Westernblot基本操作步骤
W e s t e r n b l o t基本操作步骤
一、细胞蛋白的提取
弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mMPMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于westernblot的蛋白样品取一定量加4×loadingbuffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。
二、BCA法测蛋白浓度操作步骤
将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。
完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为ml。
据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。
加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。
各孔加入100μlBCA工作液，37℃放置30分钟。
测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。
三、Westernblot基本操作步骤
1、溶液配制：
①RunnigBuffer(1×)：SDSRunnigBuffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L；
②TransferBuffer(1×):TransferBuffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L；
③TBST缓冲液
1MTris·HCl（）：60.5gTris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至，加MiliQ水至500ml。TBS缓冲液（10×）：1MTris·HCl100ml+80gNaCl加MiliQ水1L
TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+（%，v/v），加MiliQ水至1L。
④封闭液：5%BSA（5g/100ml，称取1gBSA至20mlTBST，充分混匀溶解）
2、样品准备与加样
①用4×SDSloadingbuffer,10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。
②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满RunnigBuffer(1×)，内槽加入抗氧化剂，小心拔下梳子；
③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入
μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loadingbuffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。
3、电泳
将电泳装置与电源连接。调节电压为100-200V，电泳50min，直至溴酚兰接近分离胶的底部，然后关闭电源并撤去连接的导线。
拆除电泳装置：先倒掉电泳缓冲液，连同槽一起将凝胶夹层取出，小心的撬起凝胶外层塑料板，使凝胶暴露出来，切去浓缩胶以及无蛋白样品的凝胶部分（将胶留在短的一面塑料板上）。
4、转膜（湿转）
①将转膜液（1×TransferBuffer）放于大饭盒内，泡4片海绵，剪4片滤纸、1片PVDF 膜，PVDF膜于甲醇中活化30s，取出置于转膜液中；
②按照2层海绵+2层滤纸+胶+膜+2层滤纸+5层海绵（填满）的顺序组装转膜装置，注意组装此装置时一定要保证滤纸、膜、凝胶精确对齐并不留气泡；
③将组装好的装置放入电转槽，合上盖子，电转槽置于冰浴，接通电源，调节电压为15V，时间为16~18h（或恒流300mA,3h）。显示红灯亮后，按下Start后，开始转膜。转膜方向为蛋白从负极（黑色）转向正极（红色）。
5、免疫印迹反应及化学发光检测
转膜完毕后，根据目的蛋白分子量将膜剪成不同的条带，用封闭液（5%BSA）室温封闭2h。弃封闭液，加入用新的封闭液稀释的一抗（可回收），室温2h或4℃过夜。用TBST清洗3次，10min/次。
二抗（可回收）室温孵育1小时，室温1xTBST洗涤3次，每次约10min。
此步开始避光操作：将膜浸入化学发光底物工作液（A液：B液=1:1，终体积即可）中，显色2分钟，放入BIO-RAD凝胶成像系统中显影。
内参分子量：β-actin：42kDa
GAPDH：36kDa
Tubulin:51kDa
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤 一、组织的研磨 准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。 ②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织 呈干粉状。 ③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。 ④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋， 于-80℃保存。 注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。 2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。 3.每种样品都最好留有副管，备用。 二、裂解提蛋白 准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1 若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂） 步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。 ②盖好盖子，在冰上裂解30~40min. ③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃ 保存。 注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。 三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒） 准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床 步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA 工作液。 ④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μl BCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。 ⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度 可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。 注意：1.标准曲线一般做两组，取最好的标准曲线计算。 2.蛋白浓度=（蛋白含量/总体积）×稀释倍数[μg/μl] 3.保证样品液中的蛋白含量相同（500μg/100μl）,则取10μl样品液中含有50μg蛋白。 4.样品液稀释液要再沸水浴中煮10min（可用微波炉加热），放凉至室温后于-20℃保存。 四、SDS-PAGE蛋白质电泳 (一)、配胶 准备：凝胶液各成分、电泳板、制胶架、梳子 步骤:①选择适合电泳板（0.75mm:1.0mm:1.5mm），用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗，将玻璃板夹入玻璃板夹，注意底部对齐，夹好后卡到制胶架上。 ②首先配制分离胶（一般用12%的SDS-PAGE分离胶），按分离胶配方配制，配胶时最后加APS和TEMED，迅速混匀，注意减少气泡的产生。 ③将配好的分离胶迅速加入玻璃板之间至梳子下约1cm处（绿色线处），不要有气泡。灌好胶后用蒸馏水覆盖胶层，加满蒸馏水至玻璃板顶端，以利于丙烯酰胺的聚合。室温静置约30min至胶层与水层检出现明显界限。若室温过低可将其置于37℃烘箱中。 ④配制浓缩胶（5%的Arcymalide浓缩胶），混匀，注意减少气泡产生。 ⑤带分离胶聚合后，倒掉上层水，将混匀的浓缩胶沿玻璃板壁小心加在分离胶上至较短玻璃板顶端，插好梳子，不能有气泡，室温静置20~30min至凝胶聚合。 注意：1.夹好玻璃玻璃板后用水检查其是否漏水。 2.12%分离胶配方：
Westernblot实验操作详细步骤
Westernblot实验操作详细步骤 1.样本制备： a.收集细胞或组织样本并加入提取缓冲液，破碎细胞或组织以释放蛋白质。 b.用超声波破碎机或搅拌器处理样本，使其彻底破碎。 c.避免加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白质的降解。 2.蛋白质分离： a.将样本加入离心管中，并用高速离心分离细胞碎片和细胞核。 b.收集上清液，其中包含溶解的蛋白质。 3.蛋白质浓度测定： a. 使用BCA或Bradford等方法测定提取的蛋白质浓度。 b.根据需要调整蛋白质浓度，以确保每个样本使用相同的蛋白质量。 4.准备SDS-凝胶： a.准备解聚凝胶和浓缩凝胶以进行垂直电泳。 b.根据需要选择合适的胶百分比和凝胶组装器。 c.制备足够的凝胶和凝胶缓冲液。 5.蛋白质电泳： a.将蛋白质样本加入加载缓冲液，并在煮沸过程中使其变性。 b.将蛋白质样本加载至凝胶槽中。
c.根据需要在凝胶中加入预定分子量标记物，以便于蛋白质分子量的 确定。 d.以恒定电流进行电泳，直到预定分子量标记物到达所需位置。 6.蛋白质转膜： a.选择合适的膜材料（例如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素）。 b.用蛋白质转膜装置将凝胶上的蛋白质转移到膜上。 c.确保膜与凝胶完全贴合，并尽量避免气泡的产生。 7.阻塞和抗体孵育： a.将膜放入含有5%非脂奶粉或1%牛血清蛋白的TBST缓冲液中进行阻塞。 b.在蛋白质靶向抗体中稀释贮存液，并使用适当的稀释倍数进行孵育。 c.将膜和抗体一起放入摇床或孵育箱中，在适当的温度下进行孵育。 8.洗涤： a.用TBST缓冲液洗涤膜以去除未结合的抗体。 b.进行3至5次洗涤，每次洗涤持续5到10分钟。 9.二次抗体孵育： a.将膜放入稀释过的二抗溶液中进行孵育。 b.孵育时间和温度根据抗体种类和需求进行调整。 10.再洗涤：
western-blot步骤
western-blot 实验流程： 一、裂解细胞： 1、收集细胞。1000rpm,5min.弃上清，加1ml PBS,混匀，移至EP管。 2、4℃，1000rpm,5min。弃上清，加1ml PBS，4℃，1000rpm,5min再洗一次。 3、配制裂解液（见附录一）： WB buffer 500μl Na3VO4 5μl 配方一：Na4P2O7 5μl PMSF 5μl Cocktail 5μl 1×107/ml裂解液，冰上孵育15min（每隔3~5分钟混匀一次），13000rpm(或16000rpm)，4℃，离心10min.分装上清液（裂解蛋白），－20℃保存。（一般另取5μl，作蛋白定量用） 配方二：RIPA 配方三：Nuc Buster TM protein extraction Kit 二、蛋白定量（BCA法，Bio-Rad）： 1、工作液的准备 每ml A试剂中加入20ul的S试剂（此工作液在1周之内稳定，但在配制1天后会形成沉淀。若有沉淀形成，加热并旋涡混匀使沉淀溶解，勿用Tip吸取沉淀） 若样品中不含去垢剂，此步骤可省略，直接使用试剂A。 2、将蛋白标准液稀释，浓度从0.2mg/ml至1.5mg/ml。稀释液与样品的溶解液相同。 3、待测蛋白做相应的稀释。（一般稀释2.5或5倍） 4、每孔加入5ul标准蛋白溶液和待测蛋白溶液。 5、每孔加入25ul的试剂A或试剂A’ 6、每孔200ul试剂B，轻轻混匀，室温放置15分钟，650-750NM检测吸光度。
三、配胶： 10% (10ml，1小板) 8% (50ml，1大板) 分离胶：40% Acr-Bis 2.5ml 10. ml 1.5M Tris-HCl PH8.8 2.5ml 12.5 ml H2O 4.8ml 26.5 ml 10%SDS 100ul 500ul 10% AP（H2O现配）100ul 500ul TEMED 4ul 30ul 注：大板——> 0.3cm梳子（大齿）50ml;0.5cm梳子（小孔）65ml. 浓缩胶：(5ml, 1小板) 40% Acr-Bis 625ul 1.0M Tris-HCl PH6.8 625ul H2O 3.7ml 10%SDS 50ul 10%AP 50ul TEMED 5ul 四、样品处理： 配方一： sample buffer：0.5M Tris-HCl, PH6.8 1.0ml 5×Glyceral 0.8ml （8ml）10%SDS 1.6ml 二巯基乙醇0.4ml 0.05%溴酚兰（用水配）0.4ml H2O 3.8ml 配方二（常用）：
westernblot步骤
Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Poly tron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradf ord比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。 4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参 考如下步骤进行操作。
Western Blot 步骤
Western Blot 步骤： 1、样品处理（细胞样品的处理）： 1）培养细胞或药物处理 2）弃上清，1*PBS漂洗细胞2遍，去尽残留培养基 3）加入1*SDS电泳缓冲液，刮落细胞，转移到EP管中（注意冰上操作）4）4摄氏度下搅拌30分钟 5）4摄氏度离心，转速和时间根据细胞不同进行改变，一般是12000转/分，20min。 6）离心管取出，置于冰上，吸取上清，其余丢弃。 7）测定蛋白浓度（BSA、BCA、Lowry、Bradford法），-20摄氏度或-70摄氏度冻存备用。 8）加入Loading Buffer， 95~100摄氏度煮沸5min，若测多种蛋白时，70摄氏度加热5~10分钟更为合适。 2、配胶：将两块玻璃清洗干净，先用洗洁精，再用70%乙醇，最后用ddH 2 0， 有Bio-Bad字样朝上，完成后加入H 2 O，约10分钟，确认无漏水后倒出 H 2 0，残留的用滤纸吸干（不要伸到里面去，倾斜后在边缘吸）。 3、根据分子量大小配分离胶:在干净的15mL离心管内配制（过硫酸铵APS 最后加入，且需分装），混匀，用1mL枪加至绿线下方1~2mm处，注意不 要将液体全打出来，防止气泡产生，从一边到另一边缓缓加入无水乙醇， ddH 20溢出后，室温放置25~30分钟，可看到分离胶与ddH 2 0之间有一条 清晰的分界线，倒出上层的乙醇，并用ddH 2 O洗涤两遍，用滤纸吸去残留的水。（Tris pH：8.8，配制10mL的量） 4、配制浓缩胶：APS最后加入，快速加至液体溢出，将清洗干净的梳子水平 插入，擦干外面，静置60分钟后应用于下一步试验；或4摄氏度冰箱过夜。（Tris pH：6.8，一般配制4mL的量） 分离胶与浓缩胶的pH一定要调准，否则严重影响实验结果。APS1周内使用。 5、加样：将配制好胶的玻璃板轻轻取出，不可分离，放入电泳仪，矮面朝内， 放平加紧，倒入1*电泳缓冲液，最好内外液面基本持平，或外液面稍矮，放置检查有无漏电泳液，电泳液配制约1000mL，如果电泳仪有漏液情况，则配制1200mL，使内外液面基本持平。 6、在电泳液中轻轻取出梳子，使加样槽中注满电泳液，然后加样，Marker 加10微升，每孔加样量有具体情况决定（主要依据蛋白浓度，每孔蛋白
Western Blot 详细实验步骤
Western Blot protocol 1，制样：将获得的细胞用PBS洗涤，300gx4℃x5min,弃去上清。加SDS loading buffer 搅拌转移到1.5ml离心管。放到干浴锅100℃煮10min，放入冰上5min，最后存入-20℃冰箱待用。 2，将样品取出待用，可100℃煮2min，待上样。 3，配胶：浓缩胶5%，分离胶8%，10%或12%（分子大用低浓度，分子小用高浓度Caspase3 35kD，12%浓度(活性形式17kD)；DAPK1/p-DAPK1 160KD 18%浓度）：ddH2O，30%Acrylamide, 1.0M/1.5MTris-HCL, 10%SDS, 10% AP, TEMED按比例加。 1）夹好板子，用ddH2O捡漏，5min。 2)按照顺序加入试剂配胶配分离胶（50ml管子），混匀。 3）加胶7ml，大致与夹子的门平齐。随后轻轻加3ml乙醇液封页面。静置 30min。 4）将乙醇倒掉，用ddH2O清洗3遍。 5）制备浓缩胶，加入3ml左右只玻璃板界面，插入梳子。 6）静置30min后拔掉梳子。取下玻璃板用ddH2O 冲洗边缘。 7）若不立即使用可用保鲜膜将其包好放在4℃冰箱。（TEMED在灌胶前加入）4，上样： 1）固定好玻片，加入running buffer 没过底板，盖上盖子。 2）浓缩胶75-80V 30min左右，分离胶100V-120V 1h左右。 5，转膜： 1）取出玻璃板，用切胶器轻轻撬动取掉小玻片，切去浓缩胶（将分离胶放入放
入ddH2O水中浸泡5min，重复三次）再放入trans buffer中放置10min。2）剪一块与胶一样大的PVDF膜放在甲醇中浸泡，使其带正电。 3）将PVDF，海绵垫，滤纸放入trans buffer浸泡几分钟。 4）在黑色面板依次放入海绵垫，至少3层滤纸，胶，转移膜，注意不能有气泡，再放滤纸，海绵垫形成夹心结构。(大分子用0.4 um PVDF 膜，小分子用0.25um PVDF膜)。 5）关上夹子将其转入放在冰上的电泳槽，黑对黑，白对红，加trans buffer关上盖子。200mA 1-2h或恒压100V 1-2h（大分子250mA 3小时左右）。 6，免疫反应： 1）取出膜，与胶接触的为正面，正面朝上，放入牛奶或5%TBST牛血清中摇床2h封闭，或放入4℃冰箱过夜。 2)倒掉封闭液，分别剪下有内参蛋白和待测蛋白的膜，分别加内参抗体TBST：抗体=10000:1 5ml左右，待测抗体TBST：抗体=1000:1 5ml左右（最好分开孵育当A蛋白和B蛋白分子量差别5KDa以上（10KDa左右更保险），可将膜分割开（分别标记不同的抗体），这样就不需要stripping膜重新标记，且一次就能得到想要的结果。有人会将两种抗体混在一起标记整张膜，这样操作的前提是非常熟悉这两种抗体的杂带位置，且各自的杂带都不会干扰目的蛋白才可以如此操作；并且这样的抗体下次使用有了局限性，因此不太推荐) 在摇床上孵育1-2h，较难杂的4℃孵育过夜或者更久。 3）回收一抗。用TBST在摇床洗膜4次，每次10-15min左右。(再用TBS洗一次10min)。 4)孵二抗浓度1:1000，1h。
Western Blot操作流程
Western Blot操作流程 本人将自己做WB实验时的具体操作流程，做了详细的记录并整理。因为每个实验室的条件不一样，所以本流程仅供参考，具体适合自己的实验操作需要大家摸索。由于知识量有限，有些描述用词并不专业，请大家谅解。 一、流程图 制胶→→电泳跑胶(1.5-2.5h)→→转膜（3h）→→（可使用立春红检测是否蛋白是否成功转移）TBST清洗（10min）→→封闭（2h）→→TBST清洗（10min）→→附Ⅰ抗（内参：小鼠抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜）→→TBST 清洗三次（10min/次）→→附Ⅱ抗（内参：山羊抗小鼠，轻摇 1.5h）→→TBST清洗三次（10min/次）→→显影 二、物料及配制 1、电泳液：一包电泳粉+1000ml双蒸水（可回收使用） 2、10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+10ml双蒸水 3、转膜液：一包转膜粉+800ml双蒸水+200ml甲醇（可回收 使用） 4、TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml双蒸水+1ml吐温20。（无 需回收） 5、封闭液：购买 6、Ⅰ抗（内参）：将小鼠抗β-Actin：Ⅰ稀释液按1:500稀 释待用，4度保存。
Ⅰ抗（目的蛋白58kDa）：将smad2：Ⅰ稀释液按1:1000 稀释待用，4度保存。 7、Ⅱ抗（内参）：将山羊抗小鼠：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀 释代用，4度保存。 Ⅱ抗（目的蛋白58kDa）：将山羊抗兔：Ⅱ抗稀释液按 1:5000稀释待用，4度保存。 7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使用 8、定影液：按说明书配制，可长期回收使用 9、发光液：超敏发光液A液：B液=1:1 三、步骤 （一）制胶 1、Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液的配制 2、Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所用溶液 3、1）将规格1.0mm或其它规格的玻璃板固定好。 2）依次将所需试剂加入烧杯中，加入TEMED之后，混匀，用
western blot步骤
提取细胞蛋白 步骤：1、配蛋白裂解液（蛋白酶抑制剂：RIPA裂解液=1:100） 2、培养瓶弃去培养液，用PBS冲洗2遍 3、用枪吸干PBS，加入80μl裂解液 4、用刮刀刮下壁上细胞，吸入置于1.5ml EP管中 5、超声，每次6-8下，间隔5min，2次-3次 6、裂解30min，离心，13500转，10min 7、铺96孔板中测蛋白浓度， 每孔19μl裂解液，1μl样品，200μl工作液（A液：B液=50:1） 8、96孔板于培养箱中孵育30min 9、放入酶标仪中测浓度 10、剩余蛋白吸入0.6ml EP管于-80℃中冻存 提取组织总蛋白：取材时，应涮去组织表面的血，影响吸光度。 步骤：1、配裂解液（裂解液：10%SDS：蛋白酶抑制剂=60:40:1） 2、研磨组织块，加300μl裂解液 3、超声，3次，每次间隔5min 4、冰中静置30min，裂解 5、4℃离心13500转25min，吸取上清液至1.5mlEP管 6、配工作液：BCA试剂A液：B液=50:1 7、铺入96孔板，依次加入19μl RIPA裂解液/PBS、1μl样品、200μl工作液，混匀（枪头在液面下，不产生气泡）放入37℃孵育20min 8、放入酶标仪中测蛋白浓度：96孔板放入酶标仪中，进板—开始检测—bca562—read plate—Read—完成—结果（不能时间过长，否则检测的OD值偏高） 9、剩余样品分装（避免蛋白降解）于0.6ml EP管，50μl/管 10、保存于-80℃ Western blot 步骤：一、配胶，准备样品（10%的胶） 1、胶板中倒入去离子水，静置5min，观察是否漏水，并用滤纸垫脚调平 2、弃去去离子水，加入分离胶（10%），用去离子水封口 3、40min左右，分离胶凝固，倒去去离子水，加入积层胶 4、快速插入梳子（以免积层胶凝固，梳子要用去离子水冲洗干净，并将去离子水 甩掉，否则会在胶板上留下不能用的孔道） 5、20min左右，将胶板置于去离子水中4℃保存，防止胶中的水分蒸发，发生缩 胶现象。 Tips:倒胶时，垂直涡旋混匀后，等气泡上升后，在倒入胶板中。 待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置， 前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS 可水解聚丙烯酰胺。胶板配完后30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因 为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。 根据OD值，算出浓度及上样量（150μg），加入RIPA/PBS配平，加入5*loading后置100℃煮5min，瞬离，放于-20℃保存待用。（此操作过程在冰域中进行），蛋白样上样前需瞬离。 二、电泳液，转膜液的配制 1*电泳液 3.02g tris base +15.0 g 甘氨酸+1g SDS 加入1000ml去离子水
Westernblot实验步骤(总结版)
Westernblot实验步骤（精华） 一、准备物品 仪器设备：细胞刮刀、眼科剪、组织破碎仪，低温高速离心机、酶标仪、 金属浴、电泳仪、电泳槽、剪刀、孵育盒、凝胶显像系统等 试剂耗材：RIPA裂解液、PMSF、磷酸酶抑制剂、1.5mlEP管、冰块、BCA蛋 白浓度试剂盒、5xlodingbufer、蛋白Maker等 二、技术原理 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进 行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 三、操作步骤 蛋白提取 （1）组织总蛋白提取：从液氮或负80冰箱中取出保存的组织标本，称重，用眼科手术剪刀剪碎，按质量体积比1:10放入含有PMSF和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液中（RIPA：PMSF：磷酸酶抑制剂=100：1：1），EP管中，在冰上用电动组织研磨器充分研磨混匀，裂解 20min。低温高速离心机转速为 14000g，温度为4℃，时间为 10min。离心完成后小心取出上清液，均等分装到新的 EP 管中，放入-20℃冰箱中保存。 细胞蛋白提取：取出细胞培养板，无菌PBS洗三次，冰上操作，加入含有
Westernblot基本操作步骤
W e s t e r n b l o t基本操作 步骤 Last updated on the afternoon of January 3, 2021
W e s t e r n b l o t基本操作步骤一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含 1mMPMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液 12000rpm离心10min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于westernblot的蛋白样品取一定量加4×loadingbuffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA 工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS到20μl。 各孔加入100μlBCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Westernblot基本操作步骤 1、溶液配制： ①RunnigBuffer(1×)：SDSRunnigBuffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②TransferBuffer(1×):TransferBuffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ 水至1L； ③TBST缓冲液 1MTris·HCl（）：60.5gTris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至，加MiliQ水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1MTris·HCl100ml+80gNaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+（%，v/v），加MiliQ水至1L。
WesternBlot（免疫印迹法）步骤
WesternBlot（免疫印迹法）步骤 主要包括以下4 个基本步骤：样品制备；电泳分离；蛋白的膜转移；免疫杂交与显色――蛋白检测。 溶液和试剂 1. 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) 2. ModifiedRIPAbuffer：Tris-HCl:50 mM, pH 7.4； NP-40: 1%；Na-deoxycholate: 0.25%；NaCl: 150 mM；EDTA:1 mM；PMSF: 1 mM；Aprotinin,leupeptin,pepstatin:1 microgram/ml each；Na3VO4: 1 mM；NaF: 1 mM 3. 1X SDS 样品缓冲液：62.5 mMTris-HCl(pH 6.8 于25° C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mMDTT, 0.01% w/v溴酚蓝 4. 转移缓冲液：25 mM Trisbase, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3) 5. 10X Tris缓冲盐 (TBS)：准备1L 10X TBS：24.2 g Trisbase, 80 g NaCl；用1N HCl调pH为 7.6 7. 甲醇 8. TBS/T缓冲液：1X TBS, 0.1% Tween-20 9. 封闭缓冲液(TBS/T)：1X TBS,0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA 10. 一抗的稀释：1X TBS,0.1% Tween-20 加 5% BSA ( 多抗) 或5%脱脂奶粉( 单抗)。Note：一般来说，BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。预染的蛋白质marker，可用于监测转膜的效率。 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1.培养细胞或药物处理。 2.弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
western blotting的基本操作过程
western blotting的基本操作过 程 Western blotting是一种常用的分子生物学技术，在蛋白质分析中具有重要的应用。它可以用于检测、分析、定量和分离蛋白质分子，并广泛应用于生物医学、病理学、免疫学、遗传学等领域。本文将介绍Western blotting的基本操作过程，以帮助读者了解和掌握Western blotting技术的实验操作。 一、材料准备 在进行Western blotting之前，必须准备好所有需要的材料和试剂。首先需要制备胶液和凝胶，包括聚丙烯酰胺凝胶、缓冲液、Tris-HCl缓冲液、SDS-PAGE凝胶、封盘液、扩增液等。此外，还需要准备电泳装置、电源、电极、磁力搅拌器、主机等实验设备。 此外，还需要准备细胞或组织样本，并提取蛋白质。提取蛋白质的方法有很多，目前常用的包括酚/氯仿法、三氯乙酸法、离子交换柱法、氨基酸顺序法等。 二、电泳分离
Western blotting是基于电泳的分析方法，因此第一步是将提取的蛋白质进行电泳分离。在分离之前，必须将样品加入载体缓冲液，以确保其稳定性和一致性。 将样品加入凝胶槽中，用电泳装置进行电泳分离。在电泳期间，缓冲液通过电解质稀释样品。当电流通过凝胶时，带电粒子会在电场中移动，分离出不同的组分，最后嵌入凝胶中。分离后的蛋白质按照其分子量大小排列，从而形成一条蛋白质带。 三、转膜 将蛋白质分离带从聚丙烯酰胺凝胶中转移到聚氟乙烯膜上，这个步骤称为转膜。转膜要求将聚氟乙烯膜浸泡在沉淀剂中，使其吸水并增加其静电位，然后放置在集装箱中。 加入转移缓冲液、荷载样品和过硫酸铵，启动转移。转膜电源把电流传递到电极板上，导致电子从内极板流向外极板。这个过程产生的电流足以推动带电粒子（即蛋白质）从凝胶中转移到聚氟乙烯膜上。由于膜具有不吸水的特性，其吸附的蛋白质能够保持原来的位置和形式。借助荧光染料可以对蛋白质进行原位成像，并进一步进行分析。 四、免疫分析
westernblot步骤
westernblot步骤 Western blot是一种常用的蛋白质检测方法，它可以用于检测特定蛋白质在复杂混合物中的存在与相对丰度。以下将详细介绍Western blot的步骤。 1.样品制备： a.收集要检测的细胞或组织样品。 b.使用相关的提取缓冲液将细胞或组织样品打破，以释放蛋白质。 c.加入蛋白酶抑制剂，以防止蛋白质降解。 d.离心样品，收集上清液。 2.蛋白质浓度测定： 使用BCA或Bradford等方法测定蛋白质的浓度，以确保加载相同量的蛋白质。 3.SDS-凝胶电泳： a.准备10%至15%聚丙烯酰胺凝胶。 b.载样品，将蛋白质样品加入凝胶孔中。 c.进行电泳，通常使用常数电流（通常为20mA）直到蛋白质样品进入分离凝胶。 d. 将蛋白质转移到PVDF或Nitrocellulose膜上，通常使用湿法转印或半湿法转印技术。 4.膜上的非特异性结合阻止：
a. 将转印膜放入TBST缓冲液（含0.1% Tween-20）中，进行洗涤以 去除凝胶残留的云母号染料。 b.在5%非脂乳蛋白或蛋清中，对膜进行非特异性结合阻止，防止非 特异性抗体结合。 5.一抗与膜上的特定蛋白质结合： a. 在适当的抗体稀释液中稀释抗原识别抗体（Primary antibody）。 b.在膜上孵育过夜，以使特异性抗体与膜上的特定蛋白质结合。 c.对膜进行多次洗涤，以去除未结合的一抗。 6.二抗与一抗的结合： a. 在适当的抗体稀释液中稀释二抗（Secondary antibody），二抗 通常是对一抗进行特异性结合的标记物（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等）。 b.在膜上孵育，使二抗与一抗结合。 c.对膜进行多次洗涤，以去除未结合的二抗。 7.信号检测： a.添加底物，通过一些酶促反应，使标记物（如辣根过氧化物酶）生 成可观测的荧光或颜色变化。 b.使用化学发光仪、显微镜或暗房设备进行信号检测。 8.图像分析与数据解释：
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤 一、概述 西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。 二、原理 1.SD S-PA GE电泳分离 -准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。 -加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。 -电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。 2.转膜 -准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。 -预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。 -转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。 3.免疫检测 -封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。 -孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。 -二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。 -显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。 三、操作步骤 1.准备样品 -将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。 -完全溶解样品，可加热至95°C处理。 2.SD S-PA GE电泳分离 -准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。 -加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。 -启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。 3.转膜 -准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。 -预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。 -转膜：将电泳分离后的凝胶取出，与预处理好的转膜膜层叠，将其放入转膜装置中，施加适量压力进行转膜。 4.免疫检测 -封闭：将转膜后的膜放入封闭液中，室温摇晃孵育一段时间，阻断非特异性结合位点。 -孵育：将膜与目标蛋白特异性一抗抗体孵育，可以在4°C室温下进行孵育过夜。 -洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
Western Blot 步骤
Western Blot 步骤 westernblot步骤 8.1.3细胞收集与裂解 （1）细胞搜集：常规胰蛋白酶消化、Vergt搜集细胞于1.5mleppendorf无菌管，并搞好标记。（2）细胞冲洗：4℃，2500rpmVergt5分钟，用4℃预冷的1×pbs冲洗两次。（3）细胞水解：用100μl事先包好的所含1mmpmsf的ripa水解液王繇漂浮细胞，放进-20℃冰箱15分钟，再次王繇漂浮，放进-20度冰箱15分钟。（4）蛋白Vergt：如此重复两次后，4℃，12000rpmVergt10min，拉苏特兰明（蛋白质）。（5）蛋白总浓度测量：挑5μl（或2-5μl）上清用bca蛋白浓度测量试剂盒测量蛋白总浓度，实验根据说明书实验步骤操作方式，测到蛋白-喷光度标准曲线及各组蛋白总浓度。（6）蛋白变性：余下蛋白样部分以4:1的体积比与5×sds-page蛋白上样缓冲液搅匀，沸水浴5min。（7）蛋白浓度均一化：等待样品自然加热后，根据蛋白浓度测量结果，用ripa吸收不好的1×sds-page蛋白上样缓冲液将各组蛋白阳入至相同浓度，放进-20度冰箱留存水泵。 8.2sds-page胶配制 （1）10%sds-page下层胶酿制：按照说明书，依次重新加入适当体积的超纯水、30?r-bis、下层胶缓冲液（4×）、10%aps和temed，充份王繇搅匀后重新加入1mm厚度横向电泳槽中，在胶上方轻轻重新加入超纯水压胶并使胶上表面维持平坦。（2）5%sds-page上层胶酿制：室温下置放40min左右后，将甩胶用的超纯水死掉，去除整洁，按照说明书，依次重新加入适当体积的超纯水、30?r-bis、下层胶缓冲液（4×）、10%aps和temed，充份王繇搅匀，将包好的上层胶溶液提在下层胶上面，填入梳子。 8.3蛋白电泳及转膜 （1）蛋白电泳：等待电泳胶凝结不好后，将胶板放进电泳槽内，重新加入电泳液，横向取下梳子，在加样孔中依次重新加入等量制取不好的样品及4μl蛋白标准；90v恒压下电泳，等待样品迁移至上层胶和下层胶界面处后，将电压换成恒压110v。在蛋白命令线电泳至距下端1cm左右时中止电泳。 （2）蛋白转膜：待蛋白标准各条带充分分离后，停止电泳；根据所需要的蛋白大小及蛋白标准条带切取所需要的蛋白，将pvdf膜做好标记并记录，用甲 醇活化30s左右后，按照胶在阴极、pvdf膜在阳极的原则，在包好的转膜液中展开170ma恒确权膜，转膜过程中周围提冰水降温。 8.4抗体孵育及显影 （1）pvdf膜半封闭及冲洗：恒确权膜2h，关上电泳仪电源，抽出转回上蛋白质的pvdf膜，放进封闭液中，封闭液半封闭1-2h后，1×tbst冲洗2次，每次5min。（2）一
Western_Blot实验方法步骤
Western_Blot实验方法步骤 Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n样品制备 n电泳分离 n蛋白的膜转移 n免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐 (TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH 为 7.6 n脱脂奶粉或BSA n甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n封闭缓冲液（TBS/T）
1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加 5% BSA (多抗)或 5%脱脂奶粉(单抗) Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或 75 cm2 plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声 10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western 杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。 注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）
western的操作步骤
W e s t e r n B l o t操作全过程一，收蛋白 a 如果要收集死细胞 1.取冰,将4°C离心机提前降温。 2.将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍,用适量的 胰酶消化,用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来,收集到离心管,室温离心1000rpm,5min。 3.弃上清,将离心管倒扣在滤纸上,尽量吸尽残留上清。 4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。 1×Cell Lysis Buffer： PMSF=100：1,1×Cell Lysis Buffer,PMSF-20°C保存。PMSF常温易降解,拿出时间不得超过30min,必须放置冰上。 5.冰上裂解15min,将裂解液转移至EP管离心,4° C,12000rpm,15min。 6.小心将上清转移至另一EP管,记下吸取的量。如：100μL。 7.将收集好的蛋白保存与—20°C。可长期保存 b 如果不收集死细胞 1．弃上清,孔板PBS洗1-2遍,吸尽PBS。在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。同上 2．冰上裂解15min,用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。不同的孔不能用同一个刮子,刮前用水冲洗,擦干。 3．将裂解液转移至EP管离心,4°C,12000rpm,15min。 4．小心将上清转移至另一EP管,记下吸取的量。
5．将收集好的蛋白保存与—20°C。可长期保存 二，测蛋白浓度 BCA法或者按照自己的试剂盒说明操作 1.需96孔板,测蛋白浓度的A液,B液,标准蛋白,要测的样品蛋白。 2.按要测的样品蛋白的数量来配AB液,每孔需AB混合液80μl A： B=50：1 。例：有5个样品,加上5个标准蛋白和空白对照。共有11个孔。则A液取11×80=880μl,B液取880÷50=17.6两液混匀,加入96孔板,每孔80μl。然后加入标准蛋白及样品蛋白4μl。 标准蛋白先配好浓度125,250,500,1000,2000 3.将孔板放入37°C温箱孵育30min。 4.用酶标仪测蛋白浓度。 5.记下蛋白浓度,根据要上样的μg量算出μl量。例：蛋白浓度为 1000,需上样15μg。则需上样15÷1000= 上样量不超过20μl。三，配胶 1.将薄板和厚板用洁净的布擦干净,对齐,夹好。板必须擦干净,下 端对齐,否则容易漏胶。 2.配分离胶,根据要跑的蛋白分子量,配相应浓度的胶。 3.快速将分离胶加入薄厚板之间,不能太满,留出浓缩胶的部分。 浓缩胶高度大约1CM 4.在分离胶上灌水,要缓慢,为了让胶凝的更好。 5.30分钟左右,分离胶凝了,将水倒掉,滤纸吸干,找好梳子。制浓缩 胶。