酵母双杂交技术研究进展_张迪

在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现 象 。 所谓假阴性 , 即两个蛋白本应发生相互作用 , 但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出 来[ 4] 。造成假阴性的原因主要有两 方面 :一是融 合蛋白的表达对细胞有毒性 。 这时应该选择敏感性 低的菌株或拷贝数低的载体 。 二是蛋白间的相互作 用较弱 , 应选择高敏感的菌株及多拷贝载体 。目前 假阴性现象虽不是实验中的主要问题 , 但也应予以 重视 。
① 863 计划(863-102-11-02-02)及国家人类基因组南方研究中心(CN C-99Z-01)资助项目 。 ② 男 , 1971 年生 , 硕士 ;研究方向 :酵母分子遗传学与基因工程 。 ③ 联系人 。
(收稿日期 :1999-11-28)
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传递途径 。(4)分析新基因的生物该新基因的功能 。
酵母双杂交系统由三个部分组成 :(1) 与 BD 融合的蛋白表达载体 , 被表达的蛋白 称诱饵蛋白 (bai t)。 (2) 与 AD 融合的蛋白表达载体 , 被其表 达的蛋白称靶蛋白 (prey)。 (3)带有一个或多个 报告基因的宿主菌株 。 常用 的报告基因有 H IS 3 , UR A 3 , L acZ 和 ADE2 等 。 而菌株则 具有相应的 缺陷型 。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和 营养标记基因 。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴 定与分离 。根据目前通用的系统中 BD 来源的不同 主要分为 GAL4 系统和 LexA 系统 。 后者因其 BD 来源于原核生物 , 在真核生物内缺少同源性 , 因此 可以减少假阳性的出现 。
酵母双杂交技术在应用中发挥了巨大的作用 , 但人们也注意到了它有一定的局限性 。为此发展了 多种适应不同目的需要的改型的双杂交技术 。
反向双杂交技术 在研究中检测并鉴定出那些 能阻断两个蛋白间相互作用的因素有重要意义 。在 研究那些能使相互作用被阻断的因素 (如寻找哪些 结构域上发生突变可使相互作用中断或那些分子可 以阻断相互作用)时 , 传统的双杂交技术有较大的 局限性 。 因 此 , 反 向 双杂 交系 统 (Reverse T woHybrid System)应运而生[ 6 , 7] 。这项技术的特点是 采取了反选择筛选策略 。 根据反选择设计的不同 , 大致可以 分为 两类 。一 类是 用便于 反选 择的 UR A 3 或 CY H2 基因作为报告基因 。 UR A 3 基因 编码尿 嘧 啶 合成 途 径 中的 重 要酶 :乳 清 酸核 苷 5' -磷 酸 脱 羧 酶 , 它 能 把 5' -氟 乳 清 酸 (5' FOA)转变为细胞毒性物质 , 使细胞无法生长 。反 之 , 在能生长的细胞中 , 外界因素已使蛋白间的相 互作用不能发生 , 而我们想知道的正是这些因素 。 因此 , 只要对存活的克 隆进行检测就 可以得到结 果 。Vidal 等人 用这 种 技术 发 现了 影 响转 录 因子 E2F1 中与 DP1 相互作用必需区内的点突变[ 9] 。另 一类是将常规报告基因 (如 HIS 3)置于大肠杆菌 转座子 T n10 编码的 tet-抑制因子(Tet R)/ 操纵基因 控制之下 。待测蛋白之间发生相互作用后首先激活 tet-R 基因表达抑制因子 Tet R, Tet R 结合到 tet 操 纵基因后就抑制了报告基因的表达 , 结果转化子不 能生长 。只有当待测蛋白之间的相互作用被某种因
高技术通讯 2000.3.
酵母双杂交技术研究进展 ①
张 迪 ② 霍克克 ③ 顾科隆 赵 翔 李育阳
(复旦大学遗 传学研究所基因工程国家重点实验室 上海 200433)
提 要 酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法 , 在蛋白质相互作用的研 究方面得到了广泛的应用并取得了许多有价值的重要发现 。作为一个完整的实验系统 , 它自建立以来经过了不断的改进与完善 , 不仅进一步提高了实验结果的可靠性与精确 性 , 而且在此基础上又发展了反向双杂交 , 三杂交及核外双杂交等多项技术 。 这些都将 对功能基因组学和蛋白质组学的研究起到杂交技术研究进展
之一 , 特别是对低丰度 cDNA 库进行筛选时 , 必须 提高转化效率 。 转化时可采用共转化或依次转化 , 相比之下共转化省时省力 。 更重要的是如果单独转 化会发生融合表达蛋白对酵母细胞的毒性时 , 共转 化则可以减弱或消除这种毒性 。 一种更有效的方法 是将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合 型的单倍体酵母中 , 通过两种接合型单倍体细胞的 杂交将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一个二倍体细胞 。
目前很多机构建立了大量的 cDNA 和基因 组 , 但这些大多无法直技术来达到这个 目的的方法[ 5] 。
4 酵母双杂交技术的新发展
这个原理 , 可将两个待测蛋白分别与这两个结构域 建成融合蛋白 , 并共表达于同一个酵母细胞内 。如 果两个待测蛋白间能发生相互作用 , 就会通过待测 蛋白的桥梁作用使 AD 与 BD 形成一个完整的转录 激活因子并激活相应的报告基因表达 。通过对报告 基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间 是否发生了相互作用 。
1 酵母双杂交技术的基本原理
1989 年 , Song 和 Field 建立了第一个基于酵母 的细胞内检测 蛋白间相互作 用的遗传系统[ 1] 。 很 多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个 可分割开的结构 域 , 即 DNA 特异结合 域 (DNAbinding dom ain , BD) 与 转 录 激 活域 (T ranscriptional act ivation domain , AD)。 这两个结构域各具 功能 , 互不影响 。但一个完整的激活特定基因表达 的激活因子必须同时含有这两个结构域 , 否则无法 完成激活功能 。 不同来源激活因子的 BD 区与 AD 结合后则特异地激活被 BD 结合的基因表达 。 基于
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素所阻断而无法激活 tet-R 基因时 , 报告基因才能摆 脱 tet 操纵基因的控制而表达 , 使转化子获得在选择 培养基上生长的能力 。Shih 等人利用这种方法鉴定 出 cAM P- 应 答 元 件 结 合 蛋 白 (cAM P-response element binding protein , CREB)中 磷酸 化位 点 的 Ser133 突变会阻断其与辅助激活因子(C REB 结合 蛋白)的相互作用[ 8] 。
三杂交技术 在许多细胞内信号传递过程中 , 两个蛋白间的相互作用常涉及到其它的大分子 。如 蛋白 , 激酶 , RNA , 多肽及其它大分子 。在研究这些 大分子对蛋白间相互作用的影响过程中发展了一种
新的 技 术 系 统 ——— 三 杂 交 系 统 (Three-Hybrid System), 其本质与双杂交是相同的 , 只是需通过第 三个分子的介导把两个杂交蛋白带到一起[ 9] 。例如 小配 体 三 杂 交 系 统 (Small Ligand Three-Hybrid System)是 利 用 可 以 渗 透 的 二 聚 体 化 学 诱 导 物 (Chemical Inducers of Dimerization , CIDs)作桥梁 , 将 AD 和 BD 融合蛋白连接到一起 , 激活报道基因的 表达 。研究较多的是免疫抑制剂 FK 506[ 10] 。Belshaw 等将 F K506 与环孢菌素 A(Cy clospo rin A)构建成异 源二聚体 , 它能把分别与 FK506 和环孢菌素 A 有相 互作用的 AD 和 BD 融合蛋白拉倒一起 , 激活报告基 因[ 11] 。Licit ra 将 FK 506 与地米塞松(dexamet hasone )通过共价键连接成二聚体 。通过实验进一步证实 了 F K506 与 蛋 白 FKBP-12 间 的 特 异 性 相 互 作 用[ 12] , 表明用这种方法鉴定蛋白与小分子间的相互 作用是切实可行的 。RNA 与蛋白之间的相互作用是 许多细胞生命活动的基础 , 例如 m RNA 的翻译 , 早 期发育以及 RNA 病毒的感染等 。然而可用于这方面 研究 的简 便方 法 却很 少 。RNA 三 杂交 系 统(RNA T hree-Hybrid Sy stem)的建立为分析 RNA 与蛋白之 间的相互作用提供了有效的手段 。这个系统主要是 由一个 RNA 分子和两个都能结合该 RNA 的蛋白质 组成 。此 RNA 的一部分与一个已知蛋白结合后就可 利用它的另一部分去筛选新的 RNA 结合蛋白 。因此 这种技术既可检测由 RNA 介导的两个蛋白质之间 的相 互作 用 , 也可 筛选 鉴定 新的 蛋白 结合 RNA 。 Put z 等把 HIV-1 病毒 Rev 蛋白的突变体 RevM10 与 Gal4 DB 域融合作为诱饵蛋白 , 利用该 RevM 10 蛋白 能识别并结合其靶 RNA 中 Rev 蛋白反应元件(Rev responsive element , RRE)的作用去筛选同样也能与 此 RNA 结合并已与 Gal4 AD 域融合的未知蛋白 。根 据同样的原理 , 如将一个已知 RNA 与 RRE 融合形 成杂合 RNA 分子并配以 RevM 10-Gal4 DB 融合蛋白
(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生 , 即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同 一时间表达且定位在同一区域 。
(2) 某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解 途径的成员 , 它们具有普遍的蛋白间的相互作用的 能力 。
(3) 一些实际上没有任何相互作用的但有相同 的模体 (mot if)如两个亲 a-螺旋的蛋白质 间可以 发生相互作用 。 十年来 , 酵母双杂交技术一直在消 除假 阳 性方 面 不 断改 进 , 并且 已 取 得较 好 的 效 果[ 2 , 3] 。
3 常见问题的解决与改进
酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳 性较多 , 二是转化效率偏低 。 所谓假阳性就是 :在 待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下 , 报告基因被激活 。主要原因是由于 BD 融合诱饵蛋 白有单独激活作用 , 或者这种融合蛋白的激活作用 被外 来 蛋 白 激 活 。 另外 AD 融 合 靶 蛋 白 如 果 有 DNA 的特异性结合 , 则也可单独激活报告基因的 表达 。因此 , 为排除假阳性就需要作严格的对照试 验 。 应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的 鉴定 。目前几个公司推出的酵母双杂系统都采用了 多个报告基因 , 且每个报告基因的上游调控区各不 相同 , 这可减少大量的假阳性 。另外 , 报告基因通 常整合到染色体上 , 可以使基因表达水平稳定 , 消 除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而 造成的假阳性 。 即使根据严格的对照实验证明确实 发生了蛋白间的相互作用 , 还应对以下方面进行分 析: