western 操作步骤
WesternBlot操作流程
WesternBlot操作流程Western Blot操作流程本⼈将⾃⼰做WB实验时的具体操作流程，做了详细的记录并整理。
因为每个实验室的条件不⼀样，所以本流程仅供参考，具体适合⾃⼰的实验操作需要⼤家摸索。
由于知识量有限，有些描述⽤词并不专业，请⼤家谅解。
⼀、流程图制胶→→电泳跑胶(1.5-2.5h)→→转膜（3h）→→（可使⽤⽴春红检测是否蛋⽩是否成功转移）TBST清洗（10min）→→封闭（2h）→→TBST清洗（10min）→→附Ⅰ抗（内参：⼩⿏抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜）→→TBST 清洗三次（10min/次）→→附Ⅱ抗（内参：⼭⽺抗⼩⿏，轻摇1.5h）→→TBST清洗三次（10min/次）→→显影⼆、物料及配制1、电泳液：⼀包电泳粉+1000ml双蒸⽔（可回收使⽤）2、10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+10ml双蒸⽔3、转膜液：⼀包转膜粉+800ml双蒸⽔+200ml甲醇（可回收使⽤）4、TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml双蒸⽔+1ml吐温20。
（⽆需回收）5、封闭液：购买6、Ⅰ抗（内参）：将⼩⿏抗β-Actin：Ⅰ稀释液按1:500稀释待⽤，4度保存。
Ⅰ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将smad2：Ⅰ稀释液按1:1000稀释待⽤，4度保存。
7、Ⅱ抗（内参）：将⼭⽺抗⼩⿏：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释代⽤，4度保存。
Ⅱ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将⼭⽺抗兔：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释待⽤，4度保存。
7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使⽤8、定影液：按说明书配制，可长期回收使⽤9、发光液：超敏发光液A液：B液=1:1三、步骤（⼀）制胶1、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液的配制2、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所⽤溶液3、1）将规格1.0mm或其它规格的玻璃板固定好。
2）依次将所需试剂加⼊烧杯中，加⼊TEMED之后，混匀，⽤1000ml的移液枪沿玻璃板缝左右两边的⾓交替加⼊分离胶溶液，也可从左到右连续加⼊（⽬的：两种⽅法都可以使液⾯快速达到⽔平状态）。
western操作详细程序
Western blot详细步骤一、电泳1、Marker点0.8微升，72KD显红色，其它显蓝色2、100V,恒压——140V恒压，1.5h, 15%的胶，将溴酚蓝跑到外面，让带分开点。
3、转膜： PVDF膜从下到上依次是：黑板、海绵垫，两层滤纸，胶，PVDF 膜，两层滤纸，海绵垫，白板4、根据Marker把多出来的胶切掉节省。
留下14—72之间，将海绵垫与板用水洗，泡于Western转膜buffer中，剪取和脚大小合适的滤纸和膜，膜剪好后放在无水甲醇中浸泡2分钟，将滤纸润湿，两层滤纸放于海绵垫上，赶尽气泡，再铺两层滤纸，压紧夹子。
放于电转膜槽中，加冰盒，将wenstern转膜buffer倒入槽中，加满，放入4度冰箱中，100V1h, western转膜buffer可重复使用5次。
5、将膜放入封闭液中（5%脱脂奶粉，用PBS缓冲液配置）45min摇。
6、用PBST液洗膜2次，每次2min，摇（将500微升吐温20加到1000微升PBS 溶液中）将脱脂奶粉中的蛋白洗掉。
7、加一抗 Anti-His（我做的是抗His，要根据自己的蛋白选择）根据抗体说明书配置抗体稀释液，用PBS稀释，用塑料膜封膜加抗体缓冲液，封袋1.5小时反应，摇。
PBS一般PH为7.2，一抗可多次使用，直到有异味产生，可持续一个月，使用3、4次，因为比较贵，为得到较好效果，可向旧抗体缓冲液不加新液，为长久保存，可加叠氮钠，但使抗体不易结合。
脱脂奶粉可多次使用，一般为两天。
8、洗膜，4次，每次两分钟，PBST.9、加二抗，（羊抗鼠）封于小袋中摇45分钟，（二抗用辣跟过氧化物酶标记）10、PBST洗脱4次，摇11、在桌子上铺保鲜膜，将PVDF膜防御保鲜膜上，向膜上加A,B混合底物，反应1-2min，吸干底物，用保鲜膜将PVDF膜包好，放入曝光版中。
12、进入暗室操作，将胶压在膜上曝光2min（如果不行，加长曝光时间2-30min）将胶片放入显影液中2min-3min,用水漂洗一下，放入定影液2-3min（手套操作）定影液都是商品粉剂，后调配而成。
WB实验步骤详解
Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
western操作全过程
Western Blot一．配胶注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡），加入10%AP（分离胶浓度越高AP浓度越低，）及TEMED 即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到一定浓度。
封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，将玻璃板倒立放置片刻控净。
灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。
拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。
若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。
30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
(10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。
30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉.)二．组织样品处理匀浆肝组织可每50mg加0.5ml裂解液，可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
12000g离心，4℃，2min。
取少量上清考马斯亮蓝进行定量。
将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
(裂解液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。
提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM)。
三．电泳1．上样前将胶板下的气泡赶走。
western的操作步骤
western的操作步骤Western Blot操作全过程一，收蛋白a（如果要收集死细胞）1.取冰，将4°C离心机提前降温。
2.将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。
3.弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。
4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。
（1×Cell Lysis Buffer：PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。
PMSF 常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。
）5.冰上裂解15min，将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。
6.小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。
如：100μL。
7.将收集好的蛋白保存与—20°C。
（可长期保存）b （如果不收集死细胞）1．弃上清，孔板PBS洗1-2遍，吸尽PBS。
在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。
（同上）2．冰上裂解15min，用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。
（不同的孔不能用同一个刮子，刮前用水冲洗，擦干。
）3．将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。
4．小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。
5．将收集好的蛋白保存与—20°C。
（可长期保存）二，测蛋白浓度BCA法（或者按照自己的试剂盒说明操作）1.需96孔板，测蛋白浓度的A液，B液，标准蛋白，要测的样品蛋白。
2.按要测的样品蛋白的数量来配AB液，每孔需AB混合液80μl （A：B=50：1）。
例：有5个样品，加上5个标准蛋白和空白对照。
共有11个孔。
则A液取11×80=880μl，B液取880÷50=17.6两液混匀，加入96孔板，每孔80μl。
然后加入标准蛋白及样品蛋白4μl。
western步骤
Western blotting 步骤一、配胶二、电泳三、转膜1、用甲醇润湿硝酸纤维素膜2、用1×transfer buffer浸泡滤纸，海绵，之后将夹板（黑色）朝下，将海绵放底部，两张滤纸，胶放在滤纸上，胶的上样孔朝下，刮走气泡，加上硝酸纤维素膜，加两层滤纸，加海绵，夹住。
3、放到转膜槽内，黑板对黑板，放入仪器带的那个小冰槽。
4、100V电压，100min，在外围加上冰，这个过程中电压会逐渐降低到80V。
四、剪膜，加一抗1、将1g 脱脂奶粉加到15ml的离心管中，加20ml 1×TBST (0.1%Tween) ，震荡混匀即为5%的milk。
2、时间到后将纤维膜取出，用丽春红染色一两分钟，水中洗一下，扫描图片后剪膜，剪去边缘多余的膜。
3、把膜放在一个小盖子中（枪头盒盖子就行），倒入配好的5%的牛奶，封闭30-40min。
4、把膜放在纸上吸一下水，放入自封袋中。
5、配一抗，GST抗体比例一般为（1:1000）即1微升抗体加到1ml TBST 中，混匀加到自封袋中，封袋子。
6、摇床上孵育两小时后可以放在4度冰箱里过夜，也可以继续下面的实验。
五、加二抗1、剪开袋子，取出膜，放入盖子中，加1×TBST，摇床上晃10min。
重复两次即洗三次。
2、加二抗，GST抗体的二抗为鼠单抗，取鼠抗2微升，加到10ml 1×TBST 中，混匀，倒入盖子中，摇床上晃1h。
3、加1×TBST洗三次，10min每次。
六、显色1、配显色液（现用现配）AP buffer 2ml /1mlBCIP 6.66微升/3.33微升NBT 13.33微升/6.66微升2、膜在水中洗一下，纸吸一下水，放到显色液中，显色大约几分钟或者时间更长。
3、扫描图片七、buffer配方1、10×running buffer2、10×transfer buffer30.3g Tris碱+144g 甘氨酸，定容到1L ddH2O中。
western步骤
1、SDS-PAGE电泳将电泳仪的玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上,加满蒸馏水试漏后，准备灌胶。
按说明书配制分离胶及浓缩胶，加入四甲基乙二胺（TEMED）后立即摇匀即可灌胶。
待胶面升到适宜高度后在胶上加水封胶，隔离空气使凝胶速度加快。
分离胶凝固后，吸去胶上层的水，将剩余空间灌满浓缩胶后插入梳子。
待浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子两侧竖直向上轻轻将其拔出。
用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中，加入足量电泳液。
按5：1比例向样品加入溴酚蓝，并于沸水中煮5 min，计算100 µg蛋白的溶液体积即为上样量。
用微量进样器贴壁吸取样品，缓缓加入加样孔中。
恒压100 V，电泳至溴酚蓝刚跑到分离胶最下端即可。
2、转膜2.1 湿转在加有转膜液的瓷盘里放入转膜用的夹子、海绵、玻棒、滤纸和硝酸纤维素膜。
将夹子打开使黑面向下，在上面垫一张海绵，用玻棒赶走气泡。
在海绵垫上滤纸。
撬开玻璃板，将浓缩胶轻轻刮去。
根据marker显示，在所需分子量上下0.5 cm裁胶。
小心剥下胶条置于滤纸上并调整使其与滤纸对齐。
将NC膜盖于胶上，并在膜上盖张滤纸。
最后盖上另一张海绵垫，将夹子夹起。
整个操作在电转液中进行，并不断除去气泡。
将夹子放入电转槽中，并在夹子中加满电转液。
在电转槽中加入冰水，避免转移时大量产热。
恒流1A，电转80 min（电流及转膜时间根据分子量进行调整）。
2.2 半干转将滤纸及NC膜放入盛有半干转液的表面皿中，使NC膜充分浸透。
半干转仪上放滤纸，铺上NC膜，将胶置于膜上并赶气泡，最后盖上滤纸，将夹子夹起，装好仪器，调电流及转膜时间，转膜。
转膜电流=[NC膜（2×8cm）个数×0.04]A;转膜时间=（分子量+3）min（转膜时间根据转膜情况可上下调整）。
3 免疫反应将膜用washing buffer洗涤5 min后，移至含有封闭液的表面皿中，在脱色摇床上摇动封闭3 h。
从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于一抗液面上。
western实验原理及步骤
western实验原理及步骤
western实验原理及步骤
western实验是一种分子生物学技术，它可以用来检测特定蛋白质的表达水平。
它的原理是将细胞内的蛋白质从细胞内取出，然后通过电泳来分离，最后将蛋白质用特定的抗体标记，然后用荧光染料检测，最后用荧光显微镜检测，从而检测特定蛋白质的表达水平。
Western实验的步骤包括：
1. 准备实验样本：首先准备实验样本，一般是细胞系或者组织样本，将其分离和提取蛋白质。
2. 电泳：将提取的蛋白质放入凝胶中，然后加入电流，使蛋白质受到电流的作用，从而分离不同的蛋白质。
3. 标记：将分离的蛋白质用特定的抗体标记，以便检测。
4. 检测：将标记的蛋白质用荧光染料检测，然后用荧光显微镜检测，从而检测特定蛋白质的表达水平。
western实验的原理是将细胞内的蛋白质从细胞内取出，然后通过电泳来分离，最后将蛋白质用特定的抗体标记，然后用荧光染料检测，最后用荧光显微镜检测，从而检测特定蛋白质的表达水平。
步骤包括准备实验样本、电泳、标记和检测。
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Western 操作步骤
（三）SDS——PAGE电泳
（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后放在烤箱里烤干。
（2）灌胶与上样
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左右和下部封边）
2、配10%下层胶（10ml两块胶，每块胶5毫升左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶后胶上加一层甲醇（约1ml）液封，液封后胶凝的更快。
3、当甲醇和胶之间有一条折线时，说明胶已凝了。
弃甲醇，并用吸水纸将甲醇吸干。
4、等待胶凝期间，准备好蛋白、细胞裂解液、上样缓冲液，上样总体积一般不超过30ul,上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白质变性，上样前在冰上放置3~5分钟。
5、配5%的上层胶（4ml两块胶，每块胶2ml），加入TEMED后立刻摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。
等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。
6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两竖直向上轻轻拔出。
电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的伤员（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。
7、上样（注意：最外的两个泳道易跑歪，尽量不用）Marker 3ul （Marker加在最外边上的加样孔中）样本20~30ul
（3）电泳：恒流25mA每块胶，两块胶50mA。
电泳至溴酚兰刚跑出来即可终止电泳，进行转膜
（四）转膜
（1）转一张膜需准备四张滤纸和一张硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套（以防手上的蛋白污染膜）。
将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1×转膜缓冲液浸湿。
（2）夹子黑的一面：海绵—2张滤纸—NC膜—胶—两张滤纸—海绵（刘老师的顺序），将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒来回赶几遍以赶走里面的气泡。
在垫子上垫两层滤纸（光滑面临膜），放膜于滤纸上，将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下下层胶盖于膜上，用手调整对齐，再放两张滤纸（光滑面临膜）用玻璃棒赶去其中的气泡。
最后盖下另一块海绵垫，擀几下就可以合起来了。
整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触，否则会发生短路。
如果同时做两块胶，转膜时要记住样本的位置。
（3）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的红面，夹的白面对槽的黑面。
电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。
一般用35V过夜（刘老师）。
转膜时点击方向注意是膜正胶负转膜结束前配制封闭液（3%脱脂牛奶）及1×TBST缓冲液。
（五）免疫反应
（1）封闭：将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭30分钟。
（2）一抗
A.从封闭液中取出膜，1×TBST 5min ×4次
B.将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体，室温下孵育1小时后，4度过夜，次日用1×TBST
在室温下脱色摇床上洗4次，每次5分钟。
（3）二抗
二抗稀释液与膜接触，室温下孵育1小时，用1×TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5分钟。
（六）化学发光，显影，定影
（1）将A和B两种试剂等量（常用各500ul）在5ml离心管仲等体积很合打开X—光片夹，铺上保鲜膜，将NC膜面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1~3分钟后（见到荧光），用保鲜膜包好。
（2）将1×显影液，自来水和定影液分别倒入盘中：
在红灯下：
A 取出X—光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长宽均大1cm);把X --光片放在膜上，一旦放上，边不能移动，关上X—光片夹，开始计时，根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1到5min,也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果。
B 曝光完成后，打开X—光片夹，取出X—光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。
显影时间一般为1~2分钟（20度~25度），温度过低时（低于16度）需延长显影时间。
C 显影结束后，先用自来水洗一下X—光片，然后再放到定影液中进行定影（这样可以延长定影液使用时间，从而节约定影液）。
定影时间一般为5~10分钟，一胶片透明为止; (七）凝胶图像分析；将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。