第四章 蛋白质与酶的化学修饰
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酶分子的化学修饰
7.4 酶分子的化学修饰
酶分子的化学修饰，就是在分子水平上对 酶分子的化学修饰 酶进行改造，以达到改构和改性的目的。 即：在体外将酶分子通过人工的方法与一 些化学基团(物质)，特别是具有生物相容 性的物质，进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这种物质被称为修饰试剂 修饰试剂。 修饰试剂 化学修饰酶主要用于基础酶学的研究和疾 病治疗。医疗用酶要求酶的稳定性高、纯 度高、无免疫原性。
•脂质体包裹 脂质体包裹
酶脂质体包埋属于固定化修饰之一。许多医 药酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量大，不 易进入细胞内，而且在体内半衰期短，产生 免疫原性反应。这些是酶在临床上必须解决 的问题。为此，可通过酶的表面化学修饰来 解决。例如：SOD用聚乙二醇(PEG)修饰后， 其在体内的稳定件及免疫原性都大大改善。 至于如何进入细胞内，用脂质体包裹是个有 效的方法。
（2）酶蛋白主链的修饰
至今，酶蛋白主链修饰主要是靠 酶法。例如：用蛋白酶对ATP酶有 限水解，切除其十几个残基后，酶 活力提高了5.5倍。该活化酶仍为 四聚体，亚单位分子量变化不大。 这说明天然酶并非总是处于最佳的 催化构象状态。
（3）催化活性基团的修饰
通过选择性修饰氨基酸侧链成分来实现氨基酸的 取代，这种将一种氨基酸侧链转化为另一种新的 氨基酸侧链的方法叫化学突变法 化学突变法。例如：Berder 化学突变法 等人，将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转 化为Cys残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或酯没 有水解能力，但能水解硝基苯酯等高度活化的底 物。这种方法由于受到专一试剂、有机化学工业 水平的限制，没有蛋白质工程技术普遍，但它通 过产生非蛋白质氨基酸的能力，可以有力地补充 蛋白质工程技术。
②大分子共价修饰
用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素 等，通过共价键连接于酶分子的表面、形成一层 覆盖层。这种可溶性酶有许多有用的性质：如用 聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(S0D)，不仅可以降 低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能 力，延长了酶在体内的半衰期，从而提高了酶药 效。日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋 白酶上所得产物溶于有机溶剂，仍能有效地起作 用。嗜热菌蛋白酶通常在水介质中催化肽链裂解， 但用聚乙二醇共价修饰后，可在有机溶剂中催化 肽键合成，已用于合成甜味剂。
酶分子的化学修饰，就是在分子水平上对 酶分子的化学修饰 酶进行改造，以达到改构和改性的目的。 即：在体外将酶分子通过人工的方法与一 些化学基团(物质)，特别是具有生物相容 性的物质，进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这种物质被称为修饰试剂 修饰试剂。 修饰试剂 化学修饰酶主要用于基础酶学的研究和疾 病治疗。医疗用酶要求酶的稳定性高、纯 度高、无免疫原性。
•脂质体包裹 脂质体包裹
酶脂质体包埋属于固定化修饰之一。许多医 药酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量大，不 易进入细胞内，而且在体内半衰期短，产生 免疫原性反应。这些是酶在临床上必须解决 的问题。为此，可通过酶的表面化学修饰来 解决。例如：SOD用聚乙二醇(PEG)修饰后， 其在体内的稳定件及免疫原性都大大改善。 至于如何进入细胞内，用脂质体包裹是个有 效的方法。
（2）酶蛋白主链的修饰
至今，酶蛋白主链修饰主要是靠 酶法。例如：用蛋白酶对ATP酶有 限水解，切除其十几个残基后，酶 活力提高了5.5倍。该活化酶仍为 四聚体，亚单位分子量变化不大。 这说明天然酶并非总是处于最佳的 催化构象状态。
（3）催化活性基团的修饰
通过选择性修饰氨基酸侧链成分来实现氨基酸的 取代，这种将一种氨基酸侧链转化为另一种新的 氨基酸侧链的方法叫化学突变法 化学突变法。例如：Berder 化学突变法 等人，将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转 化为Cys残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或酯没 有水解能力，但能水解硝基苯酯等高度活化的底 物。这种方法由于受到专一试剂、有机化学工业 水平的限制，没有蛋白质工程技术普遍，但它通 过产生非蛋白质氨基酸的能力，可以有力地补充 蛋白质工程技术。
②大分子共价修饰
用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素 等，通过共价键连接于酶分子的表面、形成一层 覆盖层。这种可溶性酶有许多有用的性质：如用 聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(S0D)，不仅可以降 低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能 力，延长了酶在体内的半衰期，从而提高了酶药 效。日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋 白酶上所得产物溶于有机溶剂，仍能有效地起作 用。嗜热菌蛋白酶通常在水介质中催化肽链裂解， 但用聚乙二醇共价修饰后，可在有机溶剂中催化 肽键合成，已用于合成甜味剂。
酶分子的化学修饰
概念：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的 空间结构发生精细的改变，从而改变酶的 特性与功能的方法。
作用： （1）提高酶活力 （2）增加酶的稳定性 （3）降低抗原抗体反应
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为 大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。
（1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
二、酶化学修饰的基本要求：
决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性， 尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回 收。为此，有时需要通过反复试验来确定。
选择修饰剂 选择酶反应条件 反应的专一性
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三、酶分子化学修饰的主要方法
（一）酶分子的主链修饰 （二）酶分子的侧链基团修饰 （三）酶分子的化学交联修饰 （四）酶分子的大分子结合修饰 （五）酶分子的亲和标记修饰 （六）酶分子的基因修饰 （七）与辅助因子相关的修饰
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
侧链基团修饰的主要作用
1.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性 质和数目。
2.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定
3.探索酶蛋白作用的化学机理
4.用于酶蛋白分子的固定化
（三）酶分子的化学交联修饰 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
概念：既可以酶分子内部亚基之间，也可 以在分子与分子之间。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（二）酶分子的侧链基团修饰
概念：采用人工方法使酶蛋白的氨基酸残基的侧 链基团与修饰剂发生化学反应，从而改变酶分子 的性质和功能的修饰方法称为侧链修饰基团。
选择性修饰试剂必须要与多肽链中某—种特定的 氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密 共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧 链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、 酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。
作用： （1）提高酶活力 （2）增加酶的稳定性 （3）降低抗原抗体反应
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根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为 大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。
（1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护
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二、酶化学修饰的基本要求：
决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性， 尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回 收。为此，有时需要通过反复试验来确定。
选择修饰剂 选择酶反应条件 反应的专一性
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三、酶分子化学修饰的主要方法
（一）酶分子的主链修饰 （二）酶分子的侧链基团修饰 （三）酶分子的化学交联修饰 （四）酶分子的大分子结合修饰 （五）酶分子的亲和标记修饰 （六）酶分子的基因修饰 （七）与辅助因子相关的修饰
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侧链基团修饰的主要作用
1.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性 质和数目。
2.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定
3.探索酶蛋白作用的化学机理
4.用于酶蛋白分子的固定化
（三）酶分子的化学交联修饰 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
概念：既可以酶分子内部亚基之间，也可 以在分子与分子之间。
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（二）酶分子的侧链基团修饰
概念：采用人工方法使酶蛋白的氨基酸残基的侧 链基团与修饰剂发生化学反应，从而改变酶分子 的性质和功能的修饰方法称为侧链修饰基团。
选择性修饰试剂必须要与多肽链中某—种特定的 氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密 共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧 链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、 酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。
蛋白质的化学修饰
转移
泛素腺苷酸复合物被转移到E2结合酶上。
连接
E3连接酶将活化的泛素分子连接到蛋白质的赖氨酸残基上。
泛素化修饰在生物学中的作用
调控蛋白质的稳定性
01
通过标记需要降解的蛋白质，泛素化修饰可以调控蛋白质的稳
定性。
参与信号转导
02
泛素化修饰可以影响蛋白质的功能，从而参与信号转导过程。
参与细胞周期和DNA修复
磷酸酶
催化蛋白质去磷酸化反应 的酶，将蛋白质上的磷酸 基团去除。
甲基化修饰
将甲基基团添加到蛋白质 的特定氨基酸残基上，调 节蛋白质的活性和功能。
磷酸化修饰在生物学中的作用
信号转导
磷酸化修饰参与细胞内的信号转导过程，调节细 胞反应和功能。
细胞周期和增殖
磷酸化修饰与细胞周期调控和细胞增殖密切相关 ，影响细胞生长和分裂。
04
泛素化修饰的种类
单泛素化
一个泛素分子与蛋白质的特定赖 氨酸残基结合，形成单泛素化修
饰。
多泛素化
多个泛素分子与蛋白质的特定赖氨 酸残基结合，形成多泛素化修饰。
链式泛素化
一个泛素分子的羧基端与另一个泛 素分子的氨基端结合，形成链式泛 素化修饰。
泛素化修饰的酶学机制
活化
泛素分子首先被E1活化酶激活，生成泛素腺苷酸复合物。
重要性
蛋白质化学修饰是生物体内一种重要的调控机制，可以快速 响应生物环境变化，调节蛋白质的活性、定位和稳定性，从 而影响细胞代谢、信号转导、细胞生长和分化等生物学过程 。
蛋白质化学修饰的类型
01
磷酸化
磷酸化是指在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上添加磷酸基团，
通常由蛋白激酶催化。磷酸化可以改变蛋白质的电荷性质和构象，从而
泛素腺苷酸复合物被转移到E2结合酶上。
连接
E3连接酶将活化的泛素分子连接到蛋白质的赖氨酸残基上。
泛素化修饰在生物学中的作用
调控蛋白质的稳定性
01
通过标记需要降解的蛋白质，泛素化修饰可以调控蛋白质的稳
定性。
参与信号转导
02
泛素化修饰可以影响蛋白质的功能，从而参与信号转导过程。
参与细胞周期和DNA修复
磷酸酶
催化蛋白质去磷酸化反应 的酶，将蛋白质上的磷酸 基团去除。
甲基化修饰
将甲基基团添加到蛋白质 的特定氨基酸残基上，调 节蛋白质的活性和功能。
磷酸化修饰在生物学中的作用
信号转导
磷酸化修饰参与细胞内的信号转导过程，调节细 胞反应和功能。
细胞周期和增殖
磷酸化修饰与细胞周期调控和细胞增殖密切相关 ，影响细胞生长和分裂。
04
泛素化修饰的种类
单泛素化
一个泛素分子与蛋白质的特定赖 氨酸残基结合，形成单泛素化修
饰。
多泛素化
多个泛素分子与蛋白质的特定赖氨 酸残基结合，形成多泛素化修饰。
链式泛素化
一个泛素分子的羧基端与另一个泛 素分子的氨基端结合，形成链式泛 素化修饰。
泛素化修饰的酶学机制
活化
泛素分子首先被E1活化酶激活，生成泛素腺苷酸复合物。
重要性
蛋白质化学修饰是生物体内一种重要的调控机制，可以快速 响应生物环境变化，调节蛋白质的活性、定位和稳定性，从 而影响细胞代谢、信号转导、细胞生长和分化等生物学过程 。
蛋白质化学修饰的类型
01
磷酸化
磷酸化是指在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上添加磷酸基团，
通常由蛋白激酶催化。磷酸化可以改变蛋白质的电荷性质和构象，从而
第四章 酶蛋白的化学修饰
（二）酶蛋白功能基团的超反应性
超反应性指的是蛋白质的某个侧链基团与 个别试剂能发生非常迅速反应的能力。
蛋白质中的功能基与简单氨基酸中的相同基团相 比，反应性要差。
但是,每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定 的试剂显示出超反应性。超反应基团不一定是酶 活性部位上的基团。
影响超反应性的因素：
①改变蛋白质功能基团的pK值； ②蛋白质功能基团具有较大的亲核性； ③通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当取向； ④试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学
②意义：
A.天然酶的活性维持存在缺陷；（如：异体蛋白 的抗原性、易受蛋白酶水解、抑制剂抑制、活性 半衰期短）
B.天然酶的使用性能存在缺陷；（如： 酶蛋白抗酸、碱、有机溶剂变性及抗热 失活能力差，容易受产物抑制）
C.天然酶的应用存在潜力。（如：通过 酶的分子改造可提高酶的稳定性、解除 酶的抗原性、改变酶学性质(最适pH、最 适温度、Km值、催化活性和专一性等)、 扩大酶的应用范围）
四、酶蛋白修饰的方法
（1）酶分子的表面修饰： 1）化学固定：酶与惰性载体共价固定
（即共价固定化酶）；
2）小分子修饰：用化学小分子修饰酶的 表面基团；（如：对酶分子的侧链基团， 尤其酶活性中心的必需基团进行化学修 饰）
3）大分子修饰
非共价修饰:与大分子物质非共价结合，增加酶的稳定性; 共价修饰:用可溶性大分子共价连接于酶分子表面，形成覆盖
3、酶修饰途径
（1）分子生物学水平，即用基因工程方法对DNA 或RNA进行分子改造，以获得化学结构更为合理的 酶蛋白（蛋白质工程）。 （2）对天然酶分子进行改造，这包括一级结构中 氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等（选择 性化学修饰）。
三． 酶化学修饰的基本原理
第四章：酶分子修饰
（6）分子结合修饰
定义 分子结合修饰：采用水溶性分子，与酶蛋白的侧 分子结合修饰：采用水溶性分子，与酶蛋白的侧 链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变， 从而改变酶的特性与功能的方法。 大分子结合修饰：对酶蛋白侧链基团的修饰反应 大分子结合修饰：对酶蛋白侧链基团的修饰反应 不仅可以使用小分子物质，也可使用大分子物质。 其中利用水溶性大分子与酶分子的侧链基团共价 结合，使酶分子的空间结构发生某些精细的改变， 从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合 修饰法。
(1)肽链的水解引起酶活性中心的破坏，酶将丧失其 肽链的水解引起酶活性中心的破坏， 催化功能。 催化功能。 (2)肽链的一部分被水解后，仍然可以维持酶活性中 肽链的一部分被水解后， 心的空间构象， 心的空间构象，则酶的催化功能仍可以保持不变或 损失不多，但是其抗原性等特性将发生改变。 损失不多，但是其抗原性等特性将发生改变。这将 提高某些酶特别是药用酶的使用价值。 提高某些酶特别是药用酶的使用价值。 (3)肽链的一部分水解除去以后，有利于酶活性中心 肽链的一部分水解除去以后， 与底物的结合并且形成准确的催化部位， 与底物的结合并且形成准确的催化部位，则酶可显 示出其催化功能或使酶活性提高。 示出其催化功能或使酶活性提高。
+
O2N OOC S S NO2 COO
ENZ
SH
pH﹥ 6.8
DTNB
NO2 COO
ENZ
S S
+
S
NO2
+
COO
H+
（5）分子内交联修饰
定义：利用含有双功能基团的化合物， 与酶分子中两个侧链基团反应，形成共 价交联，可使酶分子的空间构象更为稳 定，提高酶的稳定性。 修饰剂：二氨基丁烷，戊二醛，己二胺 用途：在蛋白和酶的结构与功能的基础 研究，酶的催化机制等酶学研究方面有 重要作用。
Chapter 4 酶分子修饰与应用
第四章酶分子修饰与应用1 酶分子修饰(Modification of Enzyme Molecule)：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。
2 酶分子修饰的意义？（1）提高酶的活力；（2）增强酶的稳定性；（3）降低或消除酶的抗原性；（4）研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系。
第一节酶分子的主链修饰1 酶分子的主链修饰：利用酶分子主链（肽链或核苷酸链）的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
2 酶分子主链修饰的意义？（1）可提高酶的活力；（2）可降低或消除酶的抗原性；（3）可预测酶活性中心在主链上的位置，从而了解主链的不同位置对酶的催化功能的贡献。
（一）主链的切断修饰①主链断裂后，引起酶活性中心的破坏，酶的催化功能丧失（用于探测酶活性中心的位置）。
②主链断裂后，酶活性中心的空间构象维持不变，酶的催化功能也可以保持不变或损失不多，但是抗原性有发生改变。
这样可以提高药用酶的使用价值。
③主链断裂有利于酶活性中心的形成，则可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。
（二）主链的连接修饰将两种或者两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或者多种催化活性的修饰方法称为酶的主链连接修饰。
在一个酶分子上具有两种或多种催化活性的酶称为多酶融合体。
通过基因融合技术将两种或两种以上的酶的基因融合在一起形成融合基因，再经过克隆和表达，有可能获得各种多酶融合体。
第二节酶的侧链基团修饰采用一定的方法使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。
酶的侧链基团的意义：（1）可以研究各种基团在酶分子中的作用，并可以用于研究酶的活性中心中的必需基团。
如果某基团修饰后不引起酶活力的显著变化，则可以认为此基团属于非必需基团；如果某基团修饰后使酶活力显著降低或丧失，则此基团很可能是酶催化的必需基团。
蛋白质的修饰和表达
定向进化的应用
目标酶
所需功能
方法
结果
实施菌种
卡那霉素核苷基 转移酶
枯草杆菌蛋白酶
β-内酰胺酶 对硝基苯酯酶
胸苷激酶 β-半乳糖苷酶 砷酸脱毒途径
热稳定性
作用于有机溶 剂
作用于新底物
有机溶剂中的 底物特异性和
活性 第五特异性 基
因理疗 底物特异性
砷酸抗性
定位诱变+选择 易错PCR+选择
DNA改组+选择 易错PCR+重组
化学修饰影响的条件
• 1、温和的反响条件是防止蛋白质分子变性 的一个必要条件
• 2、pH值得变化：决定了具有潜在反响能力 的基团所处的可反响和不可反响的离子状 态。
• 3、温度：影响活性巯基的微环境 • 4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，
但有机溶剂可使蛋白质变性。
• 化学方法：
•
• 产生半合成的结构，一个天然多肽与一个 人造〔或化学修饰〕的多肽相缔合
Amps
Tetr
Tetr
Amps
突变 氨苄青霉素抗性的阳性克隆
设计突变体引物 氨苄青霉素抗性修复寡核苷酸
PCR方法介导的定点突变
• 通过改变引物中的某些碱基而改变基因序 列，到达有目的改造蛋白质结构、研究蛋 白质的结构和功能之间的关系的目的
• 取代突变、插入突变、缺失突变
5’ 3’
5’
3’ 3’
• 亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反响可区分α氨基和ε-氨基。完全亚氨代乙酰化的蛋白质 仍保持在水溶液中的可溶性。
• α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε氨基。
羧基的化学修饰
• 由于羧基在水溶液中的化学性知识的蛋白 质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法 很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶 性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可 在较温和的条件进行
4酶分子化学修饰2
8）吲哚基的化学修饰 来源：Trp色 修饰反应：氧化反应 修饰剂： N-溴代琥珀酰亚胺
各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸 侧链基团
修饰剂
Lys
Asp、Glu Arg Cys
His Tyr Trp
氨基
羧基 胍基 巯基 二硫键 咪唑基 酚羟基 吲哚基
三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘 乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸 水溶性碳化二亚胺 苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺 巯基乙醇、DTT 焦碳酸二乙酯、碘乙酸 碘、四硝基甲烷 N-溴代琥珀酰亚胺
素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与
酶分子共价结合。
Hale Waihona Puke 3. 应用： 如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）
PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） • 消除了抗原性 • 延长了酶在体内的半衰期 又如：用Dextran 右旋糖酐 修饰-淀粉酶，－淀粉酶，胰 蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。
但解释修饰效果须十分小心，因为： ①任何一种修饰剂不是绝对专一的。 ②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活， 不一定是活性中心基团被共价修饰。 ③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子 内部的必需基团，不易被修饰。
（三）交联修饰（交联法） 用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同
肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。 （四）固定化修饰（共价偶联法）
E－SH ＋
5) 二硫键的化学修饰 还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
氧化：过甲酸:
6)咪唑基的化学修饰 来源：His组 修饰反应:酰基化与烷基化
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2、修饰剂上反应基团的数目及位置 3、修饰剂上反应基团的活化方法与条件 一般要求较大分子量、良好的生物相容性 和水溶性、分子表面有较多反应活性基团； 试剂的选择—要根据修饰目的选择
例如对氨基修饰可有几种情况——
修饰所有氨基而不修饰其它基团； 仅修饰α-氨基； 修饰暴露的或反应性高的氨基； 修饰具有催化活性的氨基；
5、酶微环境稳定的维持 pH值改变时： ①破坏了酶分子上静电形成的化学键，氢 键等维持天然构象的平衡力 ②改变了酶分子上氨基酸残基的离解状态 和它们之间的相互结合及作用方式 许多大分子修饰剂本身就是多聚电解 质，能在酶分子表面或微环境区域形成 一 层“缓冲外壳”。
4.2、化学修饰的设计
一、酶性质的了解
酶的催化活性基团通常对修饰剂是有反应的，但
酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团， 可能与酶的功能或构象没有明显联系。
影响因素：
1. 改变蛋白质功能基的pKa值；
2. 蛋白质功能基具有较大的亲核性；
3. 通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当的 取向；
4. 试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体 化学适应性； 5. 试剂的结合。
乙酰化
乙酸酐
电荷消失
芳基化
2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)
电荷消失
电荷消失
芳基化
2,4一二硝基氟苯(DNFB) 碘代乙酸(IAA) 醛
烷基化 引入负电荷 还原 烷基化 芳基化 引入正电荷 电荷消失
丹磺酞氯(DNS)
2）、 羧基（—COOH）修饰 羧基在酶蛋白中主要是 Asp 和 Glu 的 侧链 — COOH，以及肽链的末端羧基
3. 位阻因素：蛋白质表面的位阻因素，或底物、 辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都能阻止修 饰剂与功能基的正常反应。但修饰的结果却能 提供蛋白质表面的有用信息。
4. 催化因素：修饰部位附近的其它功能基，若起 一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。 5. 局部环境的极性：许多有机反应的速度与溶剂 的极性有关，而有些反应则与极性无关；疏水 环境能阻止产物中电荷分离的反应。
在水溶液中，—COOH 通常解离成负离子，亲核
性降低，对其修饰的方法有限，主要反应为成酯、 成酰胺反应
修饰反应 —— 羧基
碳二亚胺反应（羧基修饰的标准方法）
碳二亚胺
R, R‘为烷基；X为卤素
修饰反应 —— 羧基
酯化反应
胃蛋白酶与[14C]硼氟 化三甲洋盐在pH 5时 酶完全失活，研究表 明两-COOH为该酶必 需基团
4.3、化学修饰的种类
一．表面修饰 二．内部修饰 三．与辅因子相关的修饰 四．物理修饰
五．亲和修饰
一、表面修饰
1. 化学固定化 2. 小分子修饰 3. 大分子修饰 4. 肽链的交联
1、化学固定化
通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价 连接到惰性载体上，从而改变酶所处的环境，
酶的性质也相应发生改变。
修饰剂： 2 ， 4 －二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙 酰胺等。
烷基化反应
2) 酰基化反应
试剂特点：
含有 结构，作用于侧链基团上的 亲核基团，使之酰基化。 可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（ Ser 、 Thr ），酚 羟基（Tyr）
酰基化反应
3) 氧化和还原反应
试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺
（1）酶的稳定性 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、 抑制剂等 （2）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大 小、性状、亚基数等 （3）酶侧链基团的性质及其反应性 巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、 胍基、吲哚基、二硫键、硫醚基等
二、修饰剂的要求
1、修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质 的吸附性
三）、修饰剂反应性的决定因素
1. 选择性吸附：化学修饰前，修饰剂根据各自的 特点，选择性地吸附于低或高极性区的，有时 可以根据对速度的饱和效应，检测出蛋白质 修饰剂复合物的形成，类似酶-底物复合物。
2. 静电相互作用：带电的修饰剂能选择性地吸引 到蛋白质表面带相反电荷的部位。该作用可使 修饰剂向多功能部位中的一个残基定位，或向 双功能基一侧定位。此外，静电排斥力能抑制 修饰作用。
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量 不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时 酶的活力回收高。 （1）pH与离子强度
pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。 由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。
（2）修饰反应的温度与时间
严格控制温度和时间可以减少以至消除一些 非专一性的修饰反应。
（3）反应体系中酶与修饰剂的比例
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解 酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解 酶：
A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白 水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键 免遭破坏。 B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后， 减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇， 与修饰剂形成了共价键。 破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至 消除； “遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、 抗体结合。
例：如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电 状态或溶解性，则必须选择能引入 最大电 荷量的试剂。
用于修饰酶的氨基酸残基的试剂应具备： 选择性地与一个氨基酸残基反应； 反应在酶蛋白不变性条件下进行； 所标记的残基在肽链中稳定以易于分离 鉴定； 修饰反应的程度能简单测定；
三、反应条件的选择
2.小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）
•定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子 侧链上特定的功能基团发生化学反应。
•侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主
要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。
•侧链基团修饰剂：采用各种小分子化合物。
20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的
侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。
可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑
基，酚基等。
还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。
可被还原的侧链基团：二硫键。
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
4) 芳香环取代反应
•试剂：卤（碘）化，硝化试剂。
碘代：
•
I2＋
+ HI
硝化：
• (NO2)4C
+
+(NO2)3CH
苯乙二醛
5）、酚基和羟基（—OH）修饰 酶蛋白中含羟基的氨基酸残基有：Ser、Thr、 Tyr
羟基的专一性修饰较困难，通常修饰剂能同
时修饰羟基、氨基和巯基 Tyr 的酚羟基相比于 Ser 和 Thr 的羟基要活泼 一些，更容易发生修饰；酚基具有芳香性， 能发生亲电取代反应
修饰反应 —— 酚基和酚羟基
例如：酶固定到电荷载体上，由于介质中的质子靠
近载体，并与载体上的电荷 发生作用，使酶的最适 pH发生偏移。 糖化酶固定到阴离子载体上，最适pH4.5升到6.5， 与D-木糖异构酶的最适pH7.5 靠近，可简化高果糖 浆生产工艺。
载体与底物带相同电荷，固定化后反应系统
Km增加，反之，Km降低。 增加酶分子构象稳定性。
硼氟化三甲洋盐
甲醇
3）、巯基（—SH）修饰 巯基在酶蛋白中的来源是 Cys 的 -SH 巯基的亲核性强，往往是酶分子中反应活性 最高的基团 巯基容易被氧化成 —S—S—，在维持蛋白亚基 之间的相互作用和酶催化过程中起重要作用 巯基用烷基化试剂修饰后一般能得到稳定的 修饰产物
修饰反应 —— 巯基
酚基亲电取代反应
碘化反应
四硝基甲烷(TNM)
修饰反应 —— （酚）羟基
O-酰基化反应
1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能 力）。 4）产生新的催化能力。
五、酶化学修饰的原理
1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与 酶形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。 2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的 空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮 盖”了酶的活性部位。
白质侧链基团的亲核性与其pK值相关。
影响蛋白质侧链基团pK值的因素有： 1、微环境：微区极性、基团间的氢键、静电相互作 用 2、基团之间的障碍（位阻效应）
3、其它因素：电荷转移、共价键形成、金属螯合、
旋转自由度等
二）、蛋白质功能基的超反应性
超反应性：指蛋白质的某个侧链基团与个别试剂
能发生非常迅速的反应。
在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起 重要作用
胍基碱性强中性或 弱碱性条件下反应，一般是可逆反应
修饰反应 ——
需在黑暗中进行, 因其可作为光 胍基（与邻二酮的反应） 敏剂破坏Trp\His\Tyr等残基
硼酸盐
丁二酮
硼酸盐 1,2-环己二酮
（四硝基甲烷）
特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
氨基修饰（Lys）
羧基修饰（Asp、Glu） 巯基修饰（Cys）
胍基修饰（Arg）
羟基修饰（Ser、Thr、Tyr） 咪唑基修饰（His） 吲哚基修饰（Trp） 甲硫基修饰（Met）
二硫键修饰
亲和修饰
1）、 氨基（—NH2）修饰 氨基在酶蛋白中主要是 Lys 的 -NH2 和肽链末 端氨基 非质子化的 -NH2 亲核反应活性很高，易被选 择性修饰 一般情况下 -NH2 的 pKa = 10，其解离程度取 决于微环境 氨基的修饰反应主要有N-烷基化等
1、稳定性不够，不能适应大量生产的需 要。 2、作用的最适条件不符。 3、酶的专一性 4、米式常数过大 5、临床应用的特殊要求 6、酶活性不够高
例如对氨基修饰可有几种情况——
修饰所有氨基而不修饰其它基团； 仅修饰α-氨基； 修饰暴露的或反应性高的氨基； 修饰具有催化活性的氨基；
5、酶微环境稳定的维持 pH值改变时： ①破坏了酶分子上静电形成的化学键，氢 键等维持天然构象的平衡力 ②改变了酶分子上氨基酸残基的离解状态 和它们之间的相互结合及作用方式 许多大分子修饰剂本身就是多聚电解 质，能在酶分子表面或微环境区域形成 一 层“缓冲外壳”。
4.2、化学修饰的设计
一、酶性质的了解
酶的催化活性基团通常对修饰剂是有反应的，但
酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团， 可能与酶的功能或构象没有明显联系。
影响因素：
1. 改变蛋白质功能基的pKa值；
2. 蛋白质功能基具有较大的亲核性；
3. 通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当的 取向；
4. 试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体 化学适应性； 5. 试剂的结合。
乙酰化
乙酸酐
电荷消失
芳基化
2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)
电荷消失
电荷消失
芳基化
2,4一二硝基氟苯(DNFB) 碘代乙酸(IAA) 醛
烷基化 引入负电荷 还原 烷基化 芳基化 引入正电荷 电荷消失
丹磺酞氯(DNS)
2）、 羧基（—COOH）修饰 羧基在酶蛋白中主要是 Asp 和 Glu 的 侧链 — COOH，以及肽链的末端羧基
3. 位阻因素：蛋白质表面的位阻因素，或底物、 辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都能阻止修 饰剂与功能基的正常反应。但修饰的结果却能 提供蛋白质表面的有用信息。
4. 催化因素：修饰部位附近的其它功能基，若起 一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。 5. 局部环境的极性：许多有机反应的速度与溶剂 的极性有关，而有些反应则与极性无关；疏水 环境能阻止产物中电荷分离的反应。
在水溶液中，—COOH 通常解离成负离子，亲核
性降低，对其修饰的方法有限，主要反应为成酯、 成酰胺反应
修饰反应 —— 羧基
碳二亚胺反应（羧基修饰的标准方法）
碳二亚胺
R, R‘为烷基；X为卤素
修饰反应 —— 羧基
酯化反应
胃蛋白酶与[14C]硼氟 化三甲洋盐在pH 5时 酶完全失活，研究表 明两-COOH为该酶必 需基团
4.3、化学修饰的种类
一．表面修饰 二．内部修饰 三．与辅因子相关的修饰 四．物理修饰
五．亲和修饰
一、表面修饰
1. 化学固定化 2. 小分子修饰 3. 大分子修饰 4. 肽链的交联
1、化学固定化
通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价 连接到惰性载体上，从而改变酶所处的环境，
酶的性质也相应发生改变。
修饰剂： 2 ， 4 －二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙 酰胺等。
烷基化反应
2) 酰基化反应
试剂特点：
含有 结构，作用于侧链基团上的 亲核基团，使之酰基化。 可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（ Ser 、 Thr ），酚 羟基（Tyr）
酰基化反应
3) 氧化和还原反应
试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺
（1）酶的稳定性 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、 抑制剂等 （2）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大 小、性状、亚基数等 （3）酶侧链基团的性质及其反应性 巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、 胍基、吲哚基、二硫键、硫醚基等
二、修饰剂的要求
1、修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质 的吸附性
三）、修饰剂反应性的决定因素
1. 选择性吸附：化学修饰前，修饰剂根据各自的 特点，选择性地吸附于低或高极性区的，有时 可以根据对速度的饱和效应，检测出蛋白质 修饰剂复合物的形成，类似酶-底物复合物。
2. 静电相互作用：带电的修饰剂能选择性地吸引 到蛋白质表面带相反电荷的部位。该作用可使 修饰剂向多功能部位中的一个残基定位，或向 双功能基一侧定位。此外，静电排斥力能抑制 修饰作用。
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量 不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时 酶的活力回收高。 （1）pH与离子强度
pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。 由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。
（2）修饰反应的温度与时间
严格控制温度和时间可以减少以至消除一些 非专一性的修饰反应。
（3）反应体系中酶与修饰剂的比例
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解 酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解 酶：
A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白 水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键 免遭破坏。 B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后， 减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇， 与修饰剂形成了共价键。 破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至 消除； “遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、 抗体结合。
例：如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电 状态或溶解性，则必须选择能引入 最大电 荷量的试剂。
用于修饰酶的氨基酸残基的试剂应具备： 选择性地与一个氨基酸残基反应； 反应在酶蛋白不变性条件下进行； 所标记的残基在肽链中稳定以易于分离 鉴定； 修饰反应的程度能简单测定；
三、反应条件的选择
2.小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）
•定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子 侧链上特定的功能基团发生化学反应。
•侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主
要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。
•侧链基团修饰剂：采用各种小分子化合物。
20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的
侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。
可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑
基，酚基等。
还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。
可被还原的侧链基团：二硫键。
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
4) 芳香环取代反应
•试剂：卤（碘）化，硝化试剂。
碘代：
•
I2＋
+ HI
硝化：
• (NO2)4C
+
+(NO2)3CH
苯乙二醛
5）、酚基和羟基（—OH）修饰 酶蛋白中含羟基的氨基酸残基有：Ser、Thr、 Tyr
羟基的专一性修饰较困难，通常修饰剂能同
时修饰羟基、氨基和巯基 Tyr 的酚羟基相比于 Ser 和 Thr 的羟基要活泼 一些，更容易发生修饰；酚基具有芳香性， 能发生亲电取代反应
修饰反应 —— 酚基和酚羟基
例如：酶固定到电荷载体上，由于介质中的质子靠
近载体，并与载体上的电荷 发生作用，使酶的最适 pH发生偏移。 糖化酶固定到阴离子载体上，最适pH4.5升到6.5， 与D-木糖异构酶的最适pH7.5 靠近，可简化高果糖 浆生产工艺。
载体与底物带相同电荷，固定化后反应系统
Km增加，反之，Km降低。 增加酶分子构象稳定性。
硼氟化三甲洋盐
甲醇
3）、巯基（—SH）修饰 巯基在酶蛋白中的来源是 Cys 的 -SH 巯基的亲核性强，往往是酶分子中反应活性 最高的基团 巯基容易被氧化成 —S—S—，在维持蛋白亚基 之间的相互作用和酶催化过程中起重要作用 巯基用烷基化试剂修饰后一般能得到稳定的 修饰产物
修饰反应 —— 巯基
酚基亲电取代反应
碘化反应
四硝基甲烷(TNM)
修饰反应 —— （酚）羟基
O-酰基化反应
1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能 力）。 4）产生新的催化能力。
五、酶化学修饰的原理
1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与 酶形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。 2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的 空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮 盖”了酶的活性部位。
白质侧链基团的亲核性与其pK值相关。
影响蛋白质侧链基团pK值的因素有： 1、微环境：微区极性、基团间的氢键、静电相互作 用 2、基团之间的障碍（位阻效应）
3、其它因素：电荷转移、共价键形成、金属螯合、
旋转自由度等
二）、蛋白质功能基的超反应性
超反应性：指蛋白质的某个侧链基团与个别试剂
能发生非常迅速的反应。
在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起 重要作用
胍基碱性强中性或 弱碱性条件下反应，一般是可逆反应
修饰反应 ——
需在黑暗中进行, 因其可作为光 胍基（与邻二酮的反应） 敏剂破坏Trp\His\Tyr等残基
硼酸盐
丁二酮
硼酸盐 1,2-环己二酮
（四硝基甲烷）
特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
氨基修饰（Lys）
羧基修饰（Asp、Glu） 巯基修饰（Cys）
胍基修饰（Arg）
羟基修饰（Ser、Thr、Tyr） 咪唑基修饰（His） 吲哚基修饰（Trp） 甲硫基修饰（Met）
二硫键修饰
亲和修饰
1）、 氨基（—NH2）修饰 氨基在酶蛋白中主要是 Lys 的 -NH2 和肽链末 端氨基 非质子化的 -NH2 亲核反应活性很高，易被选 择性修饰 一般情况下 -NH2 的 pKa = 10，其解离程度取 决于微环境 氨基的修饰反应主要有N-烷基化等
1、稳定性不够，不能适应大量生产的需 要。 2、作用的最适条件不符。 3、酶的专一性 4、米式常数过大 5、临床应用的特殊要求 6、酶活性不够高