移植抗排斥药物投放市场[13]。

2008年Goodfellow 等人采用形态学结合遗传学分析方法对雷帕霉素产生菌重新进行分类学研究，正式把产生菌Streptomyces hygroscopicus NRRL5491定名为Streptomyces rapamycinicus 新种[14]。

2、Tacrolimus （他克莫司，FK506）1983年美国FDA 批准真菌产生的十一环肽抗生素环孢素（Cyclosporin A ）作为免疫抑制剂用于器官移植抗排斥反应，成功应用于抑制骨髓移植受体的抗排斥和自身免疫性疾病的治疗，为器官移植治疗带来革命性的突破，免疫抑制剂的研究进入一个新的发展时代。

日本藤泽公司（Fujisawa ）建立混合淋巴细胞、T 淋巴细胞生长、白细胞介素II 合成等模型，开展从微生物代谢产物中筛选具有免疫抑制活性的新型化合物，1987年从大阪筑波土壤中分离得到一株筑波链霉菌（Streptomyces tsukubaensis No. 9993）[15]，其代谢产物能够抑制IL-2的合成[16]，经过发酵、分离、纯化获得另一个含哌可酰基23元环大环内酯类化合物Tacrolimus （他克莫司，FK506）（图2）。

图1 雷帕霉素结构式 图2 FK506结构式生物学活性研究发现FK506具有很强的免疫抑制特性，其活性是环孢素的10-100O N O H 3C H 3C HO O O O H 3C OH OCH 3O OH H 3CO O CH 3CH 3CH 3OCH 3O N O H 3C HO O O O H 3C OH OCH 3OCH 3OCH 3CH 3CH 3O OH CH 3CH 21102131112627131517192022242527283289倍，预防各种器官移植所出现的排斥反应的效果优于环孢素。

1989年，美国匹兹堡大学Starzl器官移植中心将FK506首次在临床试用，1993年在日本上市，商品名普乐可复（Prograf）。

1995年经FDA获准后在多个国家正式使用，1999年获准在中国上市。

目前，普乐可复已广泛应用于肝脏、胰腺、肾脏、心脏、肺等实体器官移植的抗排斥作用。

3、Ascomycin（子囊霉素，FK520, 免疫霉素/immunomycin）继FK506之后，1988年藤泽公司又报道从另一株链霉菌Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis No 72381代谢产物中获得两个新的与FK506结构类似的23元环含哌可酰基大环内酯类化合物FR900520和FR900523（图3、4）[17]。

它们与FK506结构仅在内酯环C-21位上侧链不同，分别是乙基、甲基，而FK506该位置是烯丙基。

体外混合淋巴细胞反应实验显示两个化合物均有免疫抑制作用，IC50分别为0.55 nM 和1.6nM，略高于FK506的0.23 nM。

低于3200nM对淋巴瘤EL-4体外没有细胞毒作用。

21 21图3 FR900520结构式图4 FR900523结构式两个化合物对细菌和酵母样真菌均没有抗菌活性，对丝状真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus IFO 5840）显示较强抗菌活性，MIC分别为0.03μg/ml and 0.3μg/ml。

FR900520能够明显延长皮肤移植物存活时间，并显现量效关系。

1992年Morisaki等人证实FR900520与Arai等人1962年报道的从吸水链霉菌子囊霉素变种（Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC14891）中发现的抗真菌抗生素子囊霉素（Ascomycin）同质[18]。

4、Meridamycin（美立霉素）由于环孢素、FK506和雷帕霉素等微生物来源的免疫抑制剂的临床成功应用，引起各国科学家广泛关注，试图从微生物代谢产物中发现选择性更强、毒性更低的新型免疫调节剂。

特别是把FK506和雷帕霉素共同的结合靶标FKBP12作为研究基础开展广泛的化合物筛选，1994年和1995年，瑞士山道士公司Fehr[19]和美国默克公司Salituro[20]等人先后报道从两株链霉菌（Streptomyces sp. A 91-261 402和Streptomyces hygroscopicus F-004081）代谢产物中发现一个新的29元环含哌可酰基大环内酯类化合物，命名为Meridamycin（美立霉素）（图5），内酯环含有1分子哌可酰基和相连的环半酮缩醇结构（图5蓝色部分），这部分结构可能是FKBP12结合的关键基团，与雷帕霉素完全相同，而与FK506仅相差一个氧甲基。

Meridamycin能够竞争性抑制FK506与FKBP12结合，IC50为1.0 ng/mL，但其本身没有免疫抑制活性，能够拮抗FK506和雷帕霉素的免疫抑制活性，因此可能作为K506和雷帕霉素过量服用的解毒剂，另外还发现其可作为皮质激素的增效剂用于治疗皮肤炎症和增生。

作为非糖皮质激素治疗特应性皮炎，FK506和FK520的半合成衍生物吡美莫司（Pimecrolimus）（图6）已获准上市，被誉为外用糖皮质激素后皮肤科治疗最重要的突破之一。

图5 Meridamycin结构式图6 Pimecrolimus结构式研究发现Meridamycin及其衍生物在治疗神经退行性疾病，如老年性痴呆（Alzheimer’s）、帕金森综合症（Parkinson’s disease）、创伤性和缺血性神经损伤，促进神经再生和神经保护等方面具有潜在的应用前景，引起了广泛的关注。

美国惠氏公司已就此申请了专利保护[21]。

5、Antascomicins瑞士山道士公司上世纪八十年代研发成功十一环肽抗生素环孢素用于器官移植抗排斥治疗之后，他们又利用子囊霉素、FK506和雷帕霉素这类化合物通过与免疫亲合蛋白（immunophilin）结合发挥免疫抑制活性的作用机制，广泛筛选能够与此类蛋白结合的微生物代谢产物，继1994年报道发现Meridamycin后，1996年又报道从12000株放线菌中发现一株从采自中国的土壤样品中分离得到的小单孢菌（Micromonospora sp. A92-306401）[22]，其发酵液中分离得到5个与FK506结构类似新的23元环含哌可酰基大环内酯类化合物Antascomicins（图7）。

R1R2R3nantascomicin A =H =H =H 2antascomicin B =OH =H =H 2antascomicin C =OH =CH3=H 2antascomicin D =H =H =H 1antascomicin E =H =H =OH 2图7 Antascomicins结构式Antascomicins具有很强的FKBP12结合能力，除了内酯环上哌可酰基被脯酰基取代的Antascomicin D外，其余4个化合物与FKBP12结合能力与FK506和雷帕霉素相当，Antascomicin D结合力低5-10倍，混合淋巴细胞反应实验显示Antascomicins没有抑制T淋巴细胞增殖活性，在FK506相同剂量条件下无抑制白细胞介素II合成的活性，也没有类似雷帕霉素抑制细胞生长因子诱导的增殖活性。

同meridamycin一样，Antascomicins能够拮抗FK506和雷帕霉素的活性，特别是对雷帕霉素，等摩尔浓度的Antascomicin B或者C即可抵消雷帕霉素体外活性。

6、Nocardiopsins2010年澳大利亚昆士兰大学Capon等人[23]从55米深处海洋沉积物中分离得到一株拟诺卡氏菌（Nocardiopsis sp. CMB-M0232），该菌种在不含海水的培养基中产生两个22元环含哌可酰基大环内酯类化合物nocardiopsin A和B（图8）。