手把手教你做PCR引物设计 来自小木虫
PCR引物设计详细步骤
PCR引物设计详细步骤引言PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中常用的技术，用于放大DNA片段。
在PCR过程中，引物的选择非常重要，因为引物的设计质量直接影响到PCR反应的效率和准确性。
本文将详细介绍PCR引物设计的步骤。
步骤1. 确定目标序列首先，需要确定所要放大的目标序列。
这可以是任何你感兴趣的DNA片段，如某个基因的编码区域，特定的DNA序列等。
2. 提取目标序列从已有的DNA样本中提取目标序列。
可以通过DNA提取试剂盒等方法进行提取，确保获得纯净的DNA。
3. 序列比对使用BLAST等工具将目标序列与已知的序列数据库进行比对，以确认目标序列的唯一性和可能存在的变异。
4. 引物设计原则根据目标序列，设计符合以下原则的引物：•引物长度通常在18-25个碱基对之间。
•碱基组成均匀，避免引物中存在大量的G或C碱基，以及连续多个重复的碱基。
•引物之间的互补性尽量避免，以防止二聚体的形成。
•避免引物末端存在碱基的互补序列，以防止非特异性扩增。
5. 引物设计工具使用引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST等，在目标序列中选择合适的引物。
这些工具可以根据给定的参数，自动设计合适的引物。
6. 引物评估对设计的引物进行评估，包括检查引物的反向互补性、引物的Tm值（熔解温度）、引物的二聚体和自身结构等。
确保引物的质量达到实验要求。
7. 引物合成将设计好的引物发送给合成公司进行合成。
确保引物的纯度和浓度符合要求。
8. PCR反应使用合成的引物进行PCR反应，按照标准的PCR反应体系和条件进行。
根据实验需求调整PCR反应的温度、时间等参数。
9. PCR产物验证通过凝胶电泳等方法验证PCR反应产物的大小和纯度。
确保PCR反应成功，并且没有非特异扩增的产物。
结论PCR引物设计是PCR反应成功的关键。
通过遵循引物设计的原则，结合引物设计工具的辅助，可以设计出合适的引物，弥补PCR技术在DNA放大中的巨大优势，为实验研究提供有效的工具。
PCR引物设计
PCR引物设计PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR引物的设计对PCR反应的成功与否至关重要。
下面将详细介绍PCR引物的设计过程。
第一步，选择目标序列。
在设计PCR引物之前，首先需要确定要扩增的目标序列。
目标序列可以来自已知基因的特定片段，也可以通过测序等方法获得。
第二步，引物长度和温度。
PCR引物通常为单链DNA片段，一般长度在18-30个碱基对之间。
引物长度过短容易引起非特异性扩增，引物长度过长则会导致特异性降低。
此外，引物的长度还会影响PCR反应的温度。
一般情况下，引物的长度越长，PCR反应的温度就需要越高。
通常，引物的长度最好在20-24个碱基对之间。
第三步，引物序列的选择。
为了确保PCR反应的特异性，引物的选择至关重要。
引物应具有与目标序列完全互补的碱基序列，以确保引物能够精确结合到目标序列上。
此外，引物的序列还应避免序列内部的反向重复和结合位点之间的重复序列。
第四步，引物的熔解温度（Tm）的确定。
引物的熔解温度是引物与模板DNA结合的温度。
引物的熔解温度应该尽量接近反应的最低温度，以确保引物能够与目标序列特异性结合。
引物的Tm可以通过以下公式计算：Tm = 69.3 + 0.41 * (G+C%) - 650/length其中G+C%表示引物中鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的百分含量，length表示引物的长度。
第五步，特异性分析。
在设计引物之前，可以通过生物信息学工具对引物进行特异性分析。
特异性分析可以通过引物序列与目标序列的比对来进行。
引物在目标序列上应有唯一的结合位点，并且不应该与其他非目标序列有任何重复的位点。
第六步，引物的杂交性能。
为了确保引物的杂交性能，引物应具有适当的糖尖端修饰和杂交性能。
糖尖端修饰可以增强引物的杂交性能，并减少非特异性结合。
此外，引物的GC含量应该适中，过高或过低都可能导致非特异性结合的问题。
第七步，引物的交叉反应。
Primer 5 设计PCR引物的步骤
打开软件
复制基因序列
粘贴
选项AS is- OK
点击primer 按钮，弹出菜单后点击search按钮
选择 PCR primer，Pairs 参数，并选择所需PCR产物长度，OK
会弹出搜索结果菜单，点击OK
在搜索出的结果列表里选择TM合适、GC含量高、无各种BUG的引物，点击edit primer，将所得引物复制
设计引物打开软件复制基因序列粘贴选项asok点击primer按钮弹出菜单后点击search按钮选择pcrprimerpairs参数并选择所需pcr产物长度ok会弹出搜索结果菜单点击ok在搜索出的结果列表里选择tm合适gc含量高无各种bug的引物点击editprimer将所得引物复制而后点击sa按钮并继续点击editprimer复制反向引物引物设计达成
而后点击S/A按钮，并继续点击edit primer，复制反向引物，引物设计达成。
（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全的好评与关注）
如何设计PCR扩增引物
如何设计PCR扩增引物1.找出这种细胞物种的PTN全长核苷酸序列2.采⽤primer premier 5.0软件设计引物设计应注意如下要点：● 1. 引物的长度⼀般为15-30 bp，常⽤的是18-27 bp，但不应⼤于38，因为过长会导致其延伸温度⼤于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进⾏反应[2]。
● 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较⾼，尤其是3’端相似性较⾼的序列，否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
● 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较⼤的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显⾼于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使⽤碱基A[3][4]。
另外，引物⼆聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。
5’端序列对PCR影响不太⼤，因此常⽤来引进修饰位点或标记物[2]。
● 4. 引物序列的GC含量⼀般为40-60%，过⾼或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太⼤[2][5]。
● 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种⽅法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使⽤的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。
● 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的⾃由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选⽤3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），⽽5’端和中间ΔG值相对较⾼的引物。
引物的3’端的ΔG值过⾼，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。
●7. 引物⼆聚体及发夹结构的能值过⾼（超过4.5kcal/mol）易导致产⽣引物⼆聚体带，并且降低引物有效浓度⽽使PCR反应不能正常进⾏[8]。
●8. 对引物的修饰⼀般是在5’端增加酶切位点，应根据下⼀步实验中要插⼊PCR产物的载体的相应序列⽽确定。
PCR引物设计技巧
PCR引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，用于扩增目标DNA序列。
PCR的成功与否，很大程度上依赖于引物的设计质量。
一个好的PCR引物设计可以确保反应的特异性、有效性和稳定性。
以下是一些PCR引物设计的技巧。
1.引物长度和GC含量：一般而言，引物长度应在18-24个碱基之间。
引物的GC含量应在40-60%左右。
过低的GC含量可能导致反应特异性不足，而过高的GC含量可能导致引物相互结合和非特异性扩增。
2.引物序列选择：引物序列应选择在目标序列上具有一定变异性的区域。
引物的序列不应包含重复序列、自身互补序列或多聚性序列，以免导致引物间的相互结合或非特异性扩增。
3.引物特异性检测：在设计引物时，应进行引物特异性的检测。
可以使用生物信息学工具，如BLAST，检查引物序列是否与其他非目标序列有任何匹配。
特别是在设计引物用于复杂的基因组中时，应特别关注引物的特异性。
4. 引物互补性检测：在进行引物设计时，应检查引物之间的互补性。
引物之间的互补性可能导致引物相互结合，影响扩增效率和特异性。
可以使用生物信息学工具，如OligoAnalyzer，检查引物之间的互补性。
5.引物长度和跨越剪切位点：在设计用于检测RNA的引物时，应特别注意引物的长度和是否跨越了剪切位点。
过长的引物可能跨越剪切位点导致扩增产物的长度不一致，降低扩增特异性。
6.引物末端修饰：PCR引物的末端可以根据需要进行一些修饰，如磷酸化、生物素化、荧光标记等。
这些修饰可以用于后续的检测和分离。
7.引物浓度和混合物：在PCR反应中，引物的浓度对反应的成功与否至关重要。
一般而言，两个引物的浓度应保持一致。
此外，在进行多重PCR反应时，不同引物的混合物也需要进行优化，以确保特异性和扩增效率。
8.引物的核酸相互作用力：引物的核酸相互作用力是指引物与模板DNA之间的结合力。
引物的核酸相互作用力可以通过计算引物的熔解温度（Tm）来评估。
普通pcr引物设计方法
普通pcr引物设计方法摘要：一、引言二、PCR引物概述1.PCR引物的定义2.PCR引物的作用3.PCR引物的分类三、普通PCR引物设计方法1.设计原则1) 引物长度2) 引物Tm值3) 引物间的互补性4) 引物与模板的互补性2.设计步骤1) 确定目标序列2) 查找引物设计软件3) 输入参数并进行引物设计4) 评估引物性能5) 优化引物四、常用引物设计软件介绍1.Primer 32.NP_Primer3.Oligo4.PyroMark Assay Design五、引物筛选与优化1.引物筛选1) 引物扩增效率2) 引物特异性2.引物优化1) 引物长度和Tm值优化2) 引物碱基序列优化六、总结与展望正文：一、引言PCR技术自1983年被发明以来，已成为分子生物学研究中不可或缺的工具。
PCR引物是PCR反应的核心组成部分，其设计直接影响到PCR扩增效果。
本文将介绍普通PCR引物设计方法，以指导科研人员和技术人员高效地进行PCR实验。
二、PCR引物概述1.PCR引物的定义PCR引物是一对短的DNA片段，分别与目标序列的两端互补，引导DNA 聚合酶在目标序列上进行扩增。
2.PCR引物的作用PCR引物的作用主要有两点：一是引导DNA聚合酶在特定位置开始扩增；二是使扩增产物具有特定的序列。
3.PCR引物的分类根据引物长度和碱基序列，PCR引物可分为常规引物和巢式引物。
三、普通PCR引物设计方法1.设计原则（1）引物长度：通常为18-25个碱基对，过长的引物可能导致扩增效率降低。
（2）引物Tm值：理想的Tm值约为50-65℃，过高或过低的Tm值都会影响引物扩增效果。
（3）引物间的互补性：引物之间应避免互补，以免发生非特异性扩增。
（4）引物与模板的互补性：引物应与目标序列具有较强的互补性，以确保扩增效率。
2.设计步骤（1）确定目标序列：根据研究需求，选取需要扩增的目标序列。
（2）查找引物设计软件：市面上有很多引物设计软件，如Primer 3、NP_Primer、Oligo等。
PCR引物设计原理及方法
PCR引物设计基本思路1.根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区）ncbi网站查询RBS149..153/gene="eryF"CDS158..1372/gene="eryF"1ggatcccgat cgtgtcggag gaagaggcca agtcgcgccg ccccgaccag ctgctggtgc61tgccctggat ctaccgcgac gggttcgtcg aacgcgagca ggagttcctc gctggcggcg121gaaagctgat cttcccccta ccccgactgg aagtcgtatg acgaccgttc ccgatctcga181aagcgactcc ttccacgtcg actggtaccg cacctacgcc gagctgcgcg agaccgcgcc241ggtgacgccg gtgcgcttcc tcggccagga cgcgtggctg gtcaccggct acgacgaggc301gaaggccgcg ctgagcgacc tgcgcctgag cagcgacccg aagaagaagt acccgggcgt361ggaggtcgag ttcccggcat acctcggttt ccccgaggac gtgcggaact acttcgccac421caacatgggc accagcgacc cgccgaccca cacccggctg cgcaagctgg tgtcgcagga481gttcaccgtc cgccgcgtgg aggcgatgcg gccccgcgtc gagcagatca ccgcggagct541gctcgacgag gtgggcgact ccggcgtggt cgacatcgtc gaccgcttcg cccacccgct601gcccatcaag gtcatctgcg agctgctcgg cgtcgacgag aagtaccgcg gggagttcgg661gcggtggagc tcggagatcc tggtcatgga cccggagcgg gccgaacagc gcgggcaggc721ggccagggag gtcgtcaact tcatcctcga cctggtcgag cgccgccgca ccgagcccgg781cgacgacctg ctgtccgcgc tgatcagggt ccaggacgac gatgacggtc ggctcagcgc841cgacgagctg acctccatcg cgctggtgct gctgctggcc ggtttcgagg cgtcggtgag901cctcatcggg atcggcacct acctgctgct cacccacccg gaccagctcg cgctggtgcg 961gcgggacccg tcggcgctgc ccaacgccgt cgaggagatc ctgcgctaca tcgctccgcc 1021ggagaccacc acgcgcttcg ccgcggagga ggtggagatc ggcggtgtcg cgatccccca 1081gtacagcacg gtgctggtcg cgaacggcgc ggccaaccgc gacccgaagc agttcccgga 1141cccccaccgc ttcgacgtca cccgcgacac ccgcggccac ctgtcgttcg ggcagggcat 1201ccacttctgc atgggccggc cgctggccaa gctggagggc gaggtggcgc tgcgggcgct 1261gttcggccgc ttccccgctc tgtcgctggg aatcgacgcc gacgacgtgg tgtggcggcg 1321ttcgctgctg ctgcggggca tcgaccacct accggtgcgg ctcgacggat gagcacctgg 1381ctgcggcggt tcggtcctcc cgtcgagcac cgggcgcggc tggtgtgctt cccgcacgcg 1441ggagccgcgg ccgactccta cctcgacctc gcgcgcgcct tggcgcccga gatcgacgtg 1501cacgccgtgc agtacccggg gcgccaggac cgccgcgacg aggagcccct gggcaccgcc 1561ggcgagatcg ccgacgaggt ggccgccgtg ctgcgcgcgt cgggcggcga cggcccgttc 1621gccctgttcg ggcacagcat gggcgcgttg atcgcctacg agacggcgcg caggctcgaa 1681cgcgagcccg gcggcgggcc gctgcggctg ttcgtgtccg ggcagaccgc cccgcgcgtg 1741cacgagcgcc gcaccgacct gcccggcgac gacggtctgg tggacgagct gcgccggctc 1801ggcaccagcg aggcggcgct ggccgacgag gccctgctcg ccatgtcgct gccggtgctg 1861cgcgccgact accgcgtgct gcgctcctac gcctgggcgg acggaccacc gctgcgggcc 1921ggcatcaccg cgctgtgcgg cgacgccgac ccgctgaccg cgaccgggga cgccgagcgc 1981tggttgcagc actcggtcat ccccggccgg accaggacct tccccggcgg gcacttctac 2041ctgggtgaac aggtcaccga ggtggccggt gccgtgcgcc gggacctgct acgcgccggg 2101cttgcgggct gaggcgatca cgaagtcgag cgcgggcagc tcgcccttca tgcccgagtc 2161gctggtcagc gaccgcttga cctggctgta gaagagcctg ctcacgctct tcttgaacga2221ctcgtcctgc aggcacctgg ctg2.选择所需的载体,确定合适的酶切位点。
定量pcr引物设计的详细步骤
定量pcr引物设计的详细步骤宝子，来给你唠唠定量PCR引物设计的步骤哈。
一、确定目的基因序列。
你得先知道你要研究的目的基因是啥呀。
这就好比你要找一个小伙伴，你得先知道他长啥样。
你可以去一些基因数据库，像NCBI这种超厉害的地方，找到你要的那个基因的序列。
这个序列就像是这个小伙伴的身份证号码，是独一无二的哦。
二、引物设计软件选择。
有好多好用的引物设计软件呢。
比如说Primer Premier，这个就像一个贴心的小助手。
你把目的基因序列输进去，它就能开始帮你设计引物啦。
还有Beacon Designer也很不错哦。
这些软件就像是魔法棒，能在基因的海洋里给你捞出合适的引物来。
三、引物设计参数设置。
这一步很关键哦。
一般来说呢，引物的长度大概在18 - 25个碱基左右就好啦。
太短了就像小短腿，不太稳；太长了又像大长脚，容易出问题。
还有引物的GC含量，最好在40% - 60%之间。
这就像是一个黄金比例，能让引物和模板结合得更牢。
另外，引物自身不能有太多互补的地方，不然它自己就抱成一团，不跟模板好好玩啦。
四、特异性检查。
设计好引物之后，可不能就这么不管了。
得检查一下它的特异性呢。
这就像是给引物做个忠诚度测试。
你可以用BLAST这个工具，把你设计的引物序列放进去，看看它是不是只和你的目的基因结合，要是和其他乱七八糟的基因也有结合，那可不行，就像找错小伙伴啦。
五、引物合成。
如果前面的步骤都没问题啦，那就要把引物合成出来。
这时候就可以找专门的公司啦，就像把设计图交给工匠，让他们做出真正的成品。
合成好的引物拿回来，就可以开始你的定量PCR之旅啦。
宝子，按照这些步骤来，设计定量PCR引物就不是啥难事啦。
加油哦！ 。
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PCR引物设计的黄金法则1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。
否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。
应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。
引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。
（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。
3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。
10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
11. 引物应具有特异性。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。
如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
POST by Bingsen Xu前言：我是刚刚注册到丁香园，在PCR技术讨论版看见置顶贴，“请求助引物设计的战友先进来这里！”稍微浏览了一下，发现很多朋友对PCR引物设计还不是很熟悉，我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完之后，可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。
开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。
当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的讨论范围。
另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。
你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0(primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是/。
第二步：贴上模板序列。
进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。
（附件Word文档里有图）在“Paste source sequ ence below (5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。
注意是5'->3'方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。
第三步：重要参数设定。
首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。
默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500，具体看情况调整。
第二个参数是“Primer Size”，默认值一般可以用，但是，当你用熟了这个软件，你自己就知道该怎么改了。
第三个参数是”Primer Tm”这个和Primer Size差不多。
第四步：Pick primers：点一下这个按钮，符合你大小预期的primer 就出来了，看看Primer3 Output的界面，多么漂亮！你要的primer 出来了，而且有primer在序列上的位置比对图，还有primer本身的信息，包括位置，长度，Tm，GC含量，任何位置互补碱基数，3'端互补碱基数，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'），还有产物大小，两引物间任意互补碱基数，两引物间3'端互补碱基数等。
如果引物尚在参数设定的范围内，但还不是最佳，将会给出警告。
比如（随便举例，本人在做一个超长引物）：WARNING: Left primer is unacceptable: High 3' stability OLIGO start len tm gc% any 3' seqLEFT PRIMER 1 33 69.02 45.45 6.00 1.00 TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCRIGHT PRIMER 1388 34 67.86 29.41 6.00 2.00 AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCE SIZE: 1388INCLUDED REGION SIZE: 1388PRODUCT SIZE: 1388, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 3.00 第五步：引物设计检验：可以仅仅设计一向引物，只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一个就可以。
也可以自己定义引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的书写反向仍然是5'->3'）如果符合设定的条件，软件将对给出引物评分，同时给出警告信息，根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可，警告信息也让你做实验的时候心中有数。
对于文献发表的引物，最好都要检查一下，这样就可以避免被别人有意无意误导。
至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA对RT-PCR 的干扰。
实际做引物的时候，要把内含子都去掉，仅仅把外显子序列放入源序列框中，并且通过自定义引物设计的方法，使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。
至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR，我将抽空另做说明。
至于设计出来的引物的实际效果，根据我的经验，一般情况下都能做到PCR一次成功，也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果，但是不管怎么说，软件做引物可以让自己心中有数。
最后，GOOD LUCK TO EVERYONE.手把手教你在线做PCR引物设计POST by Bingsen Xu前言：我是刚刚注册到丁香园，在PCR技术讨论版看见置顶贴，“请求助引物设计的战友先进来这里！”稍微浏览了一下，发现很多朋友对PCR引物设计还不是很熟悉，我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完之后，可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。
开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。
当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的讨论范围。
另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。
你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0(primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是/。
第二步：贴上模板序列。
进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。
（附件Word文档里有图）在“Paste source sequence below (5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。
注意是5'->3'方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。
第三步：重要参数设定。
首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。
默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500，具体看情况调整。