乙醇脱氢酶I基因敲除的酿酒酵母重组菌 构建的初步研究
乙醇脱氢酶Ⅰ基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究
参考文献：
Ｍ为分子量标准（ＤＬ ２０００，天为时代）；泳道ｌ和２均为扩增的样品
分子量为１０２３ｂｐ。
图４
以ＨｙＢｌ和Ｈ［ｙＢ２为引物扩增转化酵母基因组结果
筛选抗性菌落。结果显示（图３），有部分菌株可以在含 有潮霉素的平板上生长，表明其体内含有潮霉素抗性，
而在空白对照平板上（未涂有１００ ｐ ｇ，ｍｌ潮霉素）没有菌落 生成。
利用酵母基因组提取试剂盒，提取转化后酵母及野 生酵母的基因组ＤＮＡ，以ＨｙＢｌ和ＨｙＢ２引物进行ＰＣＲ 扩增。结果发现（图４），在酵母基因组上，扩增出本实 验所需要的片段１０２６ｂｐ，说明外源基因已经整合到酵母 基因组上。 ２．５ 发酵实验
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)做为传统的乙醇生产菌株，具有乙醇耐受性强，发酵工艺成熟，工业应用范围广泛，与其它微生物比较生物 安全性好等特点。同时，酿酒酵母是第一个基因组完成测序的真核生物，遗传背景非常清楚，由于其体内具有高效的同源重组机制，在分子和基因水平
进行操作非常容易。在实际工业生产中，为了降低发酵工艺成本、实现高效的转化率和产出率，菌种的优劣在整个生产流程中尤为重要。因此，菌种的 选育必须以降低生产耗资与高产出为原则。近年来，依据代谢工程理念，应用分子生物学手段对酿酒酵母进行分子育种是主要的研究方向，其中，尤为 突出的是重组DNA技术。应用代谢工程理念使用基因工程手段对菌种改造过程中，敲除或过表达特定基因可以阐明该基因功能，改变代谢途径，从而提高 目标产物产量。同时，该突变株为进一步探索目的基因的转录调控机制、基因与蛋白质相互作用以及分子信号传导通路等提供了理想材料，并为进一步 从基因和分子水平改进酿酒酵母乙醇代谢途径，构建优良性状高产乙醇生产菌奠定了基础。本研究利用酿酒酵母细胞内的同源重组机制，运用基因敲除 和过表达技术，降低了由乙醛生成乙酸的分解代谢流，并在此基础上增强了己糖代谢率。与原始出发菌株相比，不仅提高了乙醇产量，而且缩短了发酵 周期，提高了发酵产率。研究内容如下：
敲除SNF1基因提高酿酒酵母乙醇生物合成的研究
药 物 生 物 技 术Pharmaceutical Biotechnology 2009,16(2):103～107敲除SN F1基因提高酿酒酵母乙醇生物合成的研究①雷娟娟,王艳尊,江贤章,高媛媛,李欣,蓝灿华,陈由强,吴松刚,黄建忠3(福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心生命科学学院,福建现代发酵技术工程研究中心,福建福州350108)摘 要 S N F1基因编码的Snf1p对起始受葡萄糖阻遏基因的转录是必需的。
通过重叠延伸PCR和两步PCR法合成了两端各带有352bp和345bp与S N F1序列上下游同源的基因敲除组件。
将该敲除组件转化至酿酒酵母YS2,获得被loxP2kan2loxP序列组件替换而产生kan r的阳性克隆子。
然后将质粒pSH65转入阳性克隆子并诱导表达Cre酶切除kan基因,进而通过传代丢失质粒pSH65后得到S N F1单倍体缺陷型菌株。
重复转化敲除组件实现另一条等位基因的敲除,得到S N F1双倍体缺陷型菌株YS22△snf1::lox p2kan2lox p。
厌氧发酵试验表明该突变株的乙醇产量较出发菌株YS2提高了8.74%。
残糖量试验表明在培养基中葡萄糖消耗殆尽后,突变株相对于出发菌株而言并没有利用乙醇作为碳源,乙醇产量保持稳定未有下降。
敲除S N F1基因是提高酿酒酵母生物合成乙醇的一条有效途径。
关键词 酿酒酵母;S N F1基因;基因敲除;乙醇中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:100528915(2009)022103205 在酿酒酵母(S accharom yces cerevisi ae)中有5个基因A D H12A D H5编码与乙醇代谢相关的乙醇脱氢酶,其中的4种乙醇脱氢酶Adh1p、Adh3p、Adh4p和Adh5p在葡萄糖发酵过程中还原乙醛生成乙醇;而当环境中缺少作为碳源的葡萄糖时,受葡萄糖阻遏的A D H2基因起始表达,生成Adh2p开始催化乙醇作为碳源进行生长;同时A L D6基因编码的乙醛脱氢酶Ald6p启动催化乙醛氧化为乙酸的生化反应,从而减少乙醛生成乙醇的量[1]。
纤维素乙醇生产重组酿酒酵母菌株的构建与优化研究进展
2018年第37卷第8期 CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS·3119·化 工 进展纤维素乙醇生产重组酿酒酵母菌株的构建与优化研究进展唐瑞琪1，熊亮2，程诚2，赵心清1，白凤武1（1上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240；2大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116023）摘要：寻找化石能源的替代品以及开发和利用生物能源已引起国内外研究者的广泛关注。
提高酿酒酵母利用来源广泛、贮存丰富的农林废弃物等木质纤维素原料生产燃料乙醇的效率是生物能源的重要研究内容，但是，重组酿酒酵母木糖发酵性能低是限制纤维素乙醇经济性的关键问题。
本文总结了酿酒酵母中木糖代谢途径的构建和优化以及木糖转运对木糖利用的影响，分析了重组酵母利用纤维素水解液进行乙醇发酵的研究现状，并对进一步提高重组酿酒酵母纤维素乙醇生产效率的研究趋势进行了展望。
目前国内外已经构建了可有效利用木糖产乙醇的重组酵母，但对其木糖代谢机制的研究还尚未深入，限制了重组菌株的定向改造。
此外，目前缺少在纤维素生物质水解液发酵实际应用过程中对重组菌株的评价。
因此，加强重组酵母菌株对木糖利用相关代谢调控机理的分析，注重多种抑制物对菌株发酵性能的影响，结合真实底物纤维素乙醇发酵过程进行重组菌株的构建和优化，从而进一步提高纤维素乙醇生产的经济性，是未来菌株构建的重要研究方向。
关键词：生物燃料；木质纤维素类生物质；乙醇发酵；酿酒酵母；代谢工程中图分类号：Q939.97 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2018）08–3119–10 DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2017-1977Progress of research on construction and optimization of recombinantSaccharomyces cerevisiae strains for cellulosic ethanol productionTANG Ruiqi 1, XIONG Liang 2, CHENG Cheng 2, ZHAO Xinqing 1, BAI Fengwu 1（1School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; 2School of LifeScience and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116023, Liaoning, China ）Abstract: The increasing challenges on gradual depletion of fossil fuel and global warming are driving the development of alternative fuels and utilization of bioenergy. Production of fuel ethanol from lignocellulosic feedstocks including a variety of agricultural and forestry residues has received increasing interests in recent years. Saccharomyces cerevisiae is the most commonly used microbial organism for ethanol production. However, it cannot efficiently assimilate xylose, which is the most abundant pentose in lignocellulosic hydrolysates. Therefore, construction and optimization of xylose utilizing S. cerevisiae is of great importance for improving economic cellulosic ethanol production. The construction and optimization of recombinant S. cerevisiae strains by integrating xylose utilization pathway, and the effect of xylose transport on xylose assimilation were summarized. Furthermore, the current status of cellulosic ethanol production using the recombinant S. cerevisiae strains was discussed, and further prospects on improvement of production efficiency of cellulosic ethanol was provided. Currently, the yield of ethanol from xylose by the recombinant strains has been improved significantly.程改造工作。
带有木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母的构建
带有木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母的构建摘要：酿酒酵母是工业上生产乙醇的优良菌种。
但酿酒酵母不能发酵木糖，只能发酵木糖的异构体。
木糖是半纤维素水解液中除葡萄糖外的另一种主要成分，最高可占半纤维素水解糖类的34%，但是自然界中的微生物普遍对木糖的利用率较低，因此提高木糖的生物转化率，可促进对半纤维素水解液的利用，从而实现对木质纤维素原料的全糖利用。
关键词：木糖还原酶基因；木糖醇脱氢酶基因；酿酒酵母；一、木质纤维素生产乙醇的研究目前各国的乙醇主要以玉米、小麦、薯类等粮食为原料经过发酵生产而成，以淀粉类和糖类作为发酵原材料，采用微生物法发酵生产乙醇是一项成熟的技术，但高昂的原料成本使发酵法生产乙醇的工业应用受到限制，尤其是中国这样的人口大国，粮食作为原料生产乙醇决非长远之计。
车用汽油乙醇的推广必将增加粮食的供需矛盾。
目前，国内外均以淀粉质和糖蜜为原料生产乙醇，底物成本在生产总成本中占有很大的比例，在欧美发达国家为40％左右，而在中国这一数值高达60％--70％。
因此开发用于燃料乙醇生产的廉价原材料是这一能源领域研究的主要方向之一。
地球上最丰富的可再生资源--木质纤维素，每年仅陆生植物就可以产生约500亿吨，它还是最主要的生物质资源，占地球生物总量的60％----80％。
它是光合作用产物，充分将其中可利用成分转化为燃料乙醇，不仅可以提供清洁能源，而且有利于推动太阳光能的转化利用，同时促进大气中C02的循环，减少由矿物燃料燃烧造成的C02净排放。
木质纤维素具有成本低廉、可再生、来源丰富、品种多、再生时间短等优点，尤其是农林废弃物资源，开展利用农林废弃物生产燃料乙醇的研究不仅可以解决农林废弃物的利用问题，而且可以缓解粮食和能源紧张。
我国是一个农业大国，具有巨大的农业资源，木质纤维素尤为丰富，农作物秸秆、皮壳、林业副产品、城市垃圾和工业废物数量也很可观。
我国每年仅农作物秸秆产量就有5亿吨左右，可生产7256万吨无水乙醇，潜力十分巨大。
基因工程改造酵母菌用于生物乙醇生产的研究
基因工程改造酵母菌用于生物乙醇生产的研究现在的世界变化得真快啊，特别是在能源方面，咱们一方面想着如何不再依赖那些污染环境的化石燃料，另一方面又得考虑怎么让我们的生活变得更加环保、可持续。
你看，传统的石油、煤炭，大家都知道，它们在消耗的过程中对环境的伤害有多大。
而在这片被污染笼罩的天空下，咱们也不得不想想办法，怎么样才能找到既环保又能提供足够能源的替代方案呢？嘿！这里就不得不提到一种“神奇”的能源——生物乙醇。
它的魅力可不小，尤其是如果能利用基因工程技术来“改造”酵母菌，生产出来的生物乙醇，那可真是一件既环保又能为我们带来“绿色革命”的大事儿。
说到生物乙醇，很多人可能会有点儿疑惑：“乙醇不是酒精吗？你说它能做能源？”没错，你没听错，乙醇就是咱们平时喝的酒精，不过这种酒精有个特别的身份，那就是它也是一种清洁的燃料，可以用来替代石油，减少空气污染。
这种乙醇的制作可不仅仅是靠自然发酵的传统工艺了，咱们科学家用的是更“高端”的手段——基因工程。
通过这项技术，咱们能把酵母菌“改造成”超级生产乙醇的工厂，效率高得惊人，成本低得让人瞠目结舌。
说起来，酵母菌可是一个非常不简单的小家伙。
它生活在我们身边，通常在制作面包、酿酒时都会出现，咱们平时一想到它，脑袋里肯定浮现的是发酵和膨胀的面包。
然而，酵母菌除了这些本领，它在“生物乙醇生产”上，可是展现了强大的潜力。
通过基因工程，咱们可以“调整”它的基因，使其更高效地分解糖类，快速生产出乙醇。
这么一来，不仅节省了生产时间，还减少了那些繁琐的步骤，甚至可以让乙醇的产量大大提高，真是“画龙点睛”。
这个过程怎么说呢？其实就像给酵母菌“做手术”一样，把它的基因进行剪切、修改，给它加上一些新的功能。
要知道，基因工程技术可不是什么简单的活儿，就像做精细的手工活一样，每一刀每一刻都得小心谨慎。
科学家们通过这种方法，不仅让酵母菌产生更多的乙醇，还能让它适应不同的生产环境，甚至可以在低成本的情况下实现规模化生产。
酿酒酵母ADH2基因沉默菌株构建的初步研究
(NH4) 2S045 g , KH2P042 g , MgS04.7H20 2 g 。
酿酒酵母 ADH2 基因沉默菌株构建的初步研究
林燕环
〈漳州职业技术学院建筑工程系，福建漳州 363000)
摘
要 z 本实验通过构建酿酒酵母 ADH2 基因沉默表达载体，电转化法转化酿酒酵母工程菌 Y01 ，获得酿酒酵母 ADH2
基因沉默突变株 8010 发酵实验结果表明沉默突变株乙醇产量相对较低。说明沉默突变株体内乙醇合成途径受到干扰.
2015-09-15
基金项目 s 现代农业产业技术体系建设专项资金资助 <CAR8-20) 作者简介 g 林燕环(1986一) ，女，福建龙海人，助教，硕士，主要研究方向 g 应用微生物与发酵技术。
2
津州职业技术学院学报
2015 年
YPD+G418 培养基: Y01 菌株对 G418 不具有抗性，因此选择 G418 作为抗性标记，而不同菌株对 G418 敏感程度有所不同，所以实验前需要检测酵母菌对 G418 的最低耐受浓度。根据耐受实验结果，我们所采
G418 (遗传霉素)有抗性。
1. 2 培养基
YPD 培养基:酵母提取物 1% ，蛋白陈 2% ，葡萄糖 2% ，其中固体培养基含 2%琼脂粉， IlSoC 灭菌 20
盯11n 。
LB 培养基: 1% 蛋白胀， 0 .5%酵母提取物，
菌 20 min 。
收稿日期:
l%NaCl , pH7.0 ，其中固体培养基含 2% 琼脂粉， 121.C 灭
基因敲除技术改造工业酿酒酵母菌株
基因敲除技术改造工业酿酒酵母菌株亚硫酸盐是食品及啤酒行业普遍采用的抗氧化剂，在啤酒酿造过程中能与醛类物质发生加成反应而起稳定风味的作用。
作为抗氧化剂主要是由于亚硫酸盐能够结合氧而产生无毒害影响的硫酸根离子。
作为风味稳定剂主要是由于亚硫酸盐能够与含醛类化合物结合产生不挥发性的亚硫酸盐加成物，减少了啤酒中游离醛类物质的含量。
然而啤酒酿造过程中形成的亚硫酸盐被亚硫酸盐还原酶还原而不能在啤酒中积累，故其在发酵液中含量一般较低，不能起到稳定啤酒风味的作用。
啤酒中亚硫酸盐有多种来源，然而两个主要来源是发酵过程中酵母代谢产生的和在啤酒瓶装或罐装前外加进的。
硫酸盐进入酵母细胞后，在ATP-硫酸化酶的催化下，首先被三磷酸腺苷活化，经过一系列酶促反应后，变为亚硫酸盐。
亚硫酸盐是中间产物，其进一步被亚硫酸盐还原酶还原后，形成硫化氢。
亚硫酸盐能与啤酒中主要的老化物质羰基化合物通过复杂的反应，生成对风味稳定性无影响的较稳定的复合物，能够延长啤酒的保鲜期。
酿酒酵母的met10基因编码了一个115kD的亚硫酸盐还原酶必需的多肽，它可能是亚硫酸盐还原酶的亚单位，缺失met10基因的酿酒酵母在发酵过程中亚硫酸盐的含量可能会大幅度提高，亚硫酸盐作为一种抗氧化剂，在啤酒中含量增加对啤酒的稳定性有利，用此种酵母生产的啤酒的风味稳定性比用常规酵母高得多。
可以避免在发酵完毕时，添加抗氧化剂亚硫酸盐，而引起生成较多的H2S。
影响啤酒质量的诸多因素中，酵母菌种的好坏起着至关重要的作用，可以说酵母是啤酒的灵魂。
高质量的啤酒当然需要性能优良的酵母菌种，酿酒酵母是最早人类认识和利用微生物之一。
几个世纪以来，酿酒酵母被用于食品和酒精饮料生产，如今它也被应用于制药、表达异源蛋白等不同行业中。
酿酒酵母因其不表达内毒素而不具致病性，使得其被分类为GRAS (Gene- rally Regarded As Safe)生物，其在工业上大规模的被用于生产面包、酒精和啤酒。
基因重组技术在工业微生物菌种选育中应用的研究进展
基因重组技术在工业微生物菌种选育中应用的研究进展一、简述随着科学技术的日新月异，基因重组技术这一前沿生物科技在多个领域均展现出巨大的应用潜力。
尤其在工业微生物菌种的选育方面，基因重组技术更是展现出了其独特的魅力和重要性。
工业微生物菌种的选育，作为现代生物技术中的关键环节，对于优化工业生产流程、提高生产效率以及降低生产成本等方面具有重要意义。
在此背景下，基因重组技术的出现为工业微生物菌种的选育提供了更加高效、精准的手段。
通过基因重组技术，我们可以将不同菌株的优势基因进行有效整合，从而培育出具有优良性状、高性能的工业微生物菌种。
这样的菌种不仅生产效率更高，而且稳定性更强，能够更好地适应工业生产的复杂环境。
1. 基因重组技术的简介基因重组技术是现代生物技术的重要组成部分，它是指在微生物体内通过人工方法将不同的基因进行重新组合，创造出具有新的遗传特性和功能的微生物新品种。
这种技术的核心在于通过基因的同源重组，将来自不同亲本或不同物种的基因在特定的细胞中重新排列，从而实现对生物性状的改良和功能的增强。
通过基因重组技术，可以改造微生物的代谢途径，提高其生产特定产品的能力；利用基因重组技术，可以增加微生物对营养物质的利用率，降低生产成本；借助基因重组技术，可以提高微生物的抗逆性，使其能够在更恶劣的环境下生存和生产。
随着基因工程技术的发展，其在工业微生物育种领域的应用将更加广泛和深入。
随之而来的伦理和生态问题也应引起人们的重视。
在应用基因工程技术选育工业微生物菌种的过程中，必须充分考虑环境保护和可持续发展的原则。
2. 工业微生物菌种选育的重要性在生物技术飞速发展的今天，工业微生物的应用范围持续扩大，尤其在发酵、制药、生物能源及环保等产业中扮演着至关重要的角色。
为了持续提升这些工业微生物的生产效率和产品质量，科学家们已经逐渐认识到菌种的选育工作是其中的关键环节。
即根据预定的目标，通过科学手段从自然界或已有的菌株中选择出具有特定遗传特性的菌株，进而通过遗传修饰和基因重组技术，培育出性能优越的新菌种。
酿酒酵母基因工程菌的构建及工艺优化研究进展
酿酒酵母基因工程菌的构建及工艺优化研究进展酿酒酵母是合成天然产物的重要宿主菌，但在酿酒酵母中构建遗传稳定性好、基因表达可控的代谢途径并获得高产菌株仍然是代谢工程和合成生物学中的难点，笔者系统介绍了目前酿酒酵母工程菌的构建及发酵条件优化的研究进展为其代谢与合成提供一定的参考。
标签：酿酒酵母；表达系统构建；发酵优化；合成生物学酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为酵母科酵母属，单细胞真核微生物，细胞形态多呈卵形或者球形，直径5～10μm，以出芽生殖方式进行无性繁殖。
其以研究背景清晰、代谢繁殖快、安全无毒、不致病等优点被广泛应用于食品与医疗卫生领域[1]。
早在1996年已完成了对酿酒酵母的全基因组测序工作，其基因组包含16条染色体，全长为12068kb[2]。
近年来，经国内外学者研究报道，酿酒酵母菌已经成为一种重要的模式生物被广泛的应用于基因工程、蛋白表达及遗传学分析等研究领域[3-4]，并围绕酵母菌开展了酵母基因敲除技术、酵母基因定位技术、酵母功能基因芯片技术、酿酒酵母双杂交技术等[5]。
值得注意的是，由于酵母菌是最简单的真核生物，而利用酵母菌表达动植物基因能在相当大的程度上阐明高等真核生物基因表达调控的基本原理以及基因编码产物结构与功能之间的关系，从而起到异源表达或鉴定目的蛋白的作用[6-7]，所以越来越多的学者致力于通过构建酿酒酵母工程菌，建立酵母表达系统，并通过对发酵工艺的优化得到高产菌株，合成细胞工厂以发酵生产植物源天然产物[8]。
笔者将着重介绍近年来构建的酿酒酵母基因工程菌在表达系统中的应用及酿酒酵母发酵工艺优化的研究进展。
1酿酒酵母表达系统的研究进展目前构建酵母工程菌的途径主要有两种：一是在酵母底盘细胞中人工构建目的产物的合成途径，以实现快速大量的生产重要药用有效成分或其中间体；二是基于合成途径分支点的特点，通过抑制或下调目标途径的竞争途径以达到目的产物大量表达的方法。
啤酒废酵母中乙醇脱氢酶提取工艺的研究
摘 要 ： 以废 弃 的 啤 酒 酵母 为 原料 ， 用超 声辅 助 的 方 法对 其 中的 ＡＤＨ 进 行 了提 取 ． 采 实验 考 察 了料 液 比 、 酒酵母 用量 、 Ｈ、 声波 功 率 、 声 全 程 时 间 和提 取 液 浓度 对 ＡＤＨ 提 取 效 果 啤 ｐ 超 超 的影 响 ， 进一 步通 过 Ｉ ３ ） 交 试 验 对 ＡＤＨ 的提 取 工 艺进 行 了优 化 ， 到 了啤 酒 废 酵母 中 （。 正 得
应 ５ｍｉ ， 即 置于 沸水 中灭活 ， ３ ０ｎ 波 长处 检测 吸 光 度值 ． 白对 照 用 蒸 馏 水代 替 加 ＮＡＤ 其余 ｎ立 于 ４ ｍ 空 ，
均相 同．
ＡＤＨ 酶 活 力 （ ｍＩ） 义 ： ＡＤＨ 在 ３ ℃ 每 分 钟 氧 化 乙 醇 脱 氢 生 成 乙 醛 ， 还 原 Ｎ 为 Ｕ／ 定 将 ７ 即 ＡＤ ＮＡＤＨ， ３ ０ｎ 处测 定 的 吸光 度变 化 ０ ０ １作 为一 个活 力单 位 （ ． 在 ４ ｍ ．０ Ｕ） １ ２ ２ ＡＤＨ 的提 取 方法 ． ．
＊ 收 稿 Ｅ期 ：０ ７ ９ １ ｔ ２ ０ —０ — ７
作 者 简 介 ： 跟 年 （ ２ ， ， 西 省 泾 阳县 人 ， 授 ， 究 方 向 ： 物 制 药 毛 １ ６ 一） 男 陕 ９ 教 研 生
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・４ ・ ２
陕 西 科 技 大 学 学 报
１ ２ ３ ＡＤ 提取 工艺 的单 因素 实验 ． ． Ｈ
在 ＡＤＨ 提 取实验 中 ， 固定其 他 条件 ， 以提 取 液 中 ＡＤＨ 活 力 为 指标 ， 分别 对 料 液 比 、 品处 理 量 、 样 提 取液 ｐ 超 声波 功率 、 Ｈ、 超声 全 程时 间和 提取 液浓 度进 行考 察 ， 以确定 各影 响 因素 的适 宜水 平．
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2008, Vol. 29, No. 02食品科学※生物工程210收稿日期：２００７－０１－１５基金项目：黑龙江省科学技术厅青年基金项目（ＱＣＯ４Ｃ３３）；黑龙江省教育厅一般项目（１０５５１２３３）； 黑龙江大学青年基金项目（ＱＬ２００４３５）作者简介：葛菁萍（１９７２－），女，教授，博士，研究方向微生物学。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｅｊｉｎｇｐｉｎｇ５１２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ＊通讯作者：平文祥（１９５９－），男，教授，学士，研究方向微生物学。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｎｘｉａｎｇｐ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ乙醇脱氢酶Ｉ基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究葛菁萍，宋 刚，孙宗祥，凌宏志，蔡柏岩，刘松梅，平文祥＊（黑龙江大学 微生物黑龙江省高校重点实验室，黑龙江 哈尔滨 １５００８０）摘 要：本实验根据酿酒酵母乙醇代谢途径，构建一株低乙醇产量的酿酒酵母基因工程菌株，以满足人们对低醇啤酒的需要。
利用抗性基因筛选基因敲除突变体的方法，通过引物Ｌ１和Ｌ２扩增潮霉素Ｂ基因（两翼与酿酒酵母同源），按常规醋酸锂法转化酵母细胞后，筛选标记与酵母ａｄｈ Ｉ基因发生同源重组，得到一株ＡＤＨ Ｉ酶活性降低的工程菌株。
发酵实验结果表明，转化菌株乙醇含量平均值为１．８％（Ｖ／Ｖ），较原始菌株低了６５％。
说明转化菌株体内乙醇生成途径受到干扰。
关键词：酿酒酵母；基因敲除；乙醇脱氢酶ＩＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎｉａｓｅ Ｉ ＧｅｎｅＧＥ Ｊｉｎｇ－ｐｉｎｇ，ＳＯＮＧ Ｇａｎｇ，ＳＵＮ Ｚｏｎｇ－ｘｉａｎｇ，ＬＩＮＧ Ｈｏｎｇ－ｚｈｉ，ＣＡＩ Ｂａｉ－ｙａｎ，ＬＩＵ Ｓｏｎｇ－ｍｅｉ，ＰＩＮＧ Ｗｅｎ－ｘｉａｎｇ＊（Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００８０， Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｓ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｌｏｗ ａｌｃｏｈｏｌ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ａｌｃｏｈｏｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， ｓｏ ａｓ ｔｏ ｓａｔｉｓｆｙ ｔｈｅ ｐｅｏｐｌｅ ｗｈｏ ｐｒｅｆｅｒ ｔｏ ｄｒｉｎｋ ｌｏｗ－ａｌｃｏｈｏｌ ｂｅｅｒ． Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｈ Ｉ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｅｄ ｏｕｔ． Ａｆｔｅｒ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓＬ１ ａｎｄ Ｌ２ （ｔｈｅ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｇｅｎｅ）， ｉｔ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｙｅａｓｔ ＨＤＹ－０１ ｂｙ ＬｉＡｃ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｉ （ＡＤＨ Ｉ） ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｗａｓ ｄｅｌｅｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ． Ａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ＡＤＨ Ｉ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ａｌｃｏｈｏｌｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ ｉｓ １．８％（Ｖ／Ｖ）， ６５％ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｎｅ． Ｔｈｅ ａｌｃｏｈｏｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｔｈｉｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｉｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｄ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ；ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｉ （ＡＤＨ Ｉ）中图分类号：ＴＳ２６２５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）０２－０２１０－０３啤酒是以麦芽为主要原料，添加酒花，经酵母发酵酿制而成的，是一种含二氧化碳、起泡和低酒精度的饮料酒［１］。
其酒精的含量一般为３％～４％（Ｖ／Ｖ）。
随着人们生活水平的提高及口味的多样化，低醇乃至无醇啤酒成为部分消费人群的首选。
目前，世界上生产无醇啤酒的方法主要有二大类［２］：一是以限制发酵方法来降低制酒发酵过程中生成乙醇的量；另一类是在后发酵过程中将产生的乙醇除去。
随着基因工程技术的快速发展，以及对酿酒酵母基因的深入研究，从代谢途径出发，构建低乙醇产量的酿酒酵母基因工程菌株，可在不改变原有啤酒工艺的基础上，实现低醇乃至无醇啤酒的生产。
但目前有关这方面的研究报道几乎未见到。
从酵母代谢途径可知，控制乙醇含量的两个酶是乙醇脱氢酶Ｉ（ＡＤＨ Ｉ）与乙醇脱氢酶ＩＩ（ＡＤＨ ＩＩ）。
ＡＤＨ Ｉ的作用是将乙醛变成乙醇，ＡＤＨＩＩ的作用是将乙醇转变为乙醛［３］。
本实验利用抗性基因筛选基因敲除突变体的方法［４］，通过ＰＣＲ技术获得一段带有筛选标记和酵母同源区域的目的基因，通过常规醋酸锂转化法，使筛选标记与酵母ａｄｈ Ｉ基因发生同源重组，得到一株ＡＤＨ Ｉ酶活性降低的工程菌株。
１材料与方法１．１菌种与质粒211※生物工程食品科学2008, Vol. 29, No. 02ＨＤＹ－０１是一株工业用酿酒酵母，用于啤酒生产。
由黑龙江大学微生物重点实验室提供。
质粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１是一种穿梭质粒，在大肠杆菌中对卡那霉素（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）有抗性，在酵母菌中对潮霉素Ｂ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ）有抗性。
１．２培养基与试剂ＹＰＤ培养基：１％酵母提取物、２％蛋白胨、２％葡萄糖，１１５℃灭菌２０ｍｉｎ，用于酵母菌的活化和培养。
麦芽汁培养基：麦芽和水以１：４的比例混合后，６０℃水浴４ｈ，８层纱布过滤，滤出液１０８℃灭菌２０ｍｉｎ，待用。
用于酵母菌发酵培养实验。
氯化钙、氯化镁、ＰＥＧ４０００（聚乙二醇）、醋酸锂、乙酸铵、琼脂糖、酵母提取物、蛋白胨、Ｔｒｉｓ、盐酸等，均为国产试剂；鲑精ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）、潮霉素（ＭＤＢＩＯ）、Ｔａｇ酶、ｄＮＴＰ 天为时代公司。
１．３引物引物由上海生工合成。
为了敲除ＡＤＨＩ基因，设计了一对引物Ｌ１和Ｌ２。
此对引物依据酿酒酵母ＡＤＨ Ｉ基因全序列（１０４２ｂｐ）和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１质粒中潮霉素Ｂ基因而设计的。
酿酒酵母ＡＤＨ Ｉ基因的序列通过网站ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／查询。
Ｌ１和Ｌ２以ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１上的潮霉素Ｂ基因为模板，扩增后的ＤＮＡ片段转入酿酒酵母后实现同源重组。
Ｌ１和Ｌ２的５＇端各有４５ｂｐ与酿酒酵母ＡＤＨ Ｉ基因外侧序列相同。
在３＇端，Ｌ１的２２ｂｐ和Ｌ２的２１ｂｐ与潮霉素Ｂ基因两侧序列相同。
用Ｌ１和Ｌ２扩增的ＤＮＡ片段与ＡＤＨ Ｉ基因同源重组，使ＡＤＨ Ｉ基因失去作用。
同时由于替换的基因对潮霉素Ｂ有抗性，因此成为抗性标记，行使筛选任务。
为了验证转化后的酵母菌是否含有目的片段，我们设计了ＨｙＢ１和ＨｙＢ２引物，这对引物可以扩增出潮霉素基因片段。
Ｌ１：５＇ ＴＴＴ ＣＡＡ ＧＣＴ ＡＴＡ ＣＣＡ ＡＧＣ ＡＴＡ ＣＡＡ ＴＣＡＡＣＴ ＡＴＣ ＴＣＡ ＴＡＴ ＡＣＡ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＡＡＣＴＣ ＡＣＣＧ ３＇Ｌ２：５＇ ＡＡＣ ＴＴＡ ＴＴＴ ＡＡＴ ＡＡＴ ＡＡＡ ＡＡＴ ＣＡＴＡＡＡ ＴＣＡ ＴＡＡ ＧＡＡ ＡＴＴ ＣＧＣ ＴＴＡ ＣＴＡ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＧＣＣＣＴ ＣＧＧ ＡＣＧ ３＇ＨｙＢ１：５＇ ＣＡ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＴＣＡＣＣＧ ３＇ＨｙＢ２：５＇ ＧＣ ＴＴＡ ＣＴＡ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＧＣ ＣＣＴ ＣＧＧＡＣＧ ３＇１．４方法１．４．１潮霉素最低杀伤浓度的确定由于野生酵母菌对潮霉素不具有抗性。
所以用潮霉素作为筛选抗性标记，因此需要检测被转化酵母菌对潮霉素的最低耐受浓度。
取一系列浓度的潮霉素溶液０．２ｍｌ（２５、５０、７５、１００、１２５μｇ／ｍｌ）均匀涂布于ＹＰＤ平板上，待溶液渗入培养基后，将预先过夜培养的酵母菌液０．２ｍｌ均匀涂布于各平板上，３０℃培养４８ｈ后观察酵母菌生长情况，以能杀死全部酵母菌的最低潮霉素浓度作为筛选浓度。
１．４．２ＰＣＲ扩增转化片段以Ｌ１和Ｌ２为引物，以质粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１为模板进行ＰＣＲ扩增。
ＰＣＲ反应体系为：１０×ＰＣＲ缓冲液１μｌ，２．５ ｄＮＴＰ ０．８μｌ，Ｌ１和Ｌ２（１ｐ ｍｏｌ／μｌ）各１μｌ，ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１质粒ＤＮＡ ２μｌ，２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２ ０．８μｌ，Ｔａｇ酶（５Ｕ／μｌ）０．２μｌ，加双蒸水至１０μｌ。
ＰＣＲ反应程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５９℃退火３０ｓ，７２℃延伸１．５ｍｉｎ，３５个循环；最后７２℃延伸７ｍｉｎ；４℃保存样品。
以１％琼脂糖凝胶电泳检测。
１．４．３转化醋酸锂转化法转化酵母菌ＤＮＡ［５］。
１．４．４筛选潮霉素抗性酵母菌株转化后的酵母菌液涂布到含有潮霉素的ＹＰＤ平板上，３０℃培养４８ｈ后，将生长出的酵母菌落视为阳性菌落。
１．４．５重组菌落的验证从含潮霉素的平板上挑取较大的单菌落，接种于含有潮霉素的ＹＰＤ液体培养基中，３０℃，１８０ｒ／ｍｉｎ培养４８ｈ，收集细胞，利用酵母基因组提取试剂盒（天为时代）提取酵母基因组ＤＮＡ。
以它为模板，利用ＨｙＢ１和ＨｙＢ２为引物做ＰＣＲ扩增验证。
ＰＣＲ反应条件及程序同１．４．２。
１．４．６发酵实验证明以３％接种量，分别将原始酵母菌株和突变酵母菌株接入麦芽汁液体培养基中，以满瓶为装液量（７００ｍｌ），１２℃静止发酵５～１０ｄ，利用Ａｇｉｌｅｎｔ ６８９０气相色谱、ＦＩＤ检测器（氢火焰离子化检测器）、７６９４Ｅ顶空进样器、Ａｇｉｌｅｎｔ ６８９０气相色谱化学工作站检测乙醛含量。
利用气相色谱测定其中乙醇含量。
２结果与分析２．１潮霉素最低杀伤浓度野生酿酒酵母菌株对潮霉素不具有抗性，但是需要一定浓度的潮霉素才可以将酵母菌全部杀死。
本实验验证了２５、５０、７５、１００、１２５μｇ／ｍｌ系列潮霉素浓度对酵母菌的杀伤作用，发现当潮霉素浓度为１００μｇ／ｍｌ时（图１Ｄ），可以将酵母菌全部杀死。