真菌操作常规20070307
检验科真菌实验室sop文件
目录1.临床微生物实验室(细菌室和真菌室)工作制度2.真菌实验室的质控3.细菌、真菌室污染物处理原则4.真菌实验室的消毒5.真菌实验室的灭菌6.检验科真菌室检验项目7.浅表真菌的收集及检查8.真菌培养、药敏及鉴定9.标本的收集10.标本的显微镜检11.真菌培养12.病原性酵母菌常用鉴定方法13.蠕行螨的取材及检查14.疥螨的取材及检查15.头虱的取材及检查16.体虱的取材及检查17.阴虱的取材及检查18.常用培养基的制备真菌实验室的灭菌1.玻璃器具的灭菌方法：（1）检查、接种真菌用过的玻璃器具如试管、平皿、载玻片、盖玻片、吸管等应高压蒸汽灭菌。
（2）灭菌后，清洗内容物。
（3）再用清洗液浸泡，或用肥皂水刷洗。
（4）最后用流动水将清洗液或肥皂水冲洗干净，烘干备用。
（5）制备无菌培养基也可采用高压蒸汽灭菌。
（6）制备无菌的培养基、玻片、盖片最好采用干热灭菌，放入烘箱内，使温度逐渐上升至150-160度，保持2小时，关闭电源，使其缓慢冷却，如果采用高压蒸汽灭菌，应用多层报纸或棉垫包好、包严、以便取出后仍保持无菌。
（7）以灭菌的2周内有效，超过2周的应重新灭菌后方可使用2. 室内灭菌法：（1）40%甲醛熏蒸法：加热或在高锰酸钾中加入甲醛，是之放出甲醛气体，空间密封24小时，50gKMnO4+100ml甲醛。
（2）乳酸熏蒸法：2份乳酸加1份水置于干锅内混均后，将干锅放在铁架台上，下面用酒精灯加热，空间密封24小时。
（3）紫外线照射：应分片照射，每次照射1-2小时。
3. 清洗液的配制法：蒸馏水2000mg，重铬酸钾1000g，浓硫酸8000ml。
真菌实验室的消毒1.临床标本投入黄色医用垃圾袋中，统一焚烧处理。
2.实验室每天用84或健之素消毒桌面。
3.菌污染桌面或台面，用5%石炭酸溶液覆盖3-5分钟，切不可用水直接冲洗。
4.实验室每月消毒一次，用40%甲醛熏蒸法，每10-15平方米用50gKMnO4+100ml甲醛5.定期用5%石炭酸液擦洗地面。
真菌培养方法和步骤
真菌培养方法和步骤《真菌培养方法》咱来说说真菌培养这回事儿哈。
要培养真菌，第一步得准备好工具和材料。
你得有培养皿，这就像真菌的小房子。
还有培养基，这是真菌的食物。
另外，无菌操作的工具也不能少，像接种环啥的。
然后呢，把采集到的样本放到培养皿里。
用接种环轻轻地把样本在培养基上涂抹均匀。
这时候得注意，动作要轻，别把培养基弄坏了。
弄好之后，把培养皿盖上盖子，放到一个温度合适、湿度也合适的地方。
一般来说，二十多度就差不多。
在培养的过程中，得经常去看看。
看看真菌有没有长出来，长出来的样子对不对。
要是发现有什么不对劲的，就得赶紧找找原因。
等真菌长出来了，还得观察它的形态、颜色啥的。
看看是不是自己想要培养的那种真菌。
培养真菌其实不难，只要细心点儿，按照步骤来，就能成功。
再跟您说一说真菌培养哈。
培养真菌，就跟照顾小宝宝似的，得用心。
先把该有的东西准备齐全，像干净的培养皿、专门的培养基，还有接种用的小工具。
接着去找真菌样本，就像在大自然里寻宝一样。
可以在阴暗潮湿的角落里，或者是一些变质的东西上找。
找到样本后，小心地放进培养皿，用接种环慢慢把它铺开在培养基上。
这一步可不能着急，得稳稳当当的。
放好了，就给培养皿找个舒服的“家”，温度湿度都得刚刚好，让真菌能舒舒服服地长大。
这期间，要像关心孩子一样关心它们，多瞅瞅有没有变化。
等到真菌冒头了，那可得好好瞧瞧，看看是不是咱们期待的那种。
只要您有耐心，培养真菌不是啥难事，说不定还能发现很多有趣的东西呢！《真菌培养步骤》今天咱来唠唠真菌培养的步骤。
得把东西准备齐活了。
有培养皿、培养基，还有消毒的接种工具，这些一个都不能少。
然后去找真菌的样本，这可得有双火眼金睛。
可以在一些发霉的东西上找，比如说放久了的水果、长黑斑的蔬菜。
找到样本后，在无菌的环境下操作。
打开培养皿，用接种工具把样本轻轻放到培养基上，均匀铺开。
弄好之后，把培养皿盖好，放到恒温箱里。
温度一般调在 25 度左右，湿度也得合适。
真菌鉴定操作方法包括
真菌鉴定操作方法包括真菌鉴定是一个重要的实验操作，主要用于识别和分类不同类型的真菌。
下面是一个关于真菌鉴定的详细操作方法，包括准备实验材料、样品采集、样品处理、显微镜观察和种类鉴定等步骤。
1. 准备实验材料- 显微镜和镜片- 鉴别图谱或参考书籍- 培养基和培养皿- 高温消毒器、吹风机和灭菌剂- 实验手套和口罩- 细胞计数器或显微镜计数室2. 样品采集- 选择合适的样品，可以是土壤、植物组织、食物等。
- 使用消毒的工具（如消毒的剪刀或刮刀），在不受污染的情况下采集样品。
- 将采集的样品置于消过毒的袋子中，以防止交叉污染。
3. 样品处理- 使用消毒剂或抗菌液清洗样品表面，以去除外部的真菌。
- 将样品分为几个部分，可以在不同培养基上进行培养。
- 使用刮刀或剪刀将样品切碎或捣碎。
4. 培养基处理- 准备适当的培养基。
- 将培养基加热至溶解状态，然后轻轻摇晃，使其均匀分布。
- 将培养基倒入已消过毒的培养皿中，约为1/3至1/2的高度。
- 使用高温消毒器或微波炉将培养皿加热至液体沸腾。
5. 样品接种和培养- 使用一根消过毒的扁柔尖头棒，将样品均匀地涂抹在培养基表面上。
- 确保样品的分散和均匀分布。
- 使用针刺法或击悬法对样品进行无菌采样。
- 将培养皿盖好，尽量避免空气、灰尘或其他污染物进入。
6. 培养条件和观察- 将培养皿放在适当的温度下（通常是25至30），以利于细菌的生长。
- 观察培养皿的变化，包括真菌的形态和色素的产生，以及其他生长特征，如菌丝、分生孢子等。
- 使用显微镜观察真菌的微观结构，注意形状、大小和颜色的变化。
7. 种类鉴定- 使用鉴别图谱或参考书籍，对观察到的真菌进行分类和鉴定。
- 根据形态特征、生长条件、产孢体和孢子形态等进行确定。
- 与已知的真菌对照组进行比较，以确保准确性。
总之，真菌鉴定是一个复杂而重要的实验操作。
通过遵循上述操作方法，可以准确地鉴定出不同类型的真菌，并进一步研究和了解其生长、分类和特性。
真菌检测操作规程
念珠菌属鉴定的操作规程（Standard Operating Procedure for Candida）1、介绍(Intorduction)：念珠菌是一种腐物寄生菌，广泛存在于自然界。
是人体正常菌群之一，平时主要生存于人体的口腔、上呼吸道、消化道、阴道及其他脏器中。
念珠菌的致病性是相对的。
在正常情况下，寄生在人体内的念球菌呈酵母细胞型，一般不致病。
在机体某些生理、病理因素影响下，内环境改变，机体抵抗力/免疫力降低时，念珠菌就会大量繁殖发展为菌丝型，侵犯组织，达到一定量时，人体就会发病，引起临床症状。
念珠菌属(Candida)在临床标本中有以下几个种：白色念珠菌（C.albicans）、热带念珠菌(C.tropicalis)、克柔氏假丝酵母菌(C.krusei)、光滑念珠菌(C.parapsilosis)、链形念珠菌(C.catenulata)、高里氏念珠菌（C.gulliermondii）、高加索乳念珠菌(C.kefyr) 、郎比念珠菌(mbica)、溶脂念珠菌(C.lipolytica)、葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae)、皱褶念珠菌(C.rugosa)、涎沫念珠菌(C.zeylanoides)，原命名类星形念珠菌（C.stellatoidea）认为是白色念珠菌的生物变种。
临床上以白色念珠菌最常见。
2、程序（Procedure）:2.1、标本采集：根据临床所疾病的不同，可取分泌物、痰、粪、尿、血或脑脊液等标本检验。
2.2、标本接种和培养：血液及体液标本先在肉汤培养基中增菌后转种。
尿、痰、脓性分泌物等可直接接种在血琼脂平板和巧克力平板上。
2.3、鉴定过程：2.3.1取平板上的菌落直接涂片，革兰染色并镜检2.3.2镜下为革兰阳性卵圆型或圆型大孢子，可能见到芽现象2.3.3转种念珠菌显色培养基，及上ATB FUNGUS内药敏板条2.3.4培养48h后，见下图菌落色彩初筛念珠菌属绿色翠绿色（直径约2mm）蓝灰色铁蓝色（直径约1.5mm）粉红色(模糊有微毛菌落较大) （直径约4-5mm）紫色(直径约2mm)白色白色念珠菌热带念珠菌克柔氏假丝酵母菌光滑念珠菌其它念珠菌2.3.5为白色则上API 20 C AUX 作生化鉴定，则按作业指导书《梅里埃半自动细菌鉴定系统操作流程》把生化输入电脑，并按系统提示记录鉴定结果，需补充试验则补充试验。
真菌检验操作生物安全要求
真菌检验操作生物安全要求真菌检验是一项涉及到生命科学和生物安全的重要实验。
在进行真菌检验操作时，实验人员需要遵守一定的生物安全要求，以保障自身安全并避免对环境造成负面影响。
实验人员生物安全要求1. 培训在进行真菌检验操作之前，实验人员应接受培训，掌握真菌实验操作、生物安全基本知识以及应急处理措施。
2. 个人防护实验人员在进行真菌检验操作时，应穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套、口罩等。
更换实验服、洗手、戴好手套等操作时都应注意生物安全。
3. 安全操作实验人员在进行真菌检验操作时，应遵循规范的实验操作流程，如操作要求仔细阅读实验手册，操作前应先确认所需试剂和设备齐全。
4. 废弃物处理实验人员在进行真菌检验操作后，应妥善处置废弃物，并避免将实验室中的废弃物外带，避免对环境造成污染。
实验室生物安全要求1. 实验室设置真菌检验的实验室应配备通风设备、安全柜等设备，保证室内循环空气。
实验室的温度、湿度等也需要严格控制，符合实验要求。
2. 实验室管理实验室管理人员需要对实验人员进行生物安全及实验操作规范知识培训，监督实验人员的操作，保证实验室安全、卫生环境良好。
3. 实验室清洁实验室应每日定期清洁，特别是实验室表面、设备表面、实验台等需要定期清洁、消毒，遵循规范的操作流程。
4. 实验室设备维护实验室里的设备应在定期进行维护，保证设备的完好性，避免操作中出现设备失效等问题，影响实验过程。
总结实验人员在进行真菌检验操作时，应注意生物安全要求，遵循规范的实验操作流程，保障自身安全并避免对环境造成负面影响。
实验室管理人员需要对实验室进行管理，定期进行清洁、维护、培训等，确保实验室环境安全、卫生、稳定。
真菌感染的常规检验方法
真菌感染的常规检验方法真菌的临床实验室检查一般包括标本采集、直接镜检、染色镜检、分离培养、生化反应及免疫学试验等。
以直接镜检和分离培养最重要。
1标本采集不同真菌感染应采用不同的临床标本。
浅部真菌感染可以采集毛发、皮屑、指(趾)甲、痂等，标本在分离前常先用75％的乙醇消毒。
深部真菌感染的检查可取痰、尿液、口腔或阴道分泌物、脑脊液、各种穿刺液和活检组织等。
采集标本时应注意无菌操作。
采集标本后应及时转运至实验室进行检查，一般不超过1～2h，以免标本变质污染。
标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。
2检查方法2.1 直接检查法直接镜检是最简单也是很有价值的实验室诊断方法。
其优点在于简便、快速，无菌部位的阳性结果可直接确定真菌感染。
但是，除了少数真菌外，多数不能确定其种类。
由于阳性率较低，阴性结果亦不能排除诊断，有时需反复检查或做其他方法检查以进一步确定。
直接镜检对于浅表和皮下真菌感染最有帮助。
2.1.1 不染色标本检查取皮屑、毛发、指(趾)甲屑等标本置于载玻片中央，滴加100～200g／L KOH溶液1～2滴，以盖玻片覆盖后在火焰上微微加热，使组织或角质溶解、透明后，先于低倍镜检查有无真菌菌丝或孢子，再以高倍镜检查其特征，可初步诊断真菌感染。
2.1.2 染色标本检查有些真菌如深部真菌需要染色后才能更清楚地观察，常用的染色方法如下。
(1)革兰染色法：多用于白假丝酵母菌、孢子丝菌和新近感染的组织胞浆菌等。
所有真菌均为革兰阳性。
(2)乳酸酚棉蓝染色法：取标本于载玻片上，滴加染液，加上盖玻片后于镜下观察，真菌被染成蓝色。
该法适用于各种真菌的直接检查，培养物涂片检查及小培养标本保存等。
(3)荧光染色法：用0.1％吖啶橙对标本涂片和组织切片进行染色，在荧光显微镜下观察，白假丝酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌为黄绿色，新型隐球菌、鼻孢子菌为红色，组织胞浆菌为红黄色，曲霉菌为绿色。
2.2 分离培养法真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。
皮肤科实验室检查技术操作常规
常见皮肤科实验室检查技术操作常规一．真菌（癣菌）直接镜检【方法】1．取材部位：临床医师采取头癣，体癣，股癣，足癣，甲癣标本。
2．操作方法：将标本置于载玻片上，加一滴5-10%KOH，加盖玻片，在酒精灯火焰上过三次以消化角质蛋白，普通光学显微镜下检查。
【结果判断】可见真菌菌丝和/或孢子，可判断为阳性。
二．毛囊虫（蠕螨）的检查【方法】临床医师采取，在扩张的毛囊口挤压出一点皮脂或用刀片刮出些皮脂，在载玻片加一滴液体石蜡或甘油，加盖片轻压使皮脂变薄，普通光学显微镜下检查。
【结果判断】低倍镜下发现活的毛囊虫，可判断为阳性。
三．疥螨虫镜检【方法】1．取材部位：临床医师采取标本。
2．操作方法：将标本置于载玻片上，加一滴5-10%KOH（或加NS），加盖玻片，在酒精灯火焰上过三次以消化角质蛋白，普通光学显微镜下检查。
【结果判断】见到以下任何一项均可判断为阳性。
1．成虫：低倍镜下看到完整或破碎的成虫。
如用NS，有可能发现活动的成虫。
2．虫卵：可以见到虫体的同时见到成堆或散在的虫卵。
四．头，体，阴虱检查【方法】1．取材部位：临床医师夹取标本。
2．操作方法：将标本置于载玻片上，加一滴NS，加盖玻片，普通光学显微镜下检查。
【结果判断】见到以下任何一项均可判断为阳性。
1．成虫：低倍镜下看到完整或破碎的成虫。
如用NS，有可能发现活动的成虫。
2．虫卵：可以见到虫体的同时见到成堆或散在的虫卵。
五．阴道毛滴虫直接镜检【方法】在载玻片上加一滴温NS，用不涂润滑油的阴道窥器暴露子宫颈，在后穹隆，子宫颈等部位拭取分泌物混入温盐水中，立即在低倍镜下镜检。
或用棉拭子蘸取阴道分泌娶后置于2ml温盐水小瓶中，混匀后取一滴在玻片上镜检。
也可取男性尿道分泌物，前列腺液或尿沉渣同法镜检。
【结果判断】及镜下见到呈波状移动的毛滴虫为阳性。
有时可见到毛滴虫周围的白细胞被推移。
六．念珠菌涂片检查【方法】根据病变部位的不同收集不同的标本。
如果检查体液标本（如尿液或脑脊液）应在离心后去沉淀物。
微生物血培养真菌标本采集及处理标准操作规程
微生物血培养真菌标本采集及处理标准操
作规程
微生物血培养真菌标本采集及处理的标准操作规程如下：
1. 皮肤消毒程序：用消毒液从穿刺点向外画圈消毒，至消毒区域直径达5cm以上，待消毒液挥发干燥后（常需30s以上）穿刺采血。
2. 静脉穿刺和培养瓶接种程序：
用10ml注射器无菌穿刺取血后，排尽针头内空气，勿换针头（如果行第二次穿刺或用头皮针取血时，应换针头）。
采血后直接注入血培养瓶，先注5ml于厌氧培养瓶，并注意避免注入空气，后注其它培养瓶，轻轻混匀以防血液凝固或严格按厂商推荐的方法采血。
3. 采血部位：通常为肘静脉，疑为细菌性心内膜炎时以肘动脉或股动脉采血为宜，切忌在静滴抗菌药物的静脉处采血。
对于成人患者，每次发热时应该分别在两个部位采集血标本以帮助区分是病原菌还是污染菌。
不应从留置静脉或动脉导管取血，因为导管易被固有菌群污染。
4. 采血次数和血量：对于成年患者，应该同时分别在两个部位采集血标本，在两个不同部位分离到同样菌种才能
确定是病原菌。
疑为心内膜炎时，为提高阳性检出率，可酌情不同部位、不同时间，多次采血或动脉采血进行培养。
采血量过少会明显降低阳性率。
5. 血液标本采集后应立即送检，不能及时送检者应置室温暂存，勿放冰箱。
以上步骤完成后，即可将处理好的标本送往实验室进行进一步的检测和分析。
同时，需要注意在整个操作过程中要严格遵守无菌操作规范，以避免污染和误差的产生。
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真菌鉴定操作常规一.标本的采集和处理1. 皮肤、指甲、毛发和组织在收集标本前用75%酒精消毒病变部位。
如果损害处已用了软膏、冷霜或粉剂应事先清洁。
取材应用钝手术刀刮取表皮皮屑，或用透明胶带粘取皮屑直接移至载玻片上，水疱取疱壁组织，脓疱则取脓液。
皮肤粘膜交界处或菲薄的皮肤部位如龟头、大阴唇、口周、肛周等处以浸有生理盐水的湿棉拭子，檫拭局部后送检。
指甲标本应取变色、萎缩或变脆的部位，以钝手术刀刮除表层，采集病甲边缘下病甲置载玻片上，滴封固液，微加热，使甲溶解。
毛发标本应取无光泽、脆而松动，根部折断的毛发。
毛发置载玻片滴加10%KOH溶液，微加热使角质溶解。
组织取病变部位，置无菌生理盐水中送检。
以无菌镊子和剪刀剪碎后进行培养或镜检，避免使用组织研磨器对真菌菌丝的折断及机械性损害皮肤、指甲、毛发和组织标本一般采用直接镜检。
2．眼、耳部标本怀疑真菌性角膜炎时，应在手术显微镜下以眼科小匙刮取溃疡的基底和边缘部位。
怀疑真菌性内眼炎时，应尽可能收集玻璃体液。
结膜标本可用消毒生理盐水浸湿的棉拭子拭取。
耳部标本应从耳道中刮屑取材，也可采用拭子取材。
3．脑脊液标本取3-5ml经腰穿获取的脑脊液标本至无菌管内立即送检。
将标本2500rpm离心15分钟，上清液可用于血清学实验，沉淀部分用于培养和涂片镜检。
4．血液、骨髓标本抽取5－10 毫升血液或骨髓注入需氧菌血培养瓶中，尽快送检。
如血培养仪器报告阳性，及时取样接种于沙氏培养基并涂片革兰染色镜检，如发现真菌孢子电话报告病房并登记。
5．体液（包括胸腔、腹腔及关节腔积液）：将无菌抽取胸水、腹水和关节腔液及时送检。
标本放无菌离心管中，2500rpm离心10分钟，取沉渣培养或涂片镜检。
6．尿液将清洗外阴后留取的中段尿，或经导尿管导出的中段尿，或经皮膀胱穿刺尿立即送检。
尿标本应先2500rpm离心10分钟，取沉淀部分进行培养及涂片镜检。
7．阴道分泌物或男性尿道标本女性由妇科医师用窥器取阴道或宫颈的伪膜或豆渣样凝块。
男性则以尿道拭子伸入尿道2.5cm处旋转取出尽可能多的尿道脱落细胞及分泌物，立即送检。
8．呼吸道标本（咳出痰、诱导痰、气管吸痰、支气管肺泡灌洗液、肺组织）取清晨新鲜咳出的痰，如病人不能咳痰，可用支气管盐水诱导咳痰，插管病人采用气管吸出痰，必要时在纤维支气管镜检的同时获取支气管肺泡灌洗液或支气管毛刷标本。
对于局灶性肺部病变，高度怀疑肺部真菌感染的患者可经皮穿刺，在影像学指导下获取病变部位的肺组织。
9．脓液或溃疡、窦道、瘘管等标本用75%酒精消毒病变部位后刮取脓液，窦道壁及周围尽可能深的部位，若脓肿未破，应以无菌注射器抽出脓液送检。
注意寻找并收集脓液中或窦道开口部位的颗粒送检。
10．大便留取新鲜大便，尽快送检。
收到标本后，应根据申请项目将检验信息录入计算机并获取检验号记录在申请单上二、真菌的显微镜检查：1．直接检查：将待检标本（皮肤、甲屑、毛发或组织）置载玻片上，加一滴载液（根据不同需要选用相应载液），盖上盖玻片，放置片刻或在火焰上快速通过2-3次（不可煮沸），轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用吸纸吸去周围溢液，置显微镜下镜检。
检查时先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察菌丝和孢子的形态、特征、位置、大小和排列。
结果报告依据镜下情况报：“找到真菌孢子”或者“找到真菌菌丝”或者“找到真菌菌丝及孢子”。
如未找到真菌孢子及菌丝报告“未找到真菌”。
注意：毛发标本不可过度施压以免破坏毛发的结构而影响对菌丝孢子与毛干相对位置关系的判断。
载液：①生理盐水：用于稀释标本；②KOH液：可溶解角蛋白并能清除标本中的脓细胞及其他成分而不破坏菌丝和孢子。
一般采用10%-20%溶液。
甲屑、毛发等角质厚的标本可用20%溶液；③乳酸酚棉蓝染色液：可使真菌染成蓝色，镜下易于分辨。
丝状真菌直接镜检也使用此载液。
2．涂片染色镜检：将标本或菌液均匀涂于载玻片上（必要时加生理盐水或KOH液），火焰固定，革兰氏染色（或其他特殊染色），镜检。
如发现真菌报“找到（圆形或卵圆形）真菌孢子（及假菌丝）”。
如未找到真菌孢子及假菌丝报告“未找到真菌”。
3．墨汁涂片：用于检查新型隐球菌和其他有荚膜的真菌孢子。
以优质绘图用黑墨汁少许置载玻片上，加脑脊液沉渣，加盖玻片。
稍待2-3分钟，用显微镜先低倍再高倍镜检查；如发现带荚膜真菌孢子，报告“找到隐球菌”。
如未找到带荚膜真菌孢子报告“未找到隐球菌”。
三、真菌的分离培养：病原真菌除鼻孢子菌和链状芽生菌外，大多数都可人工培养。
1．平板培养法：分区划线：呼吸道、脓、血液、体液等标本使用此法培养。
用接种环挑取适量标本，在沙氏培养基上分区划线，一般分2-3区。
置25℃培养，有真菌生长及时鉴定，5天无菌生长报告“真菌培养未生长”。
2．试管培养法：①直接种植：皮肤、指甲、毛发和组织使用此法培养。
用无菌镊子夹取待检标本点种在2根沙氏斜面上，可等距离点种几块标本。
置25℃和37℃培养，有真菌生长及时鉴定，14天无菌生长报告“真菌培养未生长”。
②脑脊液离心后的脑脊液用接种环接种2根沙氏斜面上，分别置25℃和37℃。
有真菌生及时鉴定，14天无菌生长报告“真菌培养未生长”。
在沙氏琼脂斜面上菌落初为白色、奶油状，时间长颜色渐变为淡褐色。
有的菌株有粘液化趋势，甚至似鼻涕样流向直立的斜面下部。
培养物墨汁涂片，不易见荚膜，即使有荚膜也较小。
注意：标本应至少接种2支沙氏琼脂斜面，分置于25℃及37℃培养，每天观察，经2周不长方可报告阴性。
新型隐球菌在上述两种温度下皆可生长，某些非致病隐球菌只在25℃或30℃生长，却不能在37℃生长。
但初代培养在25℃生长而于37℃不长者，并不能排除该菌是新型隐球菌。
隐球菌生长快慢不一，有的2-3天就开始长出小菌落，而有些则需2-3周才见生长。
特别是经过抗真菌治疗的病人，标本虽直接镜检阳性，但培养可能为阴性。
3．玻片培养法（小培养）：①取无菌平皿倒入适量溶化的培养基（厚约1mm），凝固后以无菌刀片划成1cm2大小的小块。
取一小块移在无菌载片上，在小块四周接种待鉴定的菌株，盖上消毒的盖片。
放入无菌平皿中的V形玻棒上，底部铺上无菌滤纸，滤纸以无菌蒸馏水湿润（也可用无菌湿棉球替代滤纸保湿）。
将平皿置温箱培养。
也可以在无菌载片上均匀地浇上溶化的培养基，凝固后接种待鉴定菌株，盖无菌盖片，其余同上。
②待菌落生长后，取出载片直接镜检。
也可揭下盖片加95%酒精脱水，干后滴PV A乳酸酚棉蓝液封固，镜检。
四、酵母样真菌的鉴定酵母样真菌是以芽殖为主的单细胞真菌，菌落平滑、湿润，乳酪样或薄膜样，无毛样气生菌丝。
其中主要致病菌见于念珠菌属、隐球菌属、球拟酵母属、酵母属和丝孢酵母属。
按是否具有有性繁殖过程及有性孢子产生的方式、特点、形状和数目，酵母菌可归为3类：1.子囊菌亚门(Ascomycotina)：可产生子囊孢子，如酵母属、汉逊酵母属、裂殖酵母属；2.担子菌亚门(Basidiomycotina):可产生冬孢子或掷孢子，如冬孢酵母属、掷孢酵母属等；3.半知菌类(Derteromycotina)：尚未发现有性期，如念珠菌属、隐球菌属、红酵母属、球拟酵母属、丝孢酵母属等。
（一）念珠菌属（Candida）的鉴定：1. 涂片检查革兰染色镜检可见圆形或卵圆形芽生孢子，一般为念珠菌。
亦有从孢子的芽延长而成假菌丝者。
有大量假菌丝存在说明念珠菌处于生长活跃状态。
大小约3-7×3-14μm不等，单个、成堆或呈短链排列。
孢子及菌丝皆为革兰阳性，呈紫色。
但有时着色不均，有时少数呈革兰阴性。
可报告“找到（圆形或卵圆形）真菌孢子（及假菌丝）”。
2．分离培养沙氏平板或斜面以及中国蓝平板上有酵母样菌落长出后，采用以下方法鉴定：①形态学方法：接种显色培养基（37℃培养）和玉米粉-吐温80培养基（25℃培养），根据菌落形态、显色特征和假菌丝特征鉴定菌种。
其中，显色培养上生长绿色菌落为白色念珠菌，蓝色菌落为热带念珠菌，粉红干燥菌落为克柔念珠菌，紫色小菌落为光滑念珠菌。
②生化方法：形态学无法鉴定的菌种可使用Vitek YST鉴定卡以及API 20C生化鉴定系统鉴定。
操作方法见该产品使用说明书。
（二）隐球菌属（Cryptococcus）的鉴定：隐球菌较念珠菌少见，但由新型隐球菌引起的脑膜炎却是一种严重的疾病。
该菌存在于鸽粪、土壤、腐烂的水果中，亦见于动物和人体。
主要侵犯中枢神经系统，也可以侵及肺、骨、皮肤，甚至引起败血症。
其他隐球菌也可引起严重的临床感染。
1. 镜下特征：①直接镜检：标本一般为脑脊液、痰或其他分泌物。
镜下可见圆形5-12-20μm直径之厚壁芽生孢子，一般少有假菌丝；②革兰染色：为革兰阳性圆形芽生真菌孢子。
注意勿将其误作染料小滴。
③墨汁染色：如有新型隐球菌，在黑色背景下可见圆形孢子，其周围绕以透光的厚荚膜，厚度可与菌体直径相当。
菌体的大小和荚膜的宽窄在同一张片子上可有较大不同。
有时可看到出芽的孢子。
注意切勿将淋巴细胞误认为新型隐球菌。
新型隐球菌在墨汁涂片中的形态可归纳为：●圆形或卵圆形的孢子，胞壁厚，边缘清晰，用微调节观察似有双圈；●孢子周围有透亮的厚荚膜，孢子与荚膜之间的界限和荚膜的外缘都非常整齐、清楚；●孢子内有反光颗粒；●有的孢子有芽生出，且芽颈甚细。
注意：任何圆形物体边缘模糊，内部无反光颗粒，外部有较窄、内外界线不清的透亮环者，不是隐球菌。
但应注意新型隐球菌以外的其他隐球菌也有荚膜。
2. 生化鉴定：使用Vitek YST鉴定卡以及API 20C生化鉴定系统，方法见相应产品使用说明书。
隐球菌对糖无发酵能力，菌种鉴定依赖于同化试验及其他生化反应。
其中尿素酶阳性，而常见念珠菌中绝大多数为阴性，仅解脂念珠菌和部分克柔念珠菌尿素酶阳性。
隐球菌中仅新型隐球菌酚氧化酶试验阳性，其他隐球菌阴性。
常见隐球菌的生化特性见表3。
（三）其他酵母菌的鉴定：尽管临床标本中分离出的致病酵母菌主要是念珠菌属及新型隐球菌，但其他酵母菌也可引起严重感染。
如丝孢酵母属、球拟酵母属、汉逊酵母属、红酵母属、毕赤酵母属等。
如标本取自正常无菌部位（如血液、胸腹水等）应根据其形态学特征或者使用Vitek YST鉴定卡鉴定到种。
鉴定步骤见表1、表2及表3。
表1.不常见酵母菌鉴定程序表纯培养1%Tween80玉米粉琼脂(25℃)(芽管及厚膜胞子(－)（＋）(＋)(－)隐球菌属酚氧化酶37℃生长(＋) (－) (－) (＋)其白丝地红新其球酵汉他念孢霉酵型他拟母逊念珠酵菌母隐隐酵属酵珠菌母属属球球母母菌属菌菌属属表2．临床可见到的酵母菌各属特性R：极偶见发育不全的形态；NSG：无表面生长。
表3.临床标本中常见酵母菌生化反应五、酵母菌的药敏试验（纸片扩散法）1．美蓝储存液：0.1g美蓝加入20ml无菌水2．培养基：含2％葡萄糖和0.5µg/ml美蓝的M-H琼脂在1000mlM-H琼脂中，加入100µl美蓝储存液和20g葡萄糖，121℃15分钟高压灭菌，水浴55℃倒4mm厚平板备用。