Lowry法蛋白浓度测定试剂盒使用说明
Lowry氏法测定蛋白质含量
使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原，生成 钼蓝-钨蓝蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白 质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓 度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样 品中蛋白质含量。（还原反应）
操作步骤
1.取三支试管分两组，按下表操作
试管编号
01
2
牛血清白蛋白标准
-- 1.0 --
分光光度计使用前需预热，绝对调零和空白管调 --
--
待测蛋白质溶液(mL)
-- --
1.0
2. 各管加入试剂甲5ml混匀放置10分钟。 3.各管加入试剂乙0.5ml后立即混匀，37℃ 水浴30分钟后用500nm单色光比色测定。 4.计算 样品蛋白质含量（ug/ml）
结果与计算：
根据测定管光密度值计算血清蛋白质 含量，C测=A测*C标/C测
注意事项：
各管加酚试剂时必须快速，并立即摇匀，不应出现
混浊。
移液管使用前要看清楚刻度和是否写着快、吹，如
有则需要用洗耳球吹出剩余液体
进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因
为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只 在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性 的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼 酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。
Lowry氏法测定蛋白质含量
The Lowry Method for Protein Quantitation
目的与要求：
掌握Lowry氏法测定蛋白质含量的
原理及方法；
掌握分光光度法
实验原理：
在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯
合，形成蛋白质-铜复合物。（双缩脲反 应 Biuret Reaction）
Lowry’s法(Folin-酚试剂法)
血清蛋白浓度(μg/ml)=样品蛋白质浓度×2×300
本方法的特点：
优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。 2.操作简单，不需特殊仪器设备。
缺点：1.费时间较长，要精确控制操作时间 2.标准曲线也不是严格的直线形式 3.专一性较差，干扰物质较多。
– 水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。
数据处理
各管A值
测定次数
2
3
4
5
6
1
2
3
各管平均A值
绘制标准曲线
以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度 为横坐标，绘制标准曲线。
吸光度A
0.6
.
0.4
.
.
0.2
.
蛋白质浓度C（μg/ml）
计算
根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准 曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。
40
0.60 2.0
80
0.40 2.0
120
0.20 2.0
160
0.50 0.50 2.0
未知
各管混匀，室温放置10min。 向各管内加入Folin-酚试剂0.20mL, 2s内迅速混匀！ 40℃放置10min。 冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。
注意事项
复习思考题
1、试述Folin-酚试剂法的优点？ 2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应
如何注意？
请将答案附在实验报告上！
Lowry’s法（Folin-酚试剂法） 测定蛋白质含量
Determination of protein content by Lowry‘s method
Lowry法蛋白含量检测试剂盒
Lowry法蛋⽩含量检测试剂盒Lowry法蛋⽩含量检测试剂盒（1000T）-南京森贝伽⽣物提供⼀、试剂盒说明蛋⽩质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋⽩质⼀铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产⽣蓝⾊化合物，在⼀定条件下，利⽤蓝⾊深浅与蛋⽩质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋⽩质的浓度。
Lowry法测定较为不受脂类物质⼲扰，适于脂类含量较⾼的样品测定，也能耐受相当浓度的去垢剂如SDS。
本试剂盒可进⾏1000次1mL⽐⾊杯测定。
⼆、试剂盒组份组份1000T 储存蛋⽩质标准溶液（2.5mg/mL BSA）10mL -20℃5×Buffer A-1 100mL 室温5×Buffer A-2 100mL 室温Buffer B-1 10mL 室温Buffer B-2 10mL 室温Folin-酚试剂（1N）100mL 室温避光注意事项：①1×Buffer A⼯作液配制：⽤前将5×Buffer A-1、5×Buffer A-2（如储存温度较低，可能有结晶析出，可370C⽔浴加热溶解）⽤蒸馏⽔稀释5倍后等体积混合即得1×Buffer A⼯作液；②BufferB⼯作液配制：⽤前将Buffer B-1 与Buffer B-2等体积混合即得BufferB⼯作液；③碱性铜试剂⼯作液配制： 1× Buffer A⼯作液、BufferB⼯作液按50：1⽐例混合，即为碱性铜试剂⼯作液。
该⼯作液须在24hr内使⽤，过期失效。
④蛋⽩质标准⼯作液（0.25mg/mL）配制：蛋⽩质标准溶液（2.5mg/mL BSA）⽤前⽤蒸馏⽔稀释10倍⾄蛋⽩质标准⼯作液（0.25mg/mL）。
⑤还原物质、酚类物质对此反应有⼲扰。
⑥如染料吸附到⽐⾊杯上，可⽤甲醇清洗。
三、操作步骤1．标准曲线的绘制：取6个带盖的1.5 mL离⼼管，编好号后，按下表顺序加⼊试剂：管号0 1 2 3 4 50 40 80 120 160 200蛋⽩质标准⼯作液（0.25mg/ml）（µl）蒸馏⽔（µl）200 160 120 80 40 0碱性铜试剂⼯作液（µl）1000 1000 1000 1000 1000 1000每管加后⽴即混匀，置20～250C⽔浴保温10分钟1N Folin-酚试剂（µl）100 100 100 100 100 100蛋⽩质含量（µg/µl）0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25具体步骤：1. 如染料吸附到⽐⾊杯上，可⽤甲醇清洗。
改良Lowry氏法测定蛋白质含量
改良Lowry氏法测定蛋白质含量[原理]蛋白质分子中含有带酚基的酪氨酸，在碱性条件下其肽链与Cu2+ 螯合，形成蛋白质-铜复合物，此复合物中酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原，生成蓝色化合物（钼蓝和钨蓝混合物）。
蓝色深浅与蛋白质含量成正比的关系可绘制标准曲线，测出样品中蛋白质的含量。
[试剂]1．蛋白质标准溶液（0.16mg/L）：取80g/L牛血清白蛋白作500倍稀释。
取已标定的牛血清白蛋白8mg，用0.9%NaCl稀释至50ml。
2．碱性铜溶液：甲液：取Na2CO32g溶于0.1mol/L NaOH100ml中。
乙液：取CuSO4·5H2O 0.5g溶于1%酒石酸钾100ml中。
取甲液50ml、乙液1ml混合，此液需临用前配制。
3．酚试剂：取Na2WO4·2H2O 100g和Na2MoO4·2H2O 25g溶于蒸馏水700ml中，再加85% H3PO4 50ml和浓HCl 100ml充分混匀后，置1500ml圆底烧瓶中温和地回流10小时。
冷却，取下冷凝装置，加入硫酸锂（Li2SO4·H2O）150g，蒸馏水50ml及溴水数滴。
再煮沸15分钟以除去多余的溴。
因溴气甚毒，这一步骤应在通风橱中进行。
冷却后稀释至1000ml，然后过滤，溶液呈黄色或金黄色（如带绿色则不能用）。
贮于棕色试剂瓶中，临用前，取酚试剂5.0ml，加蒸馏水约50ml，以酚酞为指示剂，以1mol/L NaOH溶液进行滴定，求出酚试剂的当量浓度。
然后根据此浓度，将酚试剂用蒸馏水稀释成1mol/L。
4. 0.9% NaCl：[主要器材]1．50ml容量瓶2．721型分光光度计[操作步骤]1．取试管6支分别编号，按表12操作：表12试剂（ml）管号 0 1 2 3 4 测定管蛋白质标准溶液（0.16mg/ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 —0.9%NaCl 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 —待测血清（1：1000） — — — — — 1.0 碱性铜溶液 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀后，室温放置15分钟。
蛋白质检测(Lowry)--方法学验证
Lowry法检测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
1实验目的1.1 确保Lowry法的准确、可重复并耐用，为建立检验操作程序提供依据。
2材料与仪器2.1 待测样品：蛋白纯化后样品2.2 实验试剂100μg /ml蛋白质标准液的制备：取20.5mg BSA蛋白标准品（中检所），加入注射水 2.05ml溶解，即为10mg/ml的蛋白标储备液；在精密量取储备液液0.50ml置50ml容量瓶中，用纯化水定容至刻度线，摇匀，即为100μg/ml的标准蛋白工作液。
4%碳酸钠溶液：准确称取碳酸钠4.00g，在容量瓶中定容至100ml。
0.8%氢氧化钠溶液：准确称取氢氧化钠0.80g，在容量瓶中定容至100ml。
0.1mol/L酒石酸钾溶液：准确称取酒石酸钾2.36g，在容量瓶中定容至100ml。
0.04mol/L硫酸铜溶液：准确称取硫酸铜1.00g，在容量瓶中定容至100ml。
酚试剂：取自质检部2.3 仪器：紫外分光光度计、移液器2.4 器具：移液管、试管架、一次性吸头、卷纸3实验步骤3.1 按照下表平行配置两份蛋白质标准品溶液：3.2碱性铜溶液配制：按4%碳酸钠溶液：0.8%氢氧化钠溶液：0.1mol/L酒石酸钾溶液：0.04mol/L硫酸铜溶液=50:50:1:1的体积比进行配液（现用现配）；3.3 酚试剂：使用前，用纯水按体积比1:1稀释。
3.4取待测样品稀释至蛋白浓度在50ug/ml左右，取两支试管中，每管加入1ml 待测样品；3.5 在向每支试管中加入5.0ml的碱性铜溶液，混匀，静置10min；3.6 向每支试管中快速加0.5ml的酚试剂，混匀，室温静置30min；3.7 使用紫外分光光度计测量每管溶液在波长650nm处的吸光度。
2010版药典lowry法测定蛋白含量的方法
第二法，Lowry法------摘自2010版药典本法用于微量蛋白质的含量测定。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质的含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
试剂（1）酚试剂称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MnO4·2H2O）25g,置1500ml 蒸馏瓶中，加入700ml水、85%磷酸50ml、盐酸100ml，上连回流管（使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞）微沸回流10 小时。
取下回流管，加入硫酸锂150g、水50 ml、溴液几滴，煮沸约15分钟，驱除过量的溴。
冷却，加水至1000ml，过滤，为酚试剂储备液。
酚试剂储备液用氢氧化钠滴定液（0.5mol/L）测定酸浓度，然后加水稀释至相当于1mol/L沿酸浓度。
（2）碱性铜溶液量取0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L硫酸铜溶液各0.5ml，4%碳酸钠溶液与0.8%氢氧化钠溶液各25ml，摇匀，即得。
本液临用配制。
（3）氢氧化钠滴定液（0.5mol/L）的配制及标定去氢氧化钠适量，加水搅拌使溶解成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静置数日，澄清后，量取澄清的氢氧化钠饱和溶液28ml，加新煮沸后的冷却水，使成1000ml，摇匀。
取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g，精密称定，加新煮沸过的冷水50ml，振摇，使其尽量溶解；加酚酞指示剂2滴，用本液滴定；在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。
每1ml氢氧化钠滴定液相当于102.1mg的邻苯二甲酸氢钾。
根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。
标准蛋白溶液的制备用水将蛋白标准品定量稀释至每1ml含1mg，作为储备液。
精密量取储备液2.5ml置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为每1ml含100µg 的标准蛋白质溶液。
改良Lowry法蛋白定量试剂盒
仅供科研版本号：170322改良Lowry法蛋白定量试剂盒【产品组成】【保存条件】室温,避光,6个月【产品概述】目前世界上最常用的蛋白浓度检测方法是：BCA蛋白定量试剂盒(BCA ProteinAssay Kit)和Bradford 蛋白定量试剂盒(Bradford Protein Assay Kit)。
改良Lowry法蛋白定量试剂盒是利用蛋白中肽键与铜离子结合成四配位基铜离子复合物，后者与Folin试剂(福林酚)反应，产生蓝色比色物，用分光光度法(酶标仪或分光光度计)检测750nm处吸光度，并与标准曲线比较，求得待测蛋白样品的浓度，在1～1500μg/ml浓度范围内有较好的线性关系。
【使用方法】1、取1ml蛋白标准配制液加入到蛋白标准(BSA)(20mg)中，充分溶解后配制成20mg/ml的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，溶解后的蛋白标准溶液应-20℃保存。
2、取适量20mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为1500μg/ml或所需浓度。
如取75μl20mg/ml蛋白标准，加入925μl稀释液，充分混匀，即配制1500μg/ml蛋白标准。
特别提示：待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中。
例如待测蛋白溶解于蔗糖中，亦取20mg/ml蛋白标准溶解于蔗糖中。
一般也可以用0.9%NaCl或PBS作为溶解BSA稀释液。
稀释后的1500μg/ml蛋白标准也应-20℃长期保存。
3、根据样品数量，按Folin-CiocalteuReagent:ddH2O=1：1的比例配制Folin-Ciocalteu工作液，充分混匀。
4、根据样品数量，按试剂(B1):试剂(B2):试剂(B3)=50:1:1的比例配制改良Lowry Reagent工作液，充分混匀。
例如取10mlLowryA、0.2mlLowryB、0.2mlLowryC，配制成10.4ml改良Lowry Reagent工作液。
5、将1500μg/ml蛋白标准用稀释待测样品的溶液5倍梯度稀释，浓度分别为300μg/ml、60μg/ml、12μg/ml、2.4μg/ml、0μg/ml，各取40μl加到96孔板的标准品孔。
稳定型Lowry法蛋白浓度测定试剂盒
稳定型Lowry法蛋白浓度测定试剂盒说明书修订日期：2016.03.02 Cat Number：KGSK4051Store at2-8℃for6months，避光For Research Use Only（科研专用）一、产品简介在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物。
此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。
此法灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5-100µg/mL蛋白质。
经典的Lowry法的主要缺点是由Reagent A和B按照一定比例配置成的碱性铜试剂（Reagent C）不稳定,需要当天配制，经典的Lowry法产生的颜色稳定性也不高，在反应20-120min内变化9.2%。
本试剂盒采用一种改进的即用型稳定的碱性铜试剂代替经典Lowry法的Reagent A；B；C，使得实验操作更加的简单便捷，反应产生的蓝色复合物能够稳定存在至少2小时。
而且该稳定型碱性铜试剂在4度，避光的条件下可稳定保存至少6个月以上，实验制得的标准曲线与经典方法基本吻合。
用酶标板使用1000次或分光光度法100次。
二、产品特点1．即用型而且稳定的碱性铜试剂，使用更加方便。
2．有离心管法和酶标板法两种定量方法。
3．蛋白质浓度的线性范围在5-100µg/mL。
4．高的灵敏性保证了低蛋白质浓度样品的精确定量。
三、试剂组份本试剂盒由稳定型碱性铜试剂、Folin-酚试剂和BSA蛋白质标准液（1mg/mL）构成，可以用酶标板使用1000次或分光光度法100次。
组份名称规格保存温度稳定型碱性铜试剂100mL2-8℃，避光1N Folin-酚试剂10mL1mg/mL BSA蛋白标准品5mL-20℃注：BSA蛋白质标准液-20℃保存，其余试剂2-8℃避光保存，稳定型碱性铜试剂用铝薄包被，保质期半年。
四、使用方法1、制作BSA蛋白的浓度梯度1．1取8支1.5mL离心管，按照下表的比例分别加入各溶液。
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Folin 酚乙 200ul 200ul 200ul 200ul 200ul 200ul
试剂
200ul
200ul
200ul
R0050 核蛋白抽提试剂盒
P1015 4× 蛋白上样缓冲液（含 DTT ）
P1300 SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒
D1060 10× 电泳转移缓冲液
PE0010 ECL Plus 荧光检测试剂 (ECL 超敏发光液 )
离心管号 1 标准蛋
0 白 BSA
7（样品 8（样品 9（样品
2
3
4
5
6
管 1） 管 2） 管 3）
200ul 适 200ul
当稀 适当稀 40ul 80ul 120ul 160ul 200ul
释的样 释的样
……
品1
品2
PBS
200ul 160ul 120ul 80ul 40ul 0
0
0
0
Folin 酚甲
2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml
2ml
2ml
2ml
试剂
混匀，室温放置 10 分钟
Lowry 法蛋白浓度测定试剂盒使用说明 货号 ：PC0030 规格 ：1000T(微孔) 保存 ：BSA 蛋白标准品 4℃保存有效期至少 3 个月，-20℃保存有效期至少一年，其 他试剂室温保存有效期至少一年。试剂开封使用后请及时密闭保存，Folin 酚乙试剂颜色变 成深绿色即失效。 产品组成 ：
Folin 酚乙试剂(1N) 20ml
PBS l ) 1ml
PC0010 Bradford 法蛋白浓度测定试剂盒
R0010 高效 RIPA 组织 / 细胞快速裂解液
PR1600 预染低分子量蛋白 MARKER
Folin 酚甲试剂 A Folin 酚甲试剂 B Folin 酚乙试剂(1N)
PBS 稀释液 BSA 蛋白标准品 (5mg/ml )
100ml×2 5ml 20ml 30ml 1ml
产品简介 ：
Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质铜络合物；第二步是此络合物将 Folin 试剂还原， 产生深蓝色， 颜色深浅与蛋白质含量 成正比。 定量范围为 5～100µg/ml 蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱 氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质 因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。
操作说明 ：
1.根据需要量，取适量 Folin 酚甲试剂 A 和 B 按 50:1 混合，混合后有效期为 24 小 时，过期失效。
2.根据需要量，取适量 BSA 标准品用 PBS 稀释稀释 10 倍至浓度 0.5mg/ml。 若采用酶标仪法(96 孔) 3.将标准品按 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20ul 加到 96 孔板中，加 PBS 补足到 20ul。 4.将样品作适当稀释(最好多做几个梯度)，加 20ul 到 96 孔板的样品孔中。由于移液 器在取小量时的误差，标准线前面的点误差比较大，所以尽可能的让样品点落在标准线 1/2 后。 5.将配好的 Folin 酚甲试剂每孔加入 200ul，轻轻震动，混匀，室温放置 10 分钟。 6.各孔加入 20 微升 Folin 酚乙试剂，迅速混匀，37℃放置 30 分钟。用酶标仪测定 A650 计算蛋白浓度。 若采用分光光度计法（接上述步骤 2） 3.取八支（或者更多）5ml 离心管，标号，按 下表加入试剂。 4.混匀，37℃放置 30 分钟。分光光度计测定 A650 计算蛋白浓度。 相关试剂 ： PC0001 BSA 标准品（ 5mg/ml ） PC0015 5×G250( 蛋白定量用 ) PC0021 BCA 试剂 PC0020 BCA 法蛋白浓度测定试剂盒 Folin 酚甲试剂 A 100ml×2 Folin 酚甲试剂 B 5ml