western步骤
Western实验步骤
转染（24-well）步骤1、贴壁细胞，0.5×105/500μl无抗生素培养基2、0.8μgDNA加入50μlOpti-MEM(或其它无血清培养基)3、2μl Lipofctoomine TM2000加入50μlOpti-MEM(或其它无血清培养基)，室温5min4、混合后室温20min共100μl5、每孔加100μl，混匀6、37℃培养18-48h，4-6h是更换培养基型号总体积DNA Lipo200096-well 100μl 0.2μg 0.5μl24-well 500μl 0.8μg 2μl6-well 2ml 4.0μg 10μl60-mm 5ml 8.0μg 20μl10-cm 15ml 24μg 60μlWestern Blot步骤一、蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取（Monolayer adherent cells）:1、倒掉营养液，用冰预冷的PBS洗三次，弃净PBS后把培养皿置于冰上（期间标记EP管，用冰）2、1ml三去污裂解也加7μl PMSF（苯甲基磺酸氟）、1μl aprotinin(抑肽酶)、1μl leupetin（亮氨酸）、1μl pepstain(胃酶抑素)摇匀置于冰上。
也可以用冰冷PBS转移至EP管离心后再裂解，可操作性更强。
用量：6孔板每孔25μl，60mm2平皿70μl。
用过的scraper先用75%乙醇洗，再用超纯水洗3、在冰上用塑料细胞刮刮下贴壁细胞，用加样器吸至EP管中，4℃冰箱中震荡15分钟4、于4℃下12000rpm离心30min（提前开离心机预冷）5、将离心后的上清转移至0.5ml的离心管中放于-20℃保存（2）组织中总蛋白的提取1、将少量组织块置于1~2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎2、加400μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。
然后置于冰上。
裂解完一管先用75%乙醇洗，再用超纯水洗，最后用吸水纸吸干。
WB实验步骤
Western Blotting操作步骤一、蛋白样品制备（1）细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，PBS洗涤一次，用细胞刮刀或胰酶消化细胞后转移至1.5ml EP管中（悬浮细胞直接转移至EP管），1000r离心5min收集细胞，PBS洗涤两次。
2、加入200ul（25cm2培养瓶）含蛋白酶抑制剂的细胞蛋白裂解液（M-PER），置于冰上间歇反复吹打30min，必要时可以超声破碎。
（整个操作尽量在冰上进行，保持低温。
）3、4℃下12000rpm离心15min。
（提前开离心机预冷）4、收集离心后的上清，分装于-80℃保存。
（2）组织总蛋白的提取：1、称取适量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、200ul含蛋白酶抑制剂的组织蛋白裂解液（T-PER），冰上间歇匀浆30min，使组织尽量碾碎至无明显组织碎块。
3、将混合液移至1.5ml离心管中，4℃下12000rpm离心15min，取上清分装，-80℃保存。
二、蛋白含量的测定1、取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mg BSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，-200C可长期保存。
2、取25mg/ml蛋白标准，用0.9%NaCl或PBS稀释至终浓度0.5mg/ml，-200C可长期保存。
3、按50:1的比例混匀BCA试剂A和B制成BCA工作液，工作液24h内稳定。
4、将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加到96孔板中，加标准品稀释液补至20ul。
5、加适当体积待测样品到96孔板中，加标准品稀释液至20ul。
6、各孔加入200ul BCA工作液，370C孵育20—30min或室温放置2h。
7、酶标仪测定A562（540-595nm也可行），根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
三、SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗洁剂或肥皂用试管刷轻轻擦洗（注意切勿让试管刷的金属把手刮花玻璃板，尽量不要使用洗衣粉，因其含固体颗粒容易损伤玻璃板）。
western蛋白提取步骤
western蛋白提取步骤•相关推荐western蛋白提取步骤蛋白提取方法一、对于培养细胞样品：1. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。
取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。
按照6孔板每孔加入100-200微升（6cm培养皿200-300ul）裂解液的比例加入裂解液。
用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。
通常裂解液接触细胞1-2 秒后，细胞就会被裂解。
对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。
按照6孔板每孔细胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。
再用手指轻弹以充分裂解细胞。
充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。
大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
3. 在冰上充分裂解20-30min后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入100微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150微升或200微升。
二、对于组织样品：1. 把组织剪切成细小的碎片。
2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。
取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的`最终浓度为1mM。
3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。
(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
)4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
western 步骤
一。
提蛋白配RIPA (10ml配方)RIPA 9mlPMSF（100mM） 100ul10x cocktail 1ml组织剪碎，组织：RIPA=1：5~1:10，或裂解液500ul。
匀浆（过程中每个组织匀浆完清洗，夹出碎组织）。
冰上静置40min-1h，4℃ 12000rpm离心10min-15min。
取上清转移到新离心管内。
如不马上进行定量变性的话，-20℃保存，最好1周内进行变性。
BCA蛋白定量与蛋白变性配BCA液：A液：B液=50:1。
蛋白样品置于冰上。
每孔加5ul蛋白样本（组织样品稀释10倍，2ul组织蛋白样品+18ul RIPA）与100ul BCA液。
标准蛋白与样品蛋白全部加3个孔。
先加蛋白，再加BCA液，加BCA液速度尽量快，保证每孔反应时间相近。
37℃摇床30min，酶标仪读数。
设置波长562nm，标准蛋白浓度mg/ml（2，1.5,1,0.75,0.5,0.25,0.125，0.025,0）。
根据读数计算蛋白浓度，稀释。
一般稀释到1ug/ul或2ug/ul。
配200ul稀释蛋白+50ul 5x loading buffer（有剧毒，臭味，不要沾手上）。
混匀，99℃煮10min。
-20℃保存。
电泳胶板固定，检查胶板是否放平，加水检查是否漏水。
放入电泳槽内。
胶板内加新电泳液加满，胶板外可加回收电泳液，胶板外电泳液液面至少摸过胶板下缘。
拔梳子，垂直，轻。
上样：marker上两端，1ul - 2.5ul均可。
蛋白上样15ul - 25ul（根据实际情况决定），加蛋白过程要轻柔一些，不要把蛋白吹起溅落到相邻孔内。
加完蛋白后再补足新电泳液至溢出。
80V电压跑到marker分开（可以看到红色条带）。
此时可加大电压至100V或120V，也可80V跑完。
BK α大小110KD左右，GAPDH 36KD ，β- Actin 42KD。
蛋白跑到目的条带大小的marker位置与内参大小的marker位置完全分开就可以停止电泳了（至少要能分开35KD和40KD的条带）。
western 操作步骤
Western 操作步骤（三）SDS——PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后放在烤箱里烤干。
（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左右和下部封边）2、配10%下层胶（10ml两块胶，每块胶5毫升左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶后胶上加一层甲醇（约1ml）液封，液封后胶凝的更快。
3、当甲醇和胶之间有一条折线时，说明胶已凝了。
弃甲醇，并用吸水纸将甲醇吸干。
4、等待胶凝期间，准备好蛋白、细胞裂解液、上样缓冲液，上样总体积一般不超过30ul,上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白质变性，上样前在冰上放置3~5分钟。
5、配5%的上层胶（4ml两块胶，每块胶2ml），加入TEMED后立刻摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。
等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。
6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两竖直向上轻轻拔出。
电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的伤员（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。
7、上样（注意：最外的两个泳道易跑歪，尽量不用）Marker 3ul （Marker加在最外边上的加样孔中）样本20~30ul（3）电泳：恒流25mA每块胶，两块胶50mA。
电泳至溴酚兰刚跑出来即可终止电泳，进行转膜（四）转膜（1）转一张膜需准备四张滤纸和一张硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套（以防手上的蛋白污染膜）。
将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1×转膜缓冲液浸湿。
（2）夹子黑的一面：海绵—2张滤纸—NC膜—胶—两张滤纸—海绵（刘老师的顺序），将夹子打开使黑的一面保持水平。
western步骤
Western blotting 步骤一、配胶二、电泳三、转膜1、用甲醇润湿硝酸纤维素膜2、用1×transfer buffer浸泡滤纸，海绵，之后将夹板（黑色）朝下，将海绵放底部，两张滤纸，胶放在滤纸上，胶的上样孔朝下，刮走气泡，加上硝酸纤维素膜，加两层滤纸，加海绵，夹住。
3、放到转膜槽内，黑板对黑板，放入仪器带的那个小冰槽。
4、100V电压，100min，在外围加上冰，这个过程中电压会逐渐降低到80V。
四、剪膜，加一抗1、将1g 脱脂奶粉加到15ml的离心管中，加20ml 1×TBST (0.1%Tween) ，震荡混匀即为5%的milk。
2、时间到后将纤维膜取出，用丽春红染色一两分钟，水中洗一下，扫描图片后剪膜，剪去边缘多余的膜。
3、把膜放在一个小盖子中（枪头盒盖子就行），倒入配好的5%的牛奶，封闭30-40min。
4、把膜放在纸上吸一下水，放入自封袋中。
5、配一抗，GST抗体比例一般为（1:1000）即1微升抗体加到1ml TBST 中，混匀加到自封袋中，封袋子。
6、摇床上孵育两小时后可以放在4度冰箱里过夜，也可以继续下面的实验。
五、加二抗1、剪开袋子，取出膜，放入盖子中，加1×TBST，摇床上晃10min。
重复两次即洗三次。
2、加二抗，GST抗体的二抗为鼠单抗，取鼠抗2微升，加到10ml 1×TBST 中，混匀，倒入盖子中，摇床上晃1h。
3、加1×TBST洗三次，10min每次。
六、显色1、配显色液（现用现配）AP buffer 2ml /1mlBCIP 6.66微升/3.33微升NBT 13.33微升/6.66微升2、膜在水中洗一下，纸吸一下水，放到显色液中，显色大约几分钟或者时间更长。
3、扫描图片七、buffer配方1、10×running buffer2、10×transfer buffer30.3g Tris碱+144g 甘氨酸，定容到1L ddH2O中。
western实验步骤
1．蛋白样品的制备在50mg组织中加入0.5ml蛋白裂解液(50mM Tris.Cl pH 6.8、15mM NaCl、5mM EDTA、0.5% NP-40、1mM PMSF)，超声匀浆，10000g ,4℃离心10min,取上清，加入等体积的2×SDS buffer（tris-Cl 100mM, DTT 200 mM, 甘油20%，溴酚蓝0.2%, SDS 4%），95℃煮沸5min, 迅速冰浴，10000g ,4℃离心10分钟，收集上清，用于后面实验。
2． SDS-PAGE（1）分离胶12%Tris-HCl PH 8.8 2.5ml双蒸水 3.3ml10%SDS 0.1ml30%丙烯酰胺 4.0ml10%过硫酸铵 0.1mlTEMED 0.04ml（2）浓缩胶5%Tris-HCl PH 6.8 0.63ml双蒸水 3.44ml10%SDS 0.05ml30%丙烯酰胺 0.83ml10%过硫酸铵 0.05mlTEMED 0.0005ml（3）电泳：浓缩胶恒压80V, 时间约45分；分离胶恒压120V，时间约3小时。
3．转膜（1）PVDF膜（millipore,K9KN1973U）的活化：甲醇浸泡2分，蒸馏水1分，转入转移缓冲液中。
（2）转移仪进行转膜：恒流200mA, 2小时。
4．封闭：5%BSA溶液, 4℃封闭过夜。
5.一抗孵育：（1）抗体稀释度：鼠源beta-actin, 1:1000稀释,鼠源chop, 1:1000稀释,兔源p38，1:1000稀释，稀释液：TBST。
（2）时间：4℃过夜。
6.二抗孵育：（1）抗体稀释度：抗鼠二抗或抗兔二抗, 1：10000稀释。
（2）时间：室温2h。
7. ECL(pierce,KL140454)底物化学发光显色，显影，定影，扫描。
简述western印迹的基本过程
简述western印迹的基本过程Western印迹是一种常用的分子生物学技术，它可以检测蛋白质的存在、分子量和相对丰度。
Western印迹技术主要包括以下几个步骤：样品制备、电泳分离、转膜、阻断、一抗和二抗探针探测等。
一、样品制备Western印迹技术需要使用样品来进行分析，通常我们需要从细胞或组织中提取蛋白质。
提取方法可以根据不同的实验目的进行选择，例如RIPA缓冲液法、SDS-PAGE法等。
提取后的蛋白质需要经过浓缩和纯化处理，以便于后续的电泳分离。
二、电泳分离将制备好的样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。
根据蛋白质大小不同选择不同浓度的凝胶，通常使用10%或12%聚丙烯酰胺凝胶。
在电泳过程中，蛋白质会被拉伸成条状并向阳极移动。
三、转膜将电泳分离后的蛋白质转移到聚乙烯膜上。
转膜的目的是将凝胶上分离出来的蛋白质迁移到一个新的固体载体上，以便于后续的探测。
通常使用半湿式或干式转膜法。
四、阻断在转膜后，需要对聚乙烯膜进行阻断处理，以避免非特异性结合和减少假阳性结果。
通常使用5%的非脂类奶粉或3%的BSA进行阻断处理。
五、一抗在阻断处理后，加入第一抗体进行特异性结合。
第一抗体可以是单克隆或多克隆抗体，具有高度特异性和亲和力。
将第一抗体加入后，在室温下或4℃下孵育数小时甚至过夜。
六、二抗探针探测加入与第一抗体来源不同物种的二抗（例如羊或马）与荧光素等探针进行反应，通过荧光素发射信号检测目标蛋白质的存在、分子量和相对丰度。
Western印迹技术中最常用的二抗是HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗。
七、成像和分析Western印迹技术的结果可以通过化学发光、荧光或放射性等多种方法进行检测。
Western印迹技术的结果通常以数字图像的形式保存下来，可以使用专业软件进行分析和定量。
综上所述，Western印迹技术是一种常用的分子生物学技术，通过样品制备、电泳分离、转膜、阻断、一抗和二抗探针探测等步骤，可以检测蛋白质的存在、分子量和相对丰度。
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1、组织蛋白的提取
取上述用于Mn含量测定中另外4只大鼠剩余的纹状体组织置于2ml EP管中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，加400μl单去污剂裂解液（含PMSF）于超声器中进行裂解，然后置于冰上。
几分钟后再超声数秒再置于冰上，要重复几次使组织尽量碾碎。
裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，去上清分装于新的离心管中并置于-20℃保存。
2、蛋白含量的测定
（1）制作标准曲线
从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。
取96孔板，按下表加入各种试剂。
混匀后，室温放置2min。
在酶标仪上比色分析，测量OD值。
表2，标准曲线的制备
0μg 2.5μg 5.0μg10.0μg20.0μg40.0μg 1mg/mlBSA - 2.5μl 5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl
0.15mol/L NaCl 100μl97.5μl95.0μl90.0μl80.0μl60.0μl G250考马斯亮蓝溶液1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
（2）检测样品蛋白含量
①取96孔板，实验用各孔加入4℃存储的考马斯亮蓝溶液1ml。
室温放置30min，后即可用于测蛋白。
②其中一孔加0.15molNaCl溶液100μl做空白对照，其余个孔加95μl
0.15molNaCl溶液和5μl 0.15molNaCl待测蛋白样品，混匀后静置2min，在酶标仪上比色分析，在595nm处测量OD值。
③绘制标准曲线，测得的结果是5μl样品含的蛋白量。
3、SDS-PAGE电泳
（1）干净玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直置于架上准备灌胶。
（2）制备分离胶并灌胶：配置8ml 10%分离胶，3.2ml ddH2O，2.0ml 1.5mol/L Tris·HCl分离胶缓冲液（pH8.8），2.72ml 30%丙烯酰胺溶液，80μl 10%SDS，80μl 10%APS（过硫酸铵），16μl TEMED。
将分离胶加入玻璃板的4/5（梳子下至少1cm）然后胶上加一层水液封。
当水和胶之间有一条折射线时说明胶已凝了，再等3min，使胶充分凝固，就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
（3）制备浓缩胶并灌胶：配置4ml 5%浓缩胶，2.28ml ddH2O，1.0ml 0.5mol/L Tris·HCl浓缩胶缓冲液（pH6.8），0.68ml 30%丙烯酰胺溶液，40μl 10%SDS，20μl 10%APS，8μl TEMED。
将玻璃板剩余空间用5%的浓缩胶灌满后将梳子插入浓缩胶中，待凝固。
（4）浓缩胶聚合的同时，将40μg蛋白样品与加样缓冲液混匀，100℃加热3-5min蛋白变性。
（5）浓缩胶聚合完成后，加入电泳缓冲液，依序上样及蛋白质分子量标准品。
（6）电泳：浓缩胶80V，进入分离胶之后调为120V，持续电泳直至染料到达分离胶底部，断开电源，结束电泳后，剥胶。
4、湿法免疫印迹杂交
（1）转膜前，将PVDF膜用适量甲醇浸泡约1min至半透明，用ddH2O反复冲洗，然后将PVDF膜和滤纸用电转移缓冲液浸泡30min。
（2）凝胶-PVDF膜“三明治”操作：将凝胶下垫上滤纸和海绵，然后将PVDF 膜平铺于凝胶上，盖上同样滤纸和海绵，出去各层间气泡。
然后放入电转移槽中，凝胶面向阴极（黑色），PVDF膜面向阳极（红色），电流170mA转移2h。
（3）洗膜：在摇床上，PVDF膜在TBST中洗5min，2次，在TBS中5min，洗1次。
（4）封闭：将PVDF膜放入封闭液（5%脱脂奶粉，TBST配制）中进行封闭。
（5）如上法洗膜，加入一抗（GS 1:300, GLAST 1:500, GLT-1 1:300, β-actin 1:500），4℃孵育过夜。
（6）如上法洗膜，加入二抗（1:5000 稀释），37℃孵育2h。
（7）如上法洗膜，将上述PVDF膜置于ECL显影液，采集图像，并分析目的条带，分析各产物的OD（ODx）值，实验结果以各组光密度值和对照组光密度值相比（OD x/ODβ-actin）。
1、细胞蛋白的提取
每个剂量设3个平行样，倒掉培养液，用PBS冲洗细胞3次，弃去洗液，每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液（1ml裂解液含10μl PMSF），于冰上裂解30min，收集裂解的细胞至于1.5ml离心管中，4℃，12000rpm，离心5min，收集上清并保存。
羊抗GS单克隆抗体美国SantaCruz公司
羊抗GLAST单克隆抗体美国SantaCruz公司
羊抗GLT-1单克隆抗体美国SantaCruz公司
鼠抗β-Actin多克隆抗体美国SantaCruz公司
抗羊IgG-HRP 美国SantaCruz公司
抗鼠IgG-HRP 美国SantaCruz公司。