Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)使用说明
Westernblot试剂配制及操作流程
Westernblot试剂配制及操作流程Western-Blot操作流程试剂配制1.RIPA裂解液：10mM Tris（，）1%NP40%TritonX-100%脱氧胆酸钠2 mM EDTA1 mM PMSF20%⽢油调pH值⾄。
混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。
使⽤时，加⼊蛋⽩酶抑制剂cooktail。
制胶⽤（1-6）：1.L Tris·HCl （）Tris 12.114g蒸馏⽔ 100ml溶解后，（⽤浓盐酸调pH⾄），室温下保存。
2.L Tris·HCl（）Tris 18.671g蒸馏⽔ 100ml溶解后，（⽤浓盐酸调pH⾄），室温下保存。
3.10％SDSSDS 10g蒸馏⽔⾄ 100ml如溶解困难，可在50℃⽔浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，⽔浴溶化后，仍可使⽤。
4.10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺蒸馏⽔ 1ml（现⽤现配，可先将过硫酸胺⼲粉称好分量后放在管中，⼀次性多装⼏管，使⽤时加⼊蒸馏⽔⽔即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）5．四甲基⼄⼆胺原液（TEMED）： 4?C保存。
6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。
10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据⾃⼰所做蛋⽩的⼤⼩确定依次加⼊去离⼦⽔30%丙烯酰胺 5ml1.5M Tris-HCl（）10%SDS 150µl10%AP 150µlTEMED 6µl每加⼀种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加⼤，根据实验当时的温度适当调整，加⼊TEMED混匀后应即刻灌胶。
灌胶后加异丙醇（1ml）消泡5%上层胶（两块胶，6ml）：依次加⼊去离⼦⽔30%丙烯酰胺 1ml1M Tris-HCl（）10%SDS 60µl10%AP 60µlTEMED 6µl每加⼀种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加⼤，根据实验当时的温度适当调整，加⼊TEMED混匀后应即刻灌胶。
Western及IP细胞裂解液
Western及IP细胞裂解液产品简介：多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，譬如Triton、SDS、NP-40等。
Western及IP 细胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞，并获得总蛋白的裂解液。
所获得的蛋白质可以用于SDS-PAGE，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris、Triton X-100组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。
用Western及IP细胞裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用leagene BCA蛋白浓度测定试剂盒(PT0001测定蛋白浓度。
由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不宜用Bradford法测定由Western及IP细胞裂解液获得的样本的蛋白浓度。
产品组成：主要成分：主要由 Tris-HCl、NaCl、Triton X-100，以及sodium pyrophosphate、β-glycerophosphate、EDTA等多种蛋白酶抑制剂组成。
自备材料：1、高速离心机2、微量移液器3、PMSF，亦可采购Leagene的苯甲基磺酰氟溶液(PMSF,100mmol/L)(PI0011)操作步骤（仅供参考）：(一)贴壁培养细胞1、取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀后，使用前取适当量的裂解液加入PMSF，使其最终浓度为1mM。
2、去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
3、按照6孔板每1孔加入100～200μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。
移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。
通常裂解液作用于细胞1～5s内，细胞就会被裂解。
4、10000～12000g，离心3～5min（如果用冷冻离心机4℃离心效果更佳），取上清。
SDS裂解液使用说明书
SDS 裂解液 SDS 裂解液是一种比较强烈的细胞组织裂解液。SDS 裂解液裂解得到的蛋白样品可用于
常规的 Western、免疫共沉淀等。其主要成分为 Tris-HCl(pH8.5)及 SDS 等，不含蛋白酶抑 制剂及磷酸酶抑制剂，需根据具体使用情况额外添加。由于其中含有较高浓度的去垢剂，不 能用 Bradford 法测定样品的蛋白浓度；需使用 BCA 进行蛋白浓度测定。
注意事项 1 裂解样品的所有步骤都需在冰上或 4℃进行。 2 不同的细胞需要加入的裂解液的量可能会不同，需要根据具体条件进行条件筛选；
温馨提示 为了您的自身安全，使用试剂前，请做好防护，如穿实验服，带手套等。 储存温度 4℃保存，如果长期不适用，建议保存于-20℃。
包装清单 货号
HCY015
品名 SDS 裂解液
wwwhzhxbiocom相关产品hcy009hcy011hcy012hcy216hcy015hcy017hcy018产品名称ripasds裂解western及ip胞裂解液western及ip胞裂解液无抑制有效裂解成分1tritonx1001脱氧胆酸钠01sds1np4005脱氧胆酸钠01sds1np40025脱氧胆酸钠1np401sds1tritonx1001tritonx100裂解强度温和温和温和温和对膜蛋白提取很好较好一般一般很好一般一般对浆蛋白提取很好很好很好很好很好很好很好对核蛋白提取很好较好较好较好很好较好较好主要用途wbipwbipwbipcoipwbipcoipwbchipwbipcoipwbipcoip
剂) 1% Triton X-100
温和 一般
很好
较好
WB, IP, co-IP
2
强 很好
很好
很好
WB, IP
SDS裂解液使用说明书
温和 一般
很好
较好
WB, IP, co-IP
2
实验流程 试剂准备：取适量的裂解液，使用前加入相应量的蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂 cocktail。 一. 贴壁细胞 1. 弃培养基，用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，将培养皿置于冰上； 2. 在 100mm 平皿中，加入 1mL 预冷的裂解液（4℃），对于其他的平皿，应加入相应体积的 裂解液； 3. 冰上孵育 1-2sec 后，细胞就会被裂解。如果用于免疫共沉淀，初步裂解后需在冰浴上继 续裂解 10min。 4. 在 4℃下，14000g 离心 10min，取上清，即可进行后续操作或保存于-80℃。 二. 悬浮细胞 1. 480g 离心 10min，收集细胞，弃上清； 2. 用冰上预冷的 PBS 小心洗涤细胞 2 次。将洗涤的细胞沉淀置于冰上； 3. 1~5×107 cells 需要加入 1mL 预冷的裂解液（4℃）； 4. 冰上孵育 1-2sec 后，细胞就会被裂解。如果用于免疫共沉淀，初步裂解后需在冰浴上继 续裂解 10min。 5. 在 4℃下，14000g 离心 10min，取上清，即可进行后续操作或保存于-80℃。 三. 组织样品 1. 把组织剪切成细小的碎片； 2. 按照每 20mg 组织加入 150-250µL 裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当 添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)； 3. 将样品置于冰上，用匀浆器匀浆，直至充分裂解； 4. 在 4℃下，14000g 离心 10min，取上清，即可进行后续操作或保存于-80℃。
杭州昊鑫生物科技股份有限公司
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SDS 裂解液
SDS 裂解液 SDS 裂解液是一种比较强烈的细胞组织裂解液。SDS 裂解液裂解得到的蛋白样品可用于
P0013 Western及IP细胞裂解液
是
是
是
是
含磷酸酯酶抑
主要用途
WB, IP,co-IP
WB, IP
WB, IP
WB, IP, co-IP WB, IP,co-IP WB, ChIP
¾ 用于普通的Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液(P0013)，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使
deoxycholate
1% NP-40
1% SDS
裂解强度
温和
强
中
温和
温和
强
对膜蛋白的提取
一般
很好
较好
一般
一般
很好
对胞浆蛋白的提取
很好
很好
很好
很好
很好
很好
对核蛋白的提取
较好
很好
较好
较好
较好
很好
胞浆磷酸化蛋白提取 很好
很好
很好
很好
很好
很好
细胞核转录因子提取 很好
很好
很好
很好
很好
很好
含蛋白酶抑制剂
是
是
¾ 用Western及IP细胞裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/ P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不能用Bradford法测定由本裂解液裂 解得到样品的蛋白浓度。
Western 裂解液
使用说明：
对于培养细胞样品： 1. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。 2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6
2. Cheng BQ, Geng Y, Wu JB, Jiang B. Influences of inhibiting Galectin-3 by RNA inter ference technique on the prolifer ation and apoptosis of human color ectal cancer cells LOVO. JournalofC linicalR ehabilitative Tissue E ngineering R esearch.April 22,2007 Vol.11,NO.16.
孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2 秒后，细胞就会被裂解。 对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解 液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/ 管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。 3. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。 裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入100微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量 到150微升或200微升。 对于组织样品： 1. 把组织剪切成细小的碎片。 2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。 3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高 浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。) 4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。 5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。 6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上
western blot试验操作指南
蛋白表达研究系列之——Western Blot试验操作指南目录目录 (1)一、总蛋白的提取 (2)1 试验类型和蛋白类型 (2)2 样品组织类型 (3)3 蛋白表达峰度判断 (4)4 总蛋白提取的基本步骤 (4)4.1细胞样品总蛋白的提取操作步骤 (5)4.2组织样品总蛋白的提取操作步骤 (5)二、总蛋白BCA定量 (6)三、SDS-PAGE凝胶电泳 (7)四、转膜 (8)五、信号增强剂处理膜 (9)六、封闭、一抗孵育、二抗孵育 (9)1 封闭 (9)2 一抗孵育 (9)3 二抗孵育 (13)七、曝光显色 (14)八、灰度分析 (15)九、抗体及相关溶液配制 (15)1 抗体 (17)2 相关溶液配制表 (17)蛋白检测相对于DNA/RNA的检测来讲要困难许多，Western Blot作为蛋白检测的经典方法短时间内仍然无法被取代。
Western Blot的原理并不复杂，网上有很多这方面的材料，这里不作过多的介绍。
虽然原理、操作并不复杂，但做好Western Blot、得到满意的图片并非易事。
其操作过程中涉及到：蛋白提取、电泳、转膜、杂交、显色、抗体的选择、试剂的选择、设备应用等诸多内容，其中每一个环节的差错对最后的试验结果都会产生不小的影响，最终导致试验失败。
很多同学都在抱怨自己的Western Blot没有信号、目的条带太弱、杂带太多、条带弯曲、泳道中有涂抹状背景等诸多问题，大部分情况都会最终把矛头指向抗体，认为这个抗体质量不好。
抗体质量肯定会对试验产生相当重要的影响，但绝不是全部。
你的操作方法可能是对的，但，是否合理、是否适合你的试验要求，你可能未必了解。
我们课题组Western Blot的任务量极重（每年ECL的用量都在5L以上），课题组里面的一些同学总是在不停的问我关于条件优化的问题，我不可能为每一个人找到问题的关键点，因此，写一份关于Western Blot的系统性材料非常有必要，希望你们可以针对自己的问题，自我分析、自我解决，这样也能锻炼你们独立解决问题的能力。
SDS裂解液使用说明书
注意事项 1 裂解样品的所有步骤都需在冰上或 4℃进行。 2 不同的细胞需要加入的裂解液的量可能会不同，需要根据具体条件进行条件筛选；
温馨提示 为了您的自身安全，使用试剂前，请做好防护，如穿实验服，带手套等。 储存温度 4℃保存，如果长期不适用，建议保存于-20℃。
包装清单 货号
HCY015
品名 SDS 裂解液
杭州昊鑫生物科技股份有限公司
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SDS 裂解液
SDS 裂解液 SDS 裂解液是一种比较强烈的细胞组织裂解液。SDS 裂解液裂解得到的蛋白样品可用于
常规的 Western、免疫共沉淀等。其主要成分为 Tris-HCl(pH8.5)及 SDS 等，不含蛋白酶抑 制剂及磷酸酶抑制剂，需根据具体使用情况额外添加。由于其中含有较高浓度的去垢剂，不 能用 Bradford 法测定样品的蛋白浓度；需使用 BCA 进行蛋白浓度测定。
剂) 1% Triton X-100
温和 一般
很好
较好
WB, IP, co-IP
2
强 很好
很好
很好
WB, IP
HCY011 RIPA 裂 解液(中)
1% NP-40, 0.5%脱氧 胆酸钠, 0.1% SDS
中 较好
很好
较好
WB, IP
HCY012 RIPA 裂 解液(弱)
1% NP-40, 0.25%脱 氧胆酸钠
温和 一般
很好
较好
WB, IP, co-IP
HCY216 NP-40 裂
说明书
包装 100mL
1份
1
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相关产品 产品名称
有效裂解 成分
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Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)使用说明
货号：LS00160
规格：100mL
保存：-20℃保存，12个月。
产品说明：
多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，如Triton、SDS、NP-40等，Western及IP细胞裂解液是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞，并获得总蛋白的裂解液。
所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris-HCl、NaCl、低浓度Triton X-100，低浓度sodium pyrophosphate等组成，不含蛋白酶、磷酸酶抑制剂，并维持原有的蛋白间相互作用。
用Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)(Cell lysis buffer for Western and IP without inhibitors)得到的蛋白，可以用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不宜用Bradford法测定由Western及IP细胞裂解液获得样本的蛋白浓度。
操作步骤(仅供参考)：
(一)贴壁培养细胞
1、取Western及IP细胞裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制
剂。
2、去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，
留取沉淀。
3、按照6孔板每孔加入100～200µL裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。
移液
器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。
通常裂解液作用于细胞1～5s内，细胞就会被裂解。
4、10000～12000g，离心3～5min(如果用冷冻离心机4℃离心效果更佳)，取上清。
5、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)悬浮培养细胞
1、取Western及IP细胞裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制
剂。
2、低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
3、用手指轻弹细胞，使其松散。
按照6孔板每孔细胞加入100～200µL裂解液的比例，
加入Western及IP细胞裂解液。
通常6孔板每孔细胞加入100µL裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150～200µL，再用手指轻弹以充分裂解细胞。
充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
4、10000～12000g，4℃离心3～5min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
5、进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀等操作。
(三)组织样本
1、取Western及IP细胞裂解液置于室温溶解混匀，根据实验需要选择添加或不添加蛋
白酶抑制剂。
2、把组织剪切成细小的碎片，越小越好。
3、取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量
控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
4、按照每20mg组织加入100～200μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。
冰上或
4℃裂解30～60min。
5、步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入100～200µL裂解液的比例加入
Western及IP细胞裂解液。
用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，过程尽量
控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
6、按照每20mg组织加入100～200µL裂解液的比例，加入Western及IP细胞裂解液。
7、10000～12000g，4℃离心10～15min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
8、进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事项：
1、去除贴壁细胞的培养液时，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。
2、如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适
当减少裂解液的用量。
3、如果细胞量较多，必需分装成50～100万细胞/离心管，然后再裂解。
大团的细胞较
难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
4、如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈
Vortex使样品裂解充分。
然后同样离心取上清，用于后续实验。
直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
5、溶解Cell lysis buffer for Western and IP时，应尽量缩短溶解时间，避免裂
解液中的有效成分失效。
6、细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或4℃进行。