辐照降解茯苓多糖效应研究

第29卷第10期2010年10月 分析测试学报FENXI CESH I X UEBAO (J ournal of Ins tru m en talAnal ys i s) V ol 129No 1101011~1016

收稿日期:2010-06-22;修回日期:2010-07-28

基金项目:湖南省科技项目资助(S2009W 2052,2008W K3001,S2009W 2052)

第一作者:龚志华(1969-),女,湖南桃源人,副教授,硕士

通讯作者:肖文军,Te:l 0731-********,E -m a i :l xi ao w en j ungong @1631co m

辐照降解茯苓多糖效应研究

龚志华1,2,陈美丽1,肖文军1,2

(1.湖南农业大学 园艺园林学院 茶学系,湖南 长沙 410128;2.湖南农业大学

国家植物功能成分工程技术研究中心,湖南 长沙 410128)

摘 要:采用扫描电镜、水溶性糖含量检测、紫外光谱、红外光谱等分析方法,系统研究了不同剂量60Co 辐

照处理对茯苓多糖的降解效应。结果表明,茯苓经辐照后,微观结构上颗粒变小、形状不规则,1000k G y

和1200k G y 处理出现平整切口;随着辐照剂量的增大,水溶性总糖、水溶性茯苓多糖增加,且1000kG y 效应最显著;紫外光谱检测结果显示,1000k G y 和1200kGy 辐照处理有羰基生成;红外检测结果显示,

800、1000、1200k G y 辐照处理后羰基均明显增加,且1000kG y 和1200k G y 处理间的差异不明显;说明辐照茯

苓后,茯苓多糖可有效裂解为以羰基类化合物为主且相对分子质量较小的物质,并呈剂量关系。

关键词:茯苓;茯苓多糖;辐照降解;茯苓水溶性多糖

中图分类号:O 43314;O 629112 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2010)10-1011-06

do:i 1013969/j 1i ssn 11004-4957120101101005Study on t he E ffects of Irrad i ati on D egradati on of Pachy m aran

GONG Zh-i hua 1,2,C H E N M e-i li 1,XI AO W en -jun

1,2(1.T ea Science D epart m ent o fH orticure and L andscape Co llege ,H unan A gr i cultural U niversity ,Chang sha 410128,Ch i na ;2.N ati onal R esearch C enter o f Eng i neer i ng and T echno l ogy f o r U tiliza ti on o f Bo tan i ca l

Functiona l Ingred i ents ,Hunan A gricultura lU n i ve rsity ,

Changsha 410128,Ch i na)Abstr ac:t The degradation effects of pachy m aran by 60Co irradiati o n w ith different dosesw ere syste m -

atically st u died through scann i n g electron m icr oscopy ,

test o f content of w ater -solub le g lucose ,UV spectra and infrared spectra .The results i n d icated that partic l e s o f the m aterials beca m e s m aller and for m ed irregularly after 60Co irradiation ,and several s m oo t h cuts appeared after 1000kGy and 1200

kGy treat m ents .The contents of totalw ater -so l u b le g l u cose and w ater -so l u b le pachy m aran i n creased

w it h t h e increase of irrad iated dose ,and the effectw as the m ost outstand i n g by 1000kGy .UV spec -

tra sho w ed that carbony lw as produced in 1000kGy and 1200kGy .Infrared spectra revealed t h at

carbony l increased obviousl y a fter 800kGy ,1000kGy and 1200kGy treat m ents ,and the difference

bet w een 1000kGy and 1200kGy w as not si g nifican.t The results indicated that pachy m aran after

60Co irrad iation could be efficientl y degraded to the s m a ller m olecular substances ,i n w hich carbony l

co m pounds w as the m a i n products and their contents presented a correlati o n w it h irradiated dose .

Key wor ds :Poria cocos(Schw .)W o l;f pachy m aran ;irrad i a ti o n degradation ;w ater -soluble pachy -

m aran

茯苓Poria cocos(Schw.)W olf 为多孔菌科真菌的干燥菌核,为常用中药,史载于5神农本草经6,被列为上品。性味甘淡、平,归入心脾肺经。具有祛湿利水、健脾和胃、宁心安神的作用,用于治疗小便不利、水肿胀满、痰饮咳逆、呕秽、泄泻、遗精、淋浊、惊悸、健忘等[1]。

我国茯苓资源丰富,全国各地均有栽培,主产于云南、安徽、湖北、河南等省[2]。茯苓中茯苓糖

(Pac hy m ose)含量达8412%[3],主要为B -茯苓聚糖。研究表明,B -茯苓聚糖为含有少量B -(1y 6)葡聚

糖支链的B -(1y 3)-D-葡聚糖,无抗肿瘤活性,但经化学修饰切去茯苓聚糖分子主链上的B -(1y 6)葡聚糖支链后,得到B -(1y 3)-D-葡聚糖的茯苓多糖(Pachy m aran),具有提高免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等作用

[4-5]。因此,茯苓是一种多糖含量高、成分较为单一、可用于制备功能性低聚糖或生

1012

分析测试学报第29卷

物能源的典型多糖植物资源。目前对茯苓多糖的利用主要集中在通过化学、物理及生物等技术对其进行结构修饰后用于抗肿瘤和免疫增强剂等方面[6-7]。

由于茯苓多糖的相对分子质量大,且难溶于水,使其生物活性大大降低,进一步开发应用受到极大限制。传统方法采用酸碱水解及超声波破碎等方法降低多糖的相对分子质量,以提高其水溶性,增强多糖的生物活性,但由于效果不佳及产物安全性问题而难以推广[8]。近年来生物酶法降解日益受到重视[9],但多糖是一类分子结构紧密的大分子物质,在分子内部很难进行酶解反应,使得反应效率低。因此选择合适的降解方法是开发利用茯苓资源的关键。

目前常见的降解方法有物理、化学和生物三种,其中辐照降解技术是一种安全、耗能低、不产生有毒与有害副产物及废物的物理方法。目前国内外常用的辐照技术为电离辐射[10],其基本原理是当C 射线或电子束透过物质时,沿运动路径和物质相互作用,其携带的能量被物质吸收,使物质发生电离效应,从而使物质发生降解或交联。H ebeish等[11]对玉米和大米淀粉进行10~250kGy的C射线辐照降解,发现淀粉辐照后发生氧化降解,且辐照后的淀粉与非辐照淀粉相比更适合做纺织浆料。高德玉等[12]通过对壳聚糖的C射线辐照降解,发现其相对分子质量随着辐照剂量增大而降低。据此推断茯苓多糖经辐照后,亦能发生降解。

鉴于我国具有十分丰富的药食同源植物茯苓,以及辐照技术安全、耗能低、应用广泛等优点,本实验利用高能60Co-C射线的高穿透力和对处理原料无要求的特点,通过扫描电镜、水溶性糖含量检测、紫外光谱、红外光谱等分析方法研究不同辐照剂量处理茯苓多糖的降解效果,提出了一种节能、绿色环保的茯苓多糖辐照裂解的处理方法和合理、高效的处理工艺。

1实验部分

111仪器与试剂

JS M-6380LV扫描电子显微镜(日本电子株式会社);UV-2550PC紫外可见分光光度计、8400-S傅立叶红外变换光谱仪(日本岛津公司);MODULYOD-230冷冻干燥机(美国电热公司)。

茯苓(购于湖南长沙药材市场);95%乙醇(安徽安特生物化学有限公司)、浓硫酸(上海振兴化工二厂有限公司)、苯酚(国药集团化学试剂有限公司)、葡萄糖(广东化学试剂厂)均为分析纯;溴化钾(光谱纯,天津市昊陆成化工有限公司)。

112实验方法

11211茯苓原料辐照处理取约1c m3大小的茯苓原料5份,每份800g,分别置于不锈钢盒广口瓶中,室温条件下以剂量率为45kGy/m i n的60Co源进行辐照,处理剂量分别为0(CK)、600、800、1000、1200kGy,然后将辐照后的茯苓粉碎过01025mm(40目)筛,备用。

11212不同剂量辐照处理的茯苓微观结构分析取不同剂量辐照后茯苓原料的表层与内层细小颗粒,用导电双面胶依次将其粘贴在金属样品托上,并用真空镀膜机镀金,以获得较高分辨率的图像,然后利用配有X-射线能谱仪的扫描电镜进行颗粒物微观结构观察。

11213不同剂量辐照处理的茯苓水溶性糖分析水溶性总糖提取:分别称取5g经丙酮脱脂处理的茯苓样品,按1B20的料液比加入70e蒸馏水,然后在70e恒温水浴1h,趁热抽滤,滤液定容至250mL,摇匀,备用。

水溶性多糖提取:分别称取20g经丙酮脱脂处理的茯苓样品,按上述方法提取,滤液浓缩至体积小于20mL后加入95%乙醇,至乙醇的终体积分数为80%,放入冰箱醇沉过夜,以4000r/m in离心15m in,弃上清液,沉淀用蒸馏水溶解并浓缩至无乙醇气味,真空冷冻干燥得茯苓多糖粗品。称取5m g多糖粗品,溶解并定容至25mL,摇匀,备用。

水溶性糖含量测定:采用硫酸-苯酚法[13]测定茯苓不同剂量辐照处理的水溶性糖含量。回归方程为:y=111354x+010231,r2=01999,其中y为葡萄糖的吸光度,x为葡萄糖的质量浓度(g#L-1)。11214不同剂量辐照处理茯苓水溶性多糖的紫外光谱分析对各剂量辐照处理的茯苓进行水提取,然后醇沉,沉淀物用蒸馏水溶解并浓缩至无乙醇气味,真空冷冻干燥得茯苓水溶性多糖粗品。取茯苓多糖适量,加水溶解,配成1g/L的多糖水溶液,以蒸馏水作空白,采用紫外可见分光光度法在190~

第10期龚志华等:辐照降解茯苓多糖效应研究800nm 范围内扫描。

11215 不同剂量辐照处理的茯苓红外光谱分析 取各剂量辐照处理的茯苓原料1mg ,与100m g KBr 混合于玛瑙研钵研磨均匀,压制成片,在400~4000c m -1

区间进行红外光谱扫描。2 结果与讨论

211 不同剂量辐照处理的茯苓微观结构分析

图1和图2分别为不同放大倍数下不同剂量辐照处理的茯苓扫描电镜图。表层观察表明,辐照前颗粒大、颗粒间隙大;辐照后颗粒变小、颗粒间较为紧实。内层结构观察发现,辐照前颗粒大,颗粒间隙大,外观圆滑,形状较有规则;辐照后颗粒破碎、表面粗糙、形状不规则,出现平整的切口,且颗粒物粒径分布不均匀。这说明茯苓经辐照后结构发生了断裂,且不同辐照剂量处理的茯苓呈现出不规则的微观结构,表明其结构发生不同程度的变化。

经600kGy 剂量处理后,原来松散的颗粒形成糊状集合体;800kGy 剂量处理的茯苓部分结构仍呈糊状集合体,另出现凸状颗粒结构;1000kGy 剂量处理的茯苓出现明显的平整切口,颗粒空隙增多;1200kGy 辐照处理的茯苓结构呈絮状集合体。由此可见,随着辐照剂量的增加,茯苓裂解效果变得明显。

有研究用C -射线辐照竹纤维素,考察辐照剂量对其相对分子质量的影响发现,随着辐照剂量的增大,竹纤维素的相对分子质量降低

[14],这为进一步推断茯苓多糖经辐照后物质结构能够发生裂解提供

了实验依据。图1 茯苓的表层扫描电镜图

F ig 11 SE M i m ages o f ex terna l l ayer of Po ria cocos(Sch w.)W olf

A .CK ,

B .600kGy , C.800kGy ,D .1000kGy ,E .1200kGy ;m agn i fi cati on w ere(fro m left t o ri ght):

5000,2000,1000,500,respecti vely 1013

分析测试学报第29

卷

图2 茯苓的内层扫描电镜图

F i g 12 SE M i m ages of i n ternal laye r o f P or i a cocos(Schw.)W o lf

t he illustrati on i s the sa m e as t hose i n F i g 11

212 不同剂量辐照处理的茯苓水溶性糖含量分析

不同剂量辐照处理的茯苓水溶性糖含量结果如表1所示。表1表明,虽然茯苓中糖的含量达8412%[3],但茯苓水溶性糖、水溶性多糖含量不高,仅分别为0152%、0121%,这主要是由于茯苓糖为碱溶性的B -茯苓聚糖;在茯苓水溶性糖中,水溶性多糖纯度达38143%,说明水溶性多糖在水溶性总糖中的含量较高。茯苓辐照后,水溶性糖含量显著增加,且随着剂量增加而增加;与对照相比,1000kGy 和1200kGy 处理后水溶性糖、水溶性多糖含量分别增加97倍、215倍以上;与600kGy 和800kGy 相比,1000kGy 和1200kGy 处理后水溶性糖、水溶性多糖含量分别增加1115倍、117倍以上,且以1000kGy 处理的水溶性糖含量增加最为显著。为了进一步探讨不同剂量辐照处理的效应与辐照降解茯苓多糖的机理,笔者以茯苓水溶性糖的提取率为考察指标,先后通过酶法辅助提取的单因子试验、正交试验及验证试验研究了B -葡聚糖酶对茯苓水溶性糖的辅助提取效果,优化了实验参数。结果表明,在最优酶促降解参数条件下,茯苓水溶性糖的得率仅为13131%。显然,辐照作用使茯苓水溶性多糖含量增加,且其降解效应显著优于B -葡聚糖酶对茯苓多糖的降解效应。

表1 不同辐照剂量处理的茯苓水溶性糖含量

T ab l e 1 Content o f wa ter -so l ub le g lucose in Po ria co cos(Sch w.)W o lf under different C -irrad i ated doses w /%

Irrad i ated dose(kGy)0(CK)

60080010001200Con tent of totalw at er -sol ub le g l ucose 0152

41121431915018652130Purity ofw ater -s ol ub le pachy m aran 38143

48126491587010467102C on t en t of w ater -sol ub l e pachy m aran

0121241492612745115431421014

第10期龚志华等:辐照降解茯苓多糖效应研究文献[15-16]表明壳聚糖经C -射线10~450kGy 剂量辐照后,黏度减小,产物相对分子质量随着辐照剂量的增大而降低。由此推测,本文中茯苓多糖经辐照后,水溶性多糖含量增加,产物的物理、化学性质有所改变,这主要是因为不同辐照使茯苓多糖发生不同程度的降解,剂量越大,产物的相对分子质量越小,越易溶于水,从而导致经不同辐照剂量处理后,引起水溶性茯苓多糖含量不同的结果。213 不同剂量辐照处理的茯苓多糖紫外吸收光谱分析

实验发现,随着辐照剂量的增加,茯苓固体颜色不断加深,其水溶液颜色变化趋势更加明显。有研究表明,壳聚糖降解生成有色产物的原因是降解过程中生成了碳氧双键

[17]

。图3 不同辐照剂量处理的茯苓多糖的紫外-可见光谱图F i g 13 UV spec tra o f pachym aran under different C -irrad i ated doses 1.CK ,2.600kCy , 3.800kCy ,

4.1000kCy ,

5.1200kC y 从图3可知,0、600、800kGy 处理的茯苓多糖水溶

液在近紫外区低波长的吸收强度最大,这可能是含杂原

子的双键或三键化合物n y P ﹡跃迁的吸收带[18]。与对照

组相比,经600、800、1000、1200kGy 处理的茯苓多糖

水溶液在263、268nm 处均出现吸收峰,因该峰均为羰基

吸收峰,说明经600、800、1000、1200kGy 处理后,茯

苓多糖分子结构中出现羰基基团,其分子结构发生断裂。

同时,1000kGy 与1200kGy 处理的羰基吸收峰比600、

800kGy 处理的羰基吸收峰明显,说明经600、800kGy 处

理的茯苓多糖降解生成的羰基量较少,而1000、1200

kGy 处理的茯苓多糖降解生成的羰基量较多,这与不同剂

量辐照处理的茯苓水溶性糖含量结果相吻合。214

不同剂量辐照处理的茯苓多糖红外光谱分析

图4 不同辐照剂量处理的茯苓多糖红外光谱图F i g 14 Infrared spectra o f pachym aran under d ifferent C -irradiated doses 图4为茯苓多糖的红外光谱图,谱图显示该糖具有

一般多糖类物质在红外光谱图中的特征性结构:

3393c m -1为O )H 伸缩振动出现强而宽的吸收谱带;

2920c m -1为饱和C )H 伸缩振动出现的吸收峰,与

1425c m -1处出现的峰综合表明有)C H 2)和)C H 3基

团存在;1641c m -1为伯酰胺与氢键缔和态的吸收带;

1371c m -1是)C H (C H 3)2振动耦合使对称弯曲振动裂

分的一条谱带;1161c m -1是C )O )C 伸缩振动的特征

吸收峰;1076c m -1和1036c m -1是含氧化合物C )O 键

伸缩振动的吸收峰,结合第一峰区O )H 的伸缩振动,

可进一步判断茯苓多糖具有糖类物质的特征性结构。

889c m -1处的吸收峰可确定茯苓多糖的糖苷键类型为B -糖苷键。

由图4可见,辐照降解前后茯苓多糖在一般糖类物质的特征吸收峰处均有明显的红外吸收,不同之处在于辐照后1726c m -1处出现新吸收峰,1161c m -1处的C )O )C 吸收峰强度有所变化,且1726c m -1和1161c m -1处的吸收峰在不同辐照剂量下存在差异。经600kGy 剂量辐照后,茯苓多糖在1726c m -1处有明显的吸收峰,800、1000kGy 剂量处理的茯苓多糖在1726c m -1处的吸收峰依次增强,1200kGy 剂量下吸收峰增强趋势不明显。同时,经600、800、1000、1200kGy 剂量辐照后的茯苓多糖,其在1161c m -1处的C )O )C 吸收峰随着辐照剂量增加强度变弱。其中1726c m -1为C

O 在第三峰区的特征吸收峰,表明茯苓多糖经辐照处理后有含羰基化合物生成。根据辐照前后1726c m -1和1161c m -1处吸收峰的变化推测,羰基结构的生成是由于C )O )C 糖苷键断裂所致,说明一定剂量辐

照使茯苓多糖发生了降解,其相对分子质量减小,此结果与糖苷键的断裂引发壳聚糖的辐射降解一致[19]。因此,不同剂量辐照处理的茯苓多糖红外吸收光谱与紫外光谱分析结果均表明茯苓多糖经辐照处理后,糖苷键发生断裂,生成羰基类化合物,并使水溶性总糖与水溶性多糖的含量显著高于对照品的含量(见表1)。1015

1016

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3结论

茯苓是一种资源丰富且多糖含量极高的药食两用植物,但由于其多糖是一类分子结构结合紧密的大分子物质,很难进行降解反应和生物利用,大大局限了茯苓资源的开发利用。研究结果表明,以不同剂量辐照茯苓原料后,茯苓多糖发生了物理表征与化学结构变化,水溶性糖含量显著增加,并呈剂量性地裂解为含羰基类化合物的相对分子质量较小的物质,为其生物酶促降解提供了一种极为有力的预处理方法。其辐照降解机理可能是在高能射线作用下,茯苓多糖中的B-(1y3)-D-葡聚糖共价键与非共价键部分被打断或打开,降解为含有羰基且相对分子质量较小的水溶性物质。王在贵等[9]分别对木聚糖酶、纤维素酶和B-葡聚糖酶降解茯苓多糖的能力作了研究,邱绿琴等[8]采用体积排阻色谱法测定茯苓多糖降解产物的相对分子质量,刘钢等[20]对影响中药多糖作用的因素进行了探讨。但从已有文献来看,辐照降解产物的定性定量分析、同一原料下的辐照降解与B-葡聚糖酶降解的效果比较、不同辐照剂量下组织结构形态的演变模型和评价辐照裂解效果以及辐照降解产物的安全性评价等方面,尚有待于进一步的深入研究。

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