酪蛋白的提取与测定
酪蛋白的提取与测定
牛乳中酪蛋白得制备与浓度测定一、实验目得1、学习从牛乳中分离酪蛋白得原理与方法２、掌握等电点沉淀法提取蛋白质得方法3、了解紫外吸收法测定蛋白质浓度得原理,熟悉紫外分光光度计得使用4、学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度二、实验原理1、准备酪蛋白原理:牛乳中主要含有酪蛋白与乳清蛋白两种蛋白质,其中酪蛋白占了牛乳蛋白质得80%、牛乳在PH４。
7时酪蛋白等电聚沉后剩余得蛋白质统称为乳清蛋白、酪蛋白就是白色、无味得物质,不溶于水、乙醇等有机溶剂,但溶于碱溶液。
乳清蛋白不同于酪蛋白,其粒子得水与能力很强,分散性高,在乳中呈高分子状态。
本法利用等电点时溶解度最低得原理,将牛乳得PH调至4。
７时,酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后便可得到纯得酪蛋白。
2、紫外吸收法测定蛋白质浓度得原理:大多数蛋白质由于有酷氨酸与色氨酸得存在,在紫外光280nm有吸收高峰,可以进行蛋白质含量得测定。
但就是核酸在２80nm也有吸收,干扰测定,不过核酸得最大吸收峰在２６0nm,通过测定在28０nm与260ｎｍ时Ａ得比值,然后通过计算消除核酸存在得影响,可以求得有核酸存在时蛋白质得浓度。
3、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度原理:考马斯亮蓝能与蛋白质得疏水微区相结合,这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝Ｇ250得磷酸溶液呈棕红色,最大吸收峰在465nm、当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色,其最大吸收峰改变为5９5nｍ,考马斯亮蓝G２5０—蛋白质复合物得高消光效应导致了蛋白质定量测定得高敏感度。
在一定范围内,考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后,在595nm下,吸光度与蛋白质含量呈线性关系,故可以用于蛋白质浓度得测定。
三、实验器材与试剂1、制备酪蛋白:烧杯、玻璃棒、量筒、精密PH试纸、离心机、布氏漏斗、表面皿、恒温水浴锅牛奶、醋酸缓冲液、冰醋酸、9５%乙醇、无水乙醚２、紫外光吸收法:紫外可见光分光光度计、容量瓶50ml(×1)、石英比色皿0.9％NaＣl、1ｍoｌ／LNaOH溶液、1ｍol/Ｌ乙酸溶液3、考马斯亮蓝法:紫外可见光分光光度计、试管1．5cm×１5cm(×9)、玻璃比色皿牛血清白蛋白(0.1ｍg／ｍl)、考马斯亮蓝、0。
酪蛋白的制备_实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解酪蛋白的基本性质和来源。
2. 掌握从牛奶中提取酪蛋白的原理和方法。
3. 学会等电点沉淀法提取蛋白质。
4. 了解酪蛋白的纯化过程。
二、实验原理酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质，占牛奶蛋白质总量的80%左右。
酪蛋白是一种含磷蛋白质，其等电点为4.7。
在等电点时，酪蛋白的溶解度最低，因此可以通过调节牛奶的pH值至4.7，使酪蛋白沉淀出来。
然后通过离心、洗涤、干燥等步骤，可以得到纯酪蛋白。
三、实验材料与试剂1. 材料：新鲜牛奶、95%乙醇、无水乙醚、0.2mol/L pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液。
2. 试剂：A液（0.2mol/L醋酸钠溶液）、B液（0.2mol/L醋酸溶液）、乙醇-乙醚混合液。
四、实验步骤1. 准备0.2mol/L pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液：取A液1770ml，B液1230ml混合即得。
2. 取100mL新鲜牛奶，加热至40℃，在搅拌下慢慢加入预热至40℃的醋酸-醋酸钠缓冲液100mL。
3. 用精密pH试纸或pH计调节pH值至4.7。
4. 将上述悬浮液冷却至室温，离心15分钟，弃去清液，得到酪蛋白粗制品。
5. 用水洗涤沉淀3次，每次加入50mL水，离心10分钟，弃去上清液。
6. 在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌，悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。
7. 用乙醇-乙醚混合液清洗沉淀2次，每次加入50mL混合液，离心10分钟，弃去上清液。
8. 最后用乙醚清洗沉淀2次，抽干。
9. 将沉淀风干，得到纯酪蛋白。
五、实验结果与分析通过上述实验步骤，我们成功从牛奶中提取了纯酪蛋白。
实验过程中，我们发现以下几点：1. 在调节pH值至4.7时，酪蛋白开始沉淀，此时溶液变得浑浊。
2. 离心过程中，酪蛋白沉淀逐渐沉淀到离心管底部。
3. 在洗涤过程中，沉淀物逐渐变得纯净，颜色由白色变为淡黄色。
4. 通过乙醇、乙醚洗涤，沉淀物进一步纯化，颜色变为淡黄色。
六、实验总结本次实验我们成功从牛奶中提取了纯酪蛋白，掌握了等电点沉淀法提取蛋白质的方法。
牛奶酪蛋白实验报告
一、实验目的1. 学习从牛奶中提取酪蛋白的原理和方法。
2. 掌握等电点沉淀法提取蛋白质的操作步骤。
3. 了解蛋白质的颜色反应及其原理。
4. 鉴定提取的酪蛋白。
二、实验原理牛奶是一种复杂的胶体溶液，其中含有多种蛋白质，其中酪蛋白是其主要成分之一。
酪蛋白是一种含磷蛋白质，其等电点为4.7。
在等电点时，酪蛋白的溶解度最低，因此可以通过调节牛奶的pH值至等电点，使酪蛋白沉淀出来。
此外，蛋白质具有多种颜色反应，如缩二脲反应、蛋白黄色反应和茚三酮反应等，可以通过这些反应来鉴定蛋白质。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：新鲜牛奶、脱脂牛奶、离心机、烧杯、温度计、pH计、精密pH试纸等。
2. 实验试剂：95%乙醇、无水乙醚、0.2mol/L pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液、稀醋酸溶液、硝酸等。
四、实验步骤1. 酪蛋白的提取（1）取50mL脱脂牛奶于150mL烧杯中。
（2）用热水浴加热至40℃，维持此温度，边搅拌边加入稀醋酸溶液约2mL，观察现象。
（3）继续搅拌并使悬浊液冷却至室温。
（4）将混合物转入离心杯中，于3000r/min离心15min。
（5）离心完毕后，弃去清液，得到酪蛋白粗制品。
2. 酪蛋白的纯化（1）将酪蛋白粗制品用水洗涤3次，离心10min，弃去上清液。
（2）在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌。
（3）将悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。
（4）用乙醇-乙醚混合液清洗沉淀2次。
（5）最后用乙醚清洗沉淀2次，抽干。
3. 酪蛋白的鉴定（1）缩二脲反应：取少量酪蛋白沉淀，加入适量的Cu2+溶液，观察颜色变化。
（2）蛋白黄色反应：取少量酪蛋白沉淀，加入适量的硝酸，加热，观察颜色变化。
（3）茚三酮反应：取少量酪蛋白沉淀，加入适量的茚三酮，共热，观察颜色变化。
五、实验结果与分析1. 酪蛋白的提取：在实验过程中，观察到牛奶中加入稀醋酸溶液后，出现白色沉淀，表明酪蛋白已经沉淀出来。
2. 酪蛋白的纯化：通过乙醇洗涤、抽滤和乙醚洗涤，得到较为纯净的酪蛋白沉淀。
酪蛋白提取实验报告
酪蛋白提取实验报告酪蛋白提取实验报告引言：酪蛋白是一种重要的蛋白质成分，存在于牛奶等乳制品中。
本实验旨在通过提取酪蛋白，探索其在食品工业和医药领域的应用潜力。
通过实验过程的详细描述和结果的分析，我们将深入了解酪蛋白提取的方法和效果。
实验材料与方法：1. 材料：牛奶、氯化钙、硫酸、酒精、磷酸盐缓冲液等。
2. 方法：a. 酪蛋白的沉淀：将牛奶加热至80°C，加入少量氯化钙搅拌，冷却后加入硫酸沉淀酪蛋白。
b. 酪蛋白的溶解：将酪蛋白沉淀加入磷酸盐缓冲液，搅拌溶解。
c. 酪蛋白的纯化：将溶解的酪蛋白加入酒精，离心沉淀，去除杂质。
实验过程：1. 酪蛋白的沉淀：将适量牛奶加热至80°C，加入少量氯化钙搅拌，冷却后加入硫酸，酪蛋白逐渐沉淀。
2. 酪蛋白的溶解：将沉淀后的酪蛋白加入磷酸盐缓冲液，搅拌溶解，形成均匀的溶液。
3. 酪蛋白的纯化：将溶解的酪蛋白加入酒精，离心沉淀，去除杂质，得到纯净的酪蛋白。
实验结果与讨论：通过实验，我们成功地提取到了酪蛋白，并进行了初步的纯化。
在实验过程中，我们观察到牛奶在加热后出现了沉淀，这是因为加热使酪蛋白发生凝聚而形成的。
随后，我们通过加入磷酸盐缓冲液将酪蛋白溶解，得到了均匀的溶液。
最后，通过加入酒精并进行离心，我们成功地去除了酪蛋白溶液中的杂质，得到了纯净的酪蛋白。
酪蛋白作为一种重要的蛋白质成分，具有广泛的应用潜力。
在食品工业中，酪蛋白可用于制作奶酪、酸奶等乳制品，增加其营养价值和口感。
此外，酪蛋白还可以作为食品添加剂，提高食品的稳定性和质感。
在医药领域，酪蛋白具有抗菌、抗病毒等生物活性，可以应用于药物的载体材料和生物医学领域。
然而，本实验中的提取方法仅是初步的纯化过程，酪蛋白的纯度还有待进一步提高。
在实际应用中，需要根据具体需求选择更加精细的提取和纯化方法，以获得更高纯度的酪蛋白。
此外，酪蛋白的稳定性也需要进一步研究，以确保其在不同环境条件下的应用效果。
酪蛋白的提取与定性鉴定
酪蛋白的提取与定性鉴定酪蛋白的提取与定性鉴定摘要牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白含量约为35g/L，本实验以市面上出售的伊利纯牛奶为原料进行酪蛋白的提取。
酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。
利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的PH调至４.７时，酪蛋白就会沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后，便可得到较纯的酪蛋白。
利用显色反应对所提取的酪蛋白进行定性鉴定，结果发现它能与双缩脲反应生成紫红色化合物；与印三酮反应生成蓝紫色物质；与浓硝酸发生黄色反应，在碱性溶液中进一步形成深黄色的硝醌酸钠。
关键词酪蛋白提取定性鉴定双缩脲反应茚三酮反应黄色反应牛奶对人体有很多好处，可以促进心血管的健康，控制高血压，增强免疫机能，还能改善睡眠状况，对人类有很大的益处。
而牛奶的主要成分是酪蛋白，所以我们去提纯分析牛奶中酪蛋白的含量很有意义，可以此来初步判断市场销售牛奶的质量。
另外，通过对提取的酪蛋白进行定性鉴定，可以了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式，知道其与某些氨基酸的呈色反应原理，并学习常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
1材料和方法1.1材料伊利纯牛奶（从超市购得）离心机抽滤装置（布氏漏斗）精密pH试纸电炉电子称烧杯试管移液管玻璃棒滤纸温度计药匙锥形瓶1.2酪蛋白的提取取两个锥形瓶，分别放入50mL牛奶和50mL醋酸缓冲液，在水浴锅中加热至40℃。
在搅拌下慢慢将两者混合。
用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。
将上述悬浮液冷却至室温。
离心15分钟（3000r/min），弃去上清夜，得酪蛋白粗制品。
用蒸馏水洗沉淀3次，每次离心10分钟（3000r/min），弃去上清液。
在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。
用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2 次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。
将沉淀摊开在表面皿上，风干；得到酪蛋白纯品。
准确称重，计算含量和得率。
含量：酪蛋白g/100mL 牛乳（g%）得率：测得含量/理论含量X100%1.3双缩脲反应取少量尿素结晶，放在干燥试管A中。
酪蛋白的提取与测定
牛乳中酪蛋白的制备与浓度测定一、实验目的1、学习从牛乳中分离酪蛋白的原理和方法2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法3、了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理，熟悉紫外分光光度计的使用4、学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度二、实验原理1、准备酪蛋白原理：牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。
牛乳在PH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称为乳清蛋白。
酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。
乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水和能力很强，分散性高，在乳中呈高分子状态。
本法利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的PH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。
2、紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理：大多数蛋白质由于有酷氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有吸收高峰，可以进行蛋白质含量的测定。
但是核酸在280nm也有吸收，干扰测定，不过核酸的最大吸收峰在260nm，通过测定在280nm和260nm时A的比值，然后通过计算消除核酸存在的影响，可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。
3、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度原理：考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。
在一定范围内，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。
三、实验器材与试剂1、制备酪蛋白：烧杯、玻璃棒、量筒、精密PH试纸、离心机、布氏漏斗、表面皿、恒温水浴锅牛奶、醋酸缓冲液、冰醋酸、95%乙醇、无水乙醚2、紫外光吸收法：紫外可见光分光光度计、容量瓶50ml(×1)、石英比色皿0.9%NaCl、1mol/LNaOH溶液、1mol/L乙酸溶液3、考马斯亮蓝法：紫外可见光分光光度计、试管1.5cm×15cm(×9)、玻璃比色皿牛血清白蛋白（0.1mg/ml）、考马斯亮蓝、0.9%NaCl四、实验步骤制备酪蛋白1、将20mL pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃2、将20mL牛奶加热至40℃，在搅拌下缓慢地加入20mL预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3、用精密pH试纸调pH至4.7，可见溶液变为乳白色悬浮液4、待悬浮液冷却至室温，4000rpm离心5min，弃上清，得酪蛋白粗制品5、用蒸馏水洗沉淀3次，3000rpm离心5min，弃上清6、在沉淀中加入20mL95％乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤7、用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀2次（10ml/次），最后用乙醚洗涤沉淀2次（10ml/次），抽干8、将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品9、准确称量，计算含量和得率紫外光吸收法1．取待测样品溶液置于的石英比色皿中，于分光光度计波长280nm和260nm，分别读取A280nm和A260nm，用生理盐水为比色空白对照。
牛奶中提取酪蛋白的实验报告
牛奶中提取酪蛋白的实验报告牛奶中提取酪蛋白的实验报告一、引言牛奶是我们日常生活中常见的饮品，而酪蛋白则是牛奶中的重要营养成分之一。
酪蛋白是一种高质量的蛋白质，对人体具有重要的营养和生理功能。
提取牛奶中的酪蛋白并对其进行实验分析具有重要的理论和应用意义。
本文将从实验方法、实验步骤、实验结果以及个人理解等方面进行深入探讨。
二、实验目的本次实验的主要目的是通过简单的化学方法，从牛奶中提取酪蛋白，并对其进行分析和检测。
通过实验，我们旨在掌握酪蛋白的提取方法，加深对其性质和结构的理解，同时培养实验操作的能力和科学精神。
三、实验方法1. 实验仪器：酪蛋白提取仪、离心机、紫外-可见分光光度计等。
2. 实验试剂：硫酸、乙醇、盐酸、酚酞指示剂等。
3. 实验步骤：（1）取适量牛奶，加入盐酸搅拌，使牛奶凝固。
（2）用离心机离心，将凝固的混合物分离。
（3）将分离得到的固体与乙醇反复洗涤。
（4）用酚酞指示剂检测酪蛋白。
四、实验结果通过实验操作，我们成功地从牛奶中提取得到了酪蛋白的固体物质，并经过乙醇洗涤后，得到了较纯净的酪蛋白样品。
经过紫外-可见分光光度计检测，酪蛋白在特定波长下呈现出明显的吸收峰，证明其成功提取。
经过比色法测定，我们得到了酪蛋白的溶液浓度，为XX mg/L。
五、个人理解通过本次实验，我深刻理解了酪蛋白在牛奶中的提取方法和技术，并对其在生物学和营养学领域的重要作用有了更加深入的认识。
酪蛋白的提取实验也启发我对科学研究的兴趣，我希望能在未来的学习和实验中进一步探索酪蛋白的性质和功能，为人类健康和营养贡献自己的一份力量。
六、总结本次实验通过从牛奶中提取酪蛋白的过程，让我们更加直观地了解了酪蛋白的存在和特性。
实验结果也验证了酪蛋白的成功提取，并为我们以后的相关研究提供了基础和参考。
希望通过今后的努力，能进一步挖掘和应用酪蛋白这一珍贵的营养成分。
在本文中，我们根据提供的内容和主题，详细介绍了牛奶中提取酪蛋白的实验过程和结果，同时分享了个人对这一实验的理解和展望。
牛奶中酪蛋白的提取与分析
实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析实验材料：牛奶小组成员：实验时间：一：实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析二：报告撰写者三、小组成员实验仪器 温度计、布氏漏斗（*）、pH 试纸（*）、抽滤瓶（*）水浴锅、烧杯、量筒、表面皿（*）、电子天平（*）、2个1000ml 的容量瓶（*）、2张醋酸纤维薄膜（2cm ×8cm 厚度120nm ）成品（*）、培养皿9—10cm （*）、毛细管（*）、尺子、铅笔、单面刀片（*）、镊子、普通滤纸（*）、电泳槽、玻璃板8cm ×12cm （*）、752型分光光度计（*）、细布（*）0.5ml 、1.0ml 、2.0ml 、5.0ml 的移液管、试管、试管架、 四、实验材料牛奶（蒙牛特仑苏和伊利金典） 五、实验试剂 特仑苏400ml 、金典200ml 、1.66g 巴比妥（*）、12.76g 巴比妥钠（*）、0.5g 氨基黑10B （*）、50ml 甲醇AR （*）、100ml 冰醋酸AR （*） 、95%的乙醇250ml （*)、95%的乙醚100ml （*）、0.2mol/L 的乙酸100ml （*）、0.2mol/L 的乙酸钠100ml （*）、25g 氢氧化钠固体（*）标准酪蛋白、15mg 五水硫酸铜（*）、60mg 酒石酸钾钠（*） 所需试剂配制方法：乙醇乙醚混合液的配制： 10ml95%的乙醇10ml95%的乙醚乙醇钠缓冲液的配制： 0.2mol/L 的乙酸51ml0.2mol/L 的乙酸钠49ml 巴比妥钠缓冲液的配制： 巴比妥1.66g巴比妥钠12.76g染色液的配制： 0.5g 氨基黑10B 50ml 甲醇AR 10ml 冰醋酸AR 漂洗液的配制： 45ml95%乙醇AR 5ml 冰醋酸AR 蒸馏水透明液的配制： 25ml 的冰醋酸AR 75ml 的无水乙醇AR0.05mol/L 氢氧化钠溶液的配制： 16g 的氢氧化钠固体定容至1000ml 10%氢氧化钠溶液的配制： 5g 的氢氧化钠固体定容至50ml 双缩脲试剂的配制：15mg 五水硫酸铜60mg 酒石酸钾钠标准酪蛋白溶液A 的配制（10mg/ml ）： 用0.05mol/L 氢氧化钠溶液配制10ml从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液1、2的配制（2-9mg/ml ）：配制巴比妥钠缓冲液（pH8.6,0.06mol./L ）,将上述二者混合后定容于1000ml+40ml 蒸馏水，混匀既得染色液配制乙醇乙醚1:1的混合液配制pH4.6的乙酸钠缓冲液（0.2mol/l ）混匀得染色液混匀得透明液溶于5ml 蒸馏水，在搅拌情况下，加入10%氢氧化钠溶液3ml ，用蒸馏水稀释到10ml ，用棕色瓶避光保存用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制10ml标准酪蛋白溶液B的配制（1500μg/ml）：用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液3、4的配制（50-1500μg /ml）：用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制七、实验目的1.掌握从牛奶中提取酪蛋白的方法2.了解蛋白质分离纯化的基本办法3.学习电泳的基本原理及掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离酪蛋白的具体操作4.掌握双缩脲法和紫外吸收法测定蛋白质含量的原理及操作方法并比较两种方法5.熟悉分光光度计的原理和操作6.比较特仑苏与金典中的酪蛋白含量八、实验原理酪蛋白在其等电点时静电荷为零，同种电荷的相互排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调节到PH4.6，酪蛋白就可以从牛乳中分离出来。
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牛乳中酪蛋白得制备与浓度测定
一、实验目得
1、学习从牛乳中分离酪蛋白得原理与方法
２、掌握等电点沉淀法提取蛋白质得方法
3、了解紫外吸收法测定蛋白质浓度得原理,熟悉紫外分光光度计得使用
4、学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度
二、实验原理
1、准备酪蛋白原理:牛乳中主要含有酪蛋白与乳清蛋白两种蛋白质,其中酪蛋白占了牛乳蛋白质得80%、牛乳在PH４。
7时酪蛋白等电聚沉后剩余得蛋白质统称为乳清蛋白、酪蛋白就是白色、无味得物质,不溶于水、乙醇等有机溶剂,但溶于碱溶液。
乳清蛋白不同于酪蛋白,其粒子得水与能力很强,分散性高,在乳中呈高分子状态。
本法利用等电点时溶解度最低得原理,将牛乳得PH调至4。
７时,酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后便可得到纯得酪蛋白。
2、紫外吸收法测定蛋白质浓度得原理:大多数蛋白质由于有酷氨酸与色氨酸得存在,在紫外光280nm有吸收高峰,可以进行蛋白质含量得测定。
但就是核酸在２80nm也有吸收,干扰测定,不过核酸得最大吸收峰在２６0nm,通过测定在28０nm与260ｎｍ时Ａ得比值,然后通过计算消除核酸存在得影响,可以求得有核酸存在时蛋白质得浓度。
3、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度原理:考马斯亮蓝能与蛋白质得疏水微区相结合,这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝Ｇ250得磷酸溶液呈棕红色,最大吸收峰在465nm、当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色,其最大吸收峰改变为5９5nｍ,考马斯亮蓝G２5０—蛋白质复合物得高消光效应导致了蛋白质定量测定得高敏感度。
在一定范围内,考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后,在595nm下,吸光度与蛋白质含量呈线性关系,故可以用于蛋白质浓度得测定。
三、实验器材与试剂
1、制备酪蛋白:
烧杯、玻璃棒、量筒、精密PH试纸、离心机、布氏漏斗、表面皿、恒温水浴锅
牛奶、醋酸缓冲液、冰醋酸、9５%乙醇、无水乙醚
２、紫外光吸收法:
紫外可见光分光光度计、容量瓶50ml(×1)、石英比色皿
0.9％NaＣl、1ｍoｌ／LNaOH溶液、1ｍol/Ｌ乙酸溶液
3、考马斯亮蓝法:
紫外可见光分光光度计、试管1．5cm×１5cm(×9)、玻璃比色皿
牛血清白蛋白(0.1ｍg／ｍl)、考马斯亮蓝、0。
9%ＮaCl
四、实验步骤
制备酪蛋白
1、将20mL pH４。
７得醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃
２、将2０ｍＬ牛奶加热至４0℃,在搅拌下缓慢地加入20ｍL预热得ｐH4。
7得醋酸—醋酸钠缓冲液
3、用精密pH试纸调pＨ至4.7,可见溶液变为乳白色悬浮液
４、待悬浮液冷却至室温,400０ｒｐm离心5min,弃上清,得酪蛋白粗制品
5、用蒸馏水洗沉淀3次,3000rｐm离心5min,弃上清
6、在沉淀中加入20mＬ９5％乙醇,搅拌片刻,将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤
7、用乙醇—乙醚混合液洗涤沉淀2次(1０ml／次),最后用乙醚洗涤沉淀2次(1０mｌ/次),抽干
8、将沉淀摊开在表面皿上,风干,得酪蛋白纯品
９、准确称量,计算含量与得率
紫外光吸收法
１.取待测样品溶液置于得石英比色皿中,于分光光度计波长２80ｎm与260nm,分别读取A２8０nm与A2６0nm,用生理盐水为比色空白对照。
2.若A280nm/A２60nm>１、5,用公式:蛋白质含量(ｍg/ｍl)=A２8０nｍ／6、3＊1０
若A２80ｎm/Ａ2６０nｍ<1。
5,用公式:蛋白质含量(ｍg／ml)＝１．4５Ａ280nm —0。
7４Ａ260nm
考马斯亮蓝法
取９支干净试管,按表进行编号并加入试剂、
混匀,室温静置３miｎ,以第1管为空白,于波长５95nm处比色,读取吸光度,以吸光度为纵坐标,各标准液浓度(μg/mｌ)作为横坐标作图得标准曲线。
五、实验数据
酪蛋白质量:0.５421g
酪蛋白含量:２.7１g/１００ｍl牛乳
0．76９A A260nｍ0.９5９Ａ
紫外光吸收法:Ａ280
ｎm
Ａ280nm/Ａ２60ｎm<1。
5,蛋白质含量(mg/ml)=１。
４５A280
—０.７4Ａ
ｎm
=0、405mｇ/ml
260nm
蛋白质浓度为ﻬ。