葡萄酒研发中心第二小组实验方案啦啦啦

小学期酿酒实习实验方案

目录

实验题目 (1)

实验目的 (1)

实验原理 (1)

实验材料 (1)

需要提前配制的药品 (1)

实验时间安排 (3)

添加物相关资料 (3)

几种指标的测定方法 (6)

比重的测定 (6)

温度的测定 (7)

可溶性固形物的测定 (8)

测定PH (10)

酵母菌计数 (12)

葡萄糖的测定 (14)

果糖的测定 (15)

二氧化硫的测定 (16)

甲醛的测定 (17)

酒精的测定 (19)

思考 (22)

一、实验题目：20 L葡萄酒发酵罐酿造

二、实验目的：通过实验室小型酿造实验，让同学们在酿造葡萄酒的过程中，了解葡萄酒发酵的原理、工艺流程以及相关的检测方法，对葡萄酒的酿造过程有一个大致的了解。锻炼同学们的实际动手能力以及在实践中发现问题，考虑问题以及解决问题的能力。同时提高同学们学习专业知识的兴趣和热情，为下学期专业课的学习做好准备。

三、实验原理：

利用酵母对葡萄汁进行发酵，将葡萄糖和果糖转化为酒精，酿造成葡萄酒。

四、实验材料：

鲜葡萄、 20 L广口瓶1个、比重计、250毫升量桶、1000毫升烧杯、50毫升的离心管、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、白砂糖、摇瓶、亚硫酸、果胶酶若干、葡萄酒酵母粉、纱布、水浴锅、糖度计以及糖测定试剂盒等。

五、需提前配制的药品

碘标准溶液：称取130克碘及350克碘化钾，溶于少量水中然后置入10立升茶色磨口瓶内，加水稀释至10立升混匀待标。准确量取20ml－25ml碘液，加50ml水，30ml 0.1C(HCl)盐酸，摇匀，用 0.1 C(Na2S2O3)的N标准溶液滴定近终点（微黄色）时加30ml 0.5％淀粉指示剂，继续滴定至溶液兰色消失。准确稀释5倍。

淀粉指示液10 g/L，并加人40 g氯化钠：取1.0g 可溶性淀粉放入50mL烧杯，量取100mL蒸馏水，先用数滴把淀粉调至成糊状，再取约90mL水在电炉上加热至微沸时，倒入糊状淀粉，再用剩余蒸馏水冲洗50mL烧杯3次，洗液倒入烧杯，然后再加入1滴10%盐酸，微沸3分钟，加热过程中要搅拌。

氢氧化钠标准溶液：用邻苯二甲酸氢钾标定

标准缓冲溶液的配制:

1、苯二甲酸氢钾缓冲溶液

称取在温度110°C干燥箱烘干的分析纯苯二甲酸氢钾（KHC8H4O4)10.21克，溶于蒸馏水中，并稀释至1升，此溶液的PH

值为4.01（25°C)。

2、磷酸型缓冲溶液

称取在温度110°C干燥箱烘干二小时的分析纯磷酸二氢钾

（KH2PO4)3.40克和分析纯磷酸氢二钠（Nn2HPO4)3.55克，溶于脱除CO2 的蒸馏水中，并稀释至1升，此溶液的PH值为6.86（25°C）。

3、硼酸钠缓冲溶液

称取3.81克分析纯硼酸钠（Na2B4O7?10H2O)，溶于1升脱除CO2的蒸馏水中，此溶液的PH值为9.18（25°C)。

缓冲溶液储于硬质玻璃瓶或塑料瓶中，能稳定1～2个月

高锰酸钾-磷酸溶液（30g/L）：称取3g高锰酸钾，溶于15ml85%（质量分数）磷酸和70ml水中，溶解后，加水至100ml。贮于棕色瓶内，防止氧化能力下降，保存时间不宜过长。

草酸-亚硫酸溶液：称取5g无水草酸（H2C2O4）或7g含2分子结晶水草酸（H2C2O422H2O），溶于硫酸（1+1）中至100ml。

品红-亚硫酸溶液：称取0.1g碱性品红研细后，分次加入共

60ml80℃的水，边加入水边研磨使其溶解，用滴管吸取上层溶液虑于100ml容量瓶中，冷却后加入10ml亚硫酸钠溶液（100g/L），

1ml盐酸，再加水至刻度线，充分混匀，放置过夜，如溶液有颜色，可加少量活性炭搅拌后过滤，贮于棕色瓶中，置暗处保存，溶液呈红色时应弃去重新配制。

甲醇标准溶液：称取1.000g甲醇，置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于10g甲醇。置低温保存。

甲醇标准使用液：吸取10.0ml甲醇标准溶液，置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度。再取10.0ml稀释液置于50ml容量瓶中，加水至刻度，该溶液每毫升相当于0.50mg甲醇。

亚硫酸钠溶液：100g/L

六、实验时间安排

7.7. 9：00在食院240实验室集中：交实验方案，准备实验用品、配试剂。

7.8.

①准备发酵罐及发酵槽

②处理葡萄、调整葡萄汁等工作

③初发酵开始

④按要求的内容进行各种实验

7.9.-7.18. 继续初发酵。每日上午和下午各测一组、比重、PH和温度数据，每日上午或下午各测一组可溶性固形物、酵母菌计数、葡萄糖含量、果糖含量、SO2含量、甲醇含量、酒精度。

7.19-7.21.

①浸提、压榨、装瓶

②清洗、清单各种实验用品、打扫实验室

③以小组为单位制作汇报的PPT

7.22：总结交流会

七、添加物相关资料

二氧化硫：

二氧化硫处理就是在发酵基质中或在葡萄酒中加入适量的二氧化硫，以便发酵能顺利进行或有利于葡萄酒的贮存，有杀菌，澄清，抗氧，抑制多酚氧化酶活性增酸的作用

1二氧化硫的添加量：

1953年国际栽培与酿酒会议提出参考允许量：成品酒中总二氧化硫含量（mg/L）为：干白350，干红300，甜酒450。（我国规定为250mg/L）二氧化硫的具体添加量与葡萄品种，葡萄汁成分、温度存在的微生物和它的活力、酿酒工艺及时期有关。

2.SO2的使用量：干红葡萄酒：

①前处理阶段二氧化硫用量：质量状况好的葡萄，40~60mg/L（以总二氧化硫为准）；染有葡萄孢霉的葡萄，60~70mg/L(以总二氧化硫为准）；

②陈酿、后处理阶段二氧化硫用量：20~30mg/L（以游离二氧化硫为准）；

3、添加方式：一般常用市售亚硫酸试剂，使用浓度为5%~6%。

果胶酶的应用

（一）、葡萄酒酿造中使用果胶酶的主要作用

1.澄清葡萄汁和葡萄酒，提高葡萄汁和葡萄酒的过滤通透性

2.浸提葡萄中的有益多酚物质

（二）、果胶酶使用方法技巧

（三）、果胶含量测定方法

测定方法有3种：重量法、比色法、容量法。

1、重量法

1.原理：利用果胶酸钙不溶于水的特性，先使果胶质从样品中提取出来，再加沉淀剂使果胶酸钙沉淀，测定重量并换算成果胶质重量。沉淀剂+果胶→果胶酸钙

采用的沉淀剂有两种：电介质：Nacl Cacl2 有机溶液：甲醇乙醇丙酮.

2.方法：

称30-50g（干样5-10g）于250ml烧杯→加150ml水→煮沸1h （搅拌加水解免损失）→冷却→定溶→250ml→抽滤→吸滤液25ml →于500ml烧杯→加0.1N NaOH 100ml→放30min→加50ml 1N 醋酸→加50ml 2N Cacl2→放1hr→沸腾5min后→用烘至恒重的滤纸过滤→用热水洗至无Cl-→把滤纸+残渣→于烘干恒重的称量瓶内→105℃烘至恒重

3.计算：

果胶质%=(0.92353G)/( W325/250) 3100

0.9235：果胶酸钙换算成果胶质的等数

G：滤渣重量，g

W：样品重量，g、容量法（蒸馏滴定法）

1.原理

溶解于水的果胶质是由多缩阿拉伯糖和果胶酸钙组成的测出果胶质的特征部分阿拉伯糖，则可算出果胶质含量。

溴混合液在Hcl作用下放出溴，溴再与糠醛作用，剩余的溴与碘化钾作用析出碘，可用亚硫酸钠滴定，从而计算糠醛的量。

2.步骤

称捣碎样10g→于250ml烧瓶中→加12% HCl 100ml（比重

1.06）→接冷凝管并在瓶上接一个分液漏斗→于140-150℃水浴加热蒸馏液取于量筒→馏液达30ml时→从漏斗加12% Hcl 30ml于烧瓶→继续蒸馏→保持瓶内体积→至馏出液无糠醛（可取馏液1d于滤纸上，旁边滴醋酸苯胺试液1d，有糠醛存在时呈红色）

在馏液中加12% Hcl使总体积为300ml→取出100ml→加

25ml 溴混合液→暗处放1hr→再加15% 碘化钾10ml→淀粉指示剂1d→用0.1N 硫代硫酸钠滴定

3.计算

果胶质=(N（V2-V1）30.0243

3.7)/W 3100

0.024：1N溴溶液1ml相当于糠醛的量，g

3.7：在普通蒸馏条件下，将糠醛换称为果胶质的等数

W：样品溶液相当于样品的量，g

N：硫代硫酸钠标液的当量浓度

V1：空白滴定硫代硫酸钠标液消耗的体积，ml

V2：样液硫代硫酸钠标液消耗的体积，ml3、比色法

方法基于果胶物质水解，生成物半乳糖醛酸在强酸中与咔唑的缩合反应，然后对其紫红色溶液进行比色定量测定。生成紫红色物质与半乳糖醛酸浓度成正比

操作：

a.副作半乳糖醛酸标准曲线

b.提取样品中果胶物质，定容100ml

c.测定吸光度，查曲线得半乳糖醛酸含量

果胶质总量%=(半乳糖醛酸（μg/ml）3100)/(样品克数3

10/200310000)

八、几种指标的测定方法：

（一）比重的测定

比重是葡萄酒发酵的物理参数，它是葡萄酒在发酵阶段酒体复杂变化的外在表现。目前，葡萄酒生产中不直接测定发酵液中酒精的生成量，普遍采用的比重作为监测发酵进程的参数，通过测定发酵液的比重变化来监测发酵过程。

1比重计原理

比重计的原理：一般是下端是细长的，内装弹丸，以降低重心，使比重计能稳定地竖直浮在液面上;比重计的中部则比较粗，这是为了增加浮力，使标度范围增加。将比重计分别放入水、盐水、煤油中，观察比重计在密度不同的液体里排开液体的多少。当比重计浮在液体中时，其本身的重力跟它排开的液体的重力相等。

2仪器

2.1比重计

刻度至0.1或0.2度标准酒精度，经过校准。

2.2量筒

3测定步骤（适用于不挥发物小于等于600mg/100ml的酒）

①使用前清洗和干燥比重计。用部分样品冲洗量筒2到3次。

②将样品注入量筒至所需高度，为了减少搅动和气泡，倒入样品时，量筒应斜至45度角。〔当插入比重计后，液面应略低于量筒边缘〕。

③插入比重计，将比重计的球从量筒底部至上部升降5次或6次，混合和调匀，使比重计球置于液体中，擦干比重计杆，让比重计保持静止状态，暴露于液面之上的比重计杆，不得浸湿多于零点几度。

④记录比重计读数，为了记录比重计读数，眼睛应略低于液面，逐渐抬起头，眼睛垂直于比重计，这样看到的椭圆形逐渐变扁，直至成一直线。以这条线与比重计刻度线相交点作为比重计的读数。稍稍提起比重计，再让它静悬于液体中，记录比重计计数，以此来检验原来的计数值。记录比重计计数到0.02度，取出并干燥比重计。重新放入比重计，擦干计杆，再次记录比重。如果各次读数其符合程度在0.1度之内，取平均值；否则就增加读数，再取平均值。

（二）温度的测定

1.室温：查看室内温度计。

2.发酵温度

发酵温度对酵母活性的影响

酒精发酵过程为放热过程，热量的释放速度与发酵速度成正比，在没有热量散失和冷却作用的情况下，每升葡萄汁中每 10 g 糖被发酵，温度就会上升约 1.3 ℃。如果不能进行有效地散热，发酵温度会持续升高，产生的热量也随之增加而达到失控状态。当温度升高到某一极限值就会使酵母致死，特别是当乙醇浓度逐渐升高，这一极限值就越低；乙醇含量为 0 %时葡萄酒酵母极限生长温度为 40 ℃，乙醇含量为 10 %时葡萄酒酵母极限生长温度为

32 ℃。酵母热致死的结果是杂菌生长完成发酵，产生不希望得到的副产物。另外，发酵温度越高，产酒精效率越低，副产物生成量也越多。正因以上原因，红葡萄酒发酵温度一般不允许超过

30 ℃。过高的温度会浸出较多的葡萄籽单宁，增加葡萄酒的苦涩感，破坏酒体的协调性。

2器材：100℃酒精温度计

3测定方法

a.用酒精给温度计消毒。

b.在发酵过程中测定温度时，最好用固定在一长柄上的温

度计，以测定“皮渣帽”基部的温度。应避免在取样量筒中测定温度。发酵容器上下部之间的温度可相差4～5℃。如果可能，最好每天早晨、中午和傍晚各测一次温度，以及时进行升温或降温。

c.测定温度过程中，插入温度计后需等几分钟再读数，读

数时平视刻度线。

（三）可溶性固形物的测定(阿贝折光计法)（国标）

1 方法适用范围：本方法适用于透明液体、半粘稠、含悬浮物的饮料制品。

2 方法原理：在20℃用折光汁测量待测样液的折光率 ,并用表Λ.1查得或从折光计上直接读出可溶性固形物含量。

3 仪器实验室常用仪器以及下列仪器 :

(1)阿贝折光计或其他折光计 :测量范围 0%~80%,精确度±0.1%。

(2 )组织捣碎机。

4 试液的制备

(1)透明液体制品将试样充分混匀 ,直接测定。

(2) 半粘稠制品 (果浆、菜浆类 ) 将试样充分混匀 ,用四层纱布挤出滤液 ,弃去最初几滴 ,收集滤液供测试用。

(3) 含悬浮物制品 (果粒果汁类饮料 ) 将待测样品置于组织捣碎机中捣碎 ,用四层纱布挤出滤液 ,弃去最初几滴 ,收集滤液供测试用。

5 分析步骤

(1) 分开折光计两面棱镜 ,用脱脂棉蘸乙醚或乙醇擦净。

(2)用末端熔圆之玻璃棒蘸取试液 2滴 ~3滴 ,滴于折光计棱镜面中央 (注意勿使玻璃棒触及镜面 )。

(3)迅速闭合棱镜 ,静置 l mh,使试液均匀无气

泡 ,并充满视野。

(4)对准光源 ,通过目镜观察接物镜。调节指示规 ,使视野分成明暗两部 ,再旋转微调螺旋 ,使明暗界限清晰 ,并使其分界线恰在接物镜的十字交叉点上。读取目镜视野中的百分数或折光率 ,并记录棱镜温度。

(5)如目镜读数标尺刻度为百分数 ,即为可溶性固形物含量 (%);如目镜读数标尺为折光率 ,可按附录 A换算为可溶性固形物含量 (%)。将上述百分

含量按附录 B换算为⒛℃时可溶性固形物含量(%)。允许差同一样品两次测定值之差 ,不应大于0.5%。取两次测定的算术平均值作为结果 ,精确到小数点后一位。

（四）PH测定（酸度计）

1.实验目的

了解酸度计的使用原理

掌握酸度计的使用方法

2.实验原理

用酸度计进行电位测量是测量pH最精密的方法。pH计由三个部件构成：一个参比电极；一个玻璃电极，其电位取决于周围溶液的pH；一个电流计，该电流计能在电阻极大的电路中测量出微小的电位差。

参比电极的基本功能是维持一个恒定的电位，作为测量各种偏离电位的对照。银氧化银电极是目前pH中最常用的参比电极。

玻璃电极的功能是建立一个对所测量溶液的氢离子活度发生变化作出反应的电位差。把对pH敏感的电极和参比电极放在同一溶液中，就组成一个原电池，该电池的电位是玻璃电极和参比电极电位的代数和。E电池＝E参比+E玻璃，如果温度恒定，这个电池的电位随待测溶液的pH变化而变化。

电流计的功能就是将原电池的电位放大若干倍，放大了的信号通过电表显示出，电表指针偏转的程度表示其推动的信号的强度，为了使用上的需要，pH电流表的表盘刻有相应的pH数值；而数字式pH计则直接以数字显出pH值。

3.仪器及试剂

PHS—3C型精密PH计

标准缓冲溶液

4.实验步骤

4.1酸度计的标定

4.1.1打开电源开关，按“PH/MV”按钮，使仪器进入PH测量状态；

4.1.2按“温度”键使显示为溶液温度值（此时温度指示灯亮），然后按“确认”键，仪器确定溶液温度后回到PH测量状态。

4.1.3把用蒸馏水清洗过的电极插入PH=6.86的标准溶液中，待读数稳定后按“定位”键（此时PH指示灯慢闪烁，表明仪器在定位标定状态）使读数为该溶液当前温度下的PH值。

4.1.4把用蒸馏水清洗过的电极插入PH=4.00（或PH=9.18）的标准溶液中，待读数稳定后按“斜率”键（此时PH指示灯快闪烁，表明仪器在斜率标定状态）使读数为该溶液当时的PH值，然后按“确认”键，仪器进入PH测量状态，PH指示灯停止闪烁，标定完成。

4.1.5用蒸馏水洗电极后即可对被测溶液进行测量。

4.2、测量溶液PH值

4.2.1 用蒸馏水清洗电极头部，再用被测溶液清洗一次；

4.2.2 用温度计测量被测溶液的温度值；

4.2.3按“温度”键，调整温度，是显示值与被测溶液温度一致，然后按“确认”键，仪器确定溶液温度后回到PH测量状态；

4.2.4把电极插入被测溶液中，用玻璃棒搅拌，使均匀后读出该溶液的PH值；

4.2.5 记录溶液PH值后，用蒸馏水清洗电极，将水用滤纸吸干后套上电极套。

（五）酵母菌计数

1实验目的

1)复习显微镜的使用。

2)学习血球计数板的使用。

3)计数并计算酵母菌的含量。

2实验原理

1)血球计数板被用以对人体内红、白血球进行显微计数之

用，也常用于计算一些细菌、真菌、酵母等微生物的数量，是一种常见的生物学工具。

2)血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个

槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大方格，中央的一大方格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中方格（大方格用三线隔

开），而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16个小方格。（本实验使用的是第二种。）但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为

0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为

1/4000mm3。

3)因此，数出小方格中酵母菌细胞的数量后，计算小方格内酵母菌细胞数的平均值，再乘以25可得每0.1mm3内酵母菌细胞的数量，继而计算出每ml酵母菌细胞数。

4)血细胞计数的误差分别来源于技术误差和固有误差。其中由于操作人员采血不顺利，器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差属技术误差；而由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差称仪器误差，由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差属于分布误差或计数域误差。仪器误差和分布误差统称为固有误差或系统误差。技术误差和仪器误差可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正，但细胞分布误差却难于彻底消除。

3实验器材

光学显微镜、血球计数板、盖玻片、吸管等。

4实验步骤

1)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可.

2)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的厚玻片.

3)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,稍待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内.

4)计数时,如果使用16格325格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个小格)的酵母菌

数.如果规格为25格316格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数.

5)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞).

6)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每

1ml菌液中所含的酵母菌个数.

7)计算公式

(1)16格325格的血球计数板计算公式:

酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100340031043稀释

倍数

(2)25格x16格的血球计数板计算公式:

酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80340031043稀释倍

数

8血球计数板的清洁

血球汁数板使用后,用自来水冲洗,切勿用硬物洗刷,洗后自行晾

干或用吹风机吹干,或用95%的乙醇,无水乙醇,丙酮等有机溶剂

脱水使其干燥.通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物.若不干净,则必须重复清洗直到干净为止.

（六）葡萄糖的测定（试剂盒）

计算

（七）果糖的测定（试剂盒）

一、测定原理：

果糖与基质液作用，其产物在285nm处有最大吸收峰，可以通过紫外分光光度比色测定其含量。

二、试剂组成与配制：

1.试剂一：基质反应液，75ml2瓶，4℃~8℃避光保

存。

2.试剂二：果糖标准品，D-果糖粉剂3支，每支临

用前加10ml蒸馏水配置成10mg/10ml的果糖标准液，即

1mg/ml的果糖标准液。

三、操作步骤:

混匀，沸水浴准确水浴8分钟，流水冷却，波长285nm，1cm光径，双蒸水调零，测各管OD值。

四、计算：

1.前处理：取试样于3500r/min条件下离心10min，

取上清液待测。

2.计算公式：

果糖含量（mg/ml）标准浓度（1mg/ml）样本测定前稀释倍数

（八）SO2的测定（碘量法）

一、游离二氧化硫

1、原理：利用碘可以与二氧化硫发生氧化还原反映的性质，测定样品中二氧化硫的含量。

2 试剂与溶液

硫酸溶液(1+ 3):取1体积浓硫酸缓慢注人3体积水中。

碘标准溶液[c(1/2I?)= 0.02 mol /L

淀粉指示剂(10g/L):按GB603中4.5.20条配制，并加入40g氯化钠。

3步骤

取50.00m L 样品（液温20℃）于250mL碘量瓶中，加入少量碎冰块、再加入1ml淀粉指示液，10 mL 硫酸溶液，用碘标准溶液迅速滴定至淡蓝色，保持30面不变即为终点，记下消耗的碘标准溶液的体积(V )。

以水代替样品做空白试验，操作同上。

计算

式中: X—样品中总二氧化硫的含量， mg/L;

c —碘标准溶液的物质的量浓度， mol /L;

V—测定样品消耗的碘标准溶液的体积,mL ;

V。—空白试验消耗的碘标准溶液的体积,m L ;

32—二氧化硫的摩尔质量的数值，g/ml

25—取样体积,m L .

所得结果应表示至整数。

二、总硫

1、原理：在碱性条件下，结合态二氧化硫被游离出来，然后再用碱标准溶液滴定，得到样品中结合二氧化硫的含量。

2、试剂和材料：

氢氧化钠溶液（100g/L）

其他指示剂与溶液同游离二氧化硫的测定

3、分析步骤

取25.00m L 氢氧化钠溶液于250mL碘量瓶中，再准确吸取25.00m L20℃样品，并以吸管尖插入氢氧化钠溶液的方式，加入到碘量瓶中，摇匀，盖塞，静置15 min后，再加入少量碎冰块、1 mL 淀粉指示液、10 mL 硫酸溶液，摇匀， 1 用碘标准溶液迅速滴定至淡蓝色， 30s内不变即为终点，记下消耗的碘标准溶液的体积(V )。以水代替样品做空白试验，操作同上。

计算

式中:, X—样品中总二氧化硫的含量， mg/L;

c —碘标准溶液的物质的量浓度， mol /L;

V—测定样品消耗的碘标准溶液的体积,mL ;

V。—空白试验消耗的碘标准溶液的体积,m L ;

32—二氧化硫的摩尔质量的数值

25—取样体积,m L .

所得结果应表示至整数。

（九）甲醇的测定（分光光度计法）

1 原理

甲醇在磷酸溶液中，被高锰酸钾氧化成甲醛，用偏重亚硫酸钠除去过量的高锰酸钾，甲醛与变色酸在浓硫酸存在下，先缩合，随之氧化，生成对醌结构的蓝紫色化合物，与标准系列比较定量。

2 试剂

高锰酸钾-磷酸溶液（30g/L）：称取3g高锰酸钾，溶于

15ml85%（质量分数）磷酸和70ml水中，溶解后，加水至100ml。贮于棕色瓶内，防止氧化能力下降，保存时间不宜过长。

草酸-亚硫酸溶液：称取5g无水草酸（H2C2O4）或7g含2分子结晶水草酸（H2C2O422H2O），溶于硫酸（1+1）中至100ml。

品红-亚硫酸溶液：称取0.1g碱性品红研细后，分次加入共

60ml80℃的水，边加入水边研磨使其溶解，用滴管吸取上层溶液虑于100ml容量瓶中，冷却后加入10ml亚硫酸钠溶液（100g/L），

1ml盐酸，再加水至刻度线，充分混匀，放置过夜，如溶液有颜色，可加少量活性炭搅拌后过滤，贮于棕色瓶中，置暗处保存，溶液呈红色时应弃去重新配制。

甲醇标准溶液：称取1.000g甲醇，置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于10g甲醇。置低温保存。

甲醇标准使用液：吸取10.0ml甲醇标准溶液，置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度。再取10.0ml稀释液置于50ml容量瓶中，加水至刻度，该溶液每毫升相当于0.50mg甲醇。

亚硫酸钠溶液：100g/L

3 仪器

恒温水浴：控温精度±1℃分光光度计

4 试样的制备

用一洁净、干燥的100ml容量瓶准确量取100ml样品（液温20℃）于500ml容量瓶中，用50ml水分三次冲洗容量瓶，洗液并入蒸馏瓶中，再加几颗玻璃珠，连接冷凝器，以取样用的原容量瓶坐作接收器（外加冰浴）。开启冷却水，缓慢加热蒸馏。收集溜出液

接近刻度，取下容量瓶，盖塞。于20℃水浴中保温30分钟，补加水至刻度，混匀，备用。

5 分析步骤

吸取甲醇标准溶液0ml、0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml甲醇标准使用液（相当于0mg、0.05mg、0,10mg、0.20mg、0.30mg、0.40mg、0.50mg甲醇)分别置于25ml具塞比色管中，并用无甲醇的乙醇稀释至1.0ml.

于样品管及标准管中各加水至5ml，再依次各加2ml高锰酸钾-磷酸溶液，混匀，放置10min，各加2ml草酸-硫酸溶液，混匀使之褪色，再各加5ml品红-亚硫酸溶液，混匀，于20℃以上静置

0.5h，用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长590nm处测吸光度，绘制标准曲线比较，或与标准色列目测比较。

5 结果计算

试样中的甲醇含量按下式计算：

式中：

X——试样中的甲醇含量，单位为毫克每升（mg/L）

m?——测定样品中甲醇的质量，mg

V?——吸取样品的体积，ml

所得结果表示至整数。

（十）酒精度的测定（蒸馏法）

1 实验范围：

本方法适用于葡萄酒、果酒及其相关产品中酒精度的测定。

2 实验原理：

以蒸馏法去除样品中的不挥发性物质，用酒精计法测得酒精体积百分数示值，进行温度校正后，求得20℃时乙醇的体积百分数（%，V／V），即酒精度。