western的操作步骤Word版
WesternBlot操作流程
WesternBlot操作流程Western Blot操作流程本⼈将⾃⼰做WB实验时的具体操作流程，做了详细的记录并整理。
因为每个实验室的条件不⼀样，所以本流程仅供参考，具体适合⾃⼰的实验操作需要⼤家摸索。
由于知识量有限，有些描述⽤词并不专业，请⼤家谅解。
⼀、流程图制胶→→电泳跑胶(1.5-2.5h)→→转膜（3h）→→（可使⽤⽴春红检测是否蛋⽩是否成功转移）TBST清洗（10min）→→封闭（2h）→→TBST清洗（10min）→→附Ⅰ抗（内参：⼩⿏抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜）→→TBST 清洗三次（10min/次）→→附Ⅱ抗（内参：⼭⽺抗⼩⿏，轻摇1.5h）→→TBST清洗三次（10min/次）→→显影⼆、物料及配制1、电泳液：⼀包电泳粉+1000ml双蒸⽔（可回收使⽤）2、10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+10ml双蒸⽔3、转膜液：⼀包转膜粉+800ml双蒸⽔+200ml甲醇（可回收使⽤）4、TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml双蒸⽔+1ml吐温20。
（⽆需回收）5、封闭液：购买6、Ⅰ抗（内参）：将⼩⿏抗β-Actin：Ⅰ稀释液按1:500稀释待⽤，4度保存。
Ⅰ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将smad2：Ⅰ稀释液按1:1000稀释待⽤，4度保存。
7、Ⅱ抗（内参）：将⼭⽺抗⼩⿏：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释代⽤，4度保存。
Ⅱ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将⼭⽺抗兔：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释待⽤，4度保存。
7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使⽤8、定影液：按说明书配制，可长期回收使⽤9、发光液：超敏发光液A液：B液=1:1三、步骤（⼀）制胶1、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液的配制2、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所⽤溶液3、1）将规格1.0mm或其它规格的玻璃板固定好。
2）依次将所需试剂加⼊烧杯中，加⼊TEMED之后，混匀，⽤1000ml的移液枪沿玻璃板缝左右两边的⾓交替加⼊分离胶溶液，也可从左到右连续加⼊（⽬的：两种⽅法都可以使液⾯快速达到⽔平状态）。
western操作详细程序
Western blot详细步骤一、电泳1、Marker点0.8微升，72KD显红色，其它显蓝色2、100V,恒压——140V恒压，1.5h, 15%的胶，将溴酚蓝跑到外面，让带分开点。
3、转膜： PVDF膜从下到上依次是：黑板、海绵垫，两层滤纸，胶，PVDF 膜，两层滤纸，海绵垫，白板4、根据Marker把多出来的胶切掉节省。
留下14—72之间，将海绵垫与板用水洗，泡于Western转膜buffer中，剪取和脚大小合适的滤纸和膜，膜剪好后放在无水甲醇中浸泡2分钟，将滤纸润湿，两层滤纸放于海绵垫上，赶尽气泡，再铺两层滤纸，压紧夹子。
放于电转膜槽中，加冰盒，将wenstern转膜buffer倒入槽中，加满，放入4度冰箱中，100V1h, western转膜buffer可重复使用5次。
5、将膜放入封闭液中（5%脱脂奶粉，用PBS缓冲液配置）45min摇。
6、用PBST液洗膜2次，每次2min，摇（将500微升吐温20加到1000微升PBS 溶液中）将脱脂奶粉中的蛋白洗掉。
7、加一抗 Anti-His（我做的是抗His，要根据自己的蛋白选择）根据抗体说明书配置抗体稀释液，用PBS稀释，用塑料膜封膜加抗体缓冲液，封袋1.5小时反应，摇。
PBS一般PH为7.2，一抗可多次使用，直到有异味产生，可持续一个月，使用3、4次，因为比较贵，为得到较好效果，可向旧抗体缓冲液不加新液，为长久保存，可加叠氮钠，但使抗体不易结合。
脱脂奶粉可多次使用，一般为两天。
8、洗膜，4次，每次两分钟，PBST.9、加二抗，（羊抗鼠）封于小袋中摇45分钟，（二抗用辣跟过氧化物酶标记）10、PBST洗脱4次，摇11、在桌子上铺保鲜膜，将PVDF膜防御保鲜膜上，向膜上加A,B混合底物，反应1-2min，吸干底物，用保鲜膜将PVDF膜包好，放入曝光版中。
12、进入暗室操作，将胶压在膜上曝光2min（如果不行，加长曝光时间2-30min）将胶片放入显影液中2min-3min,用水漂洗一下，放入定影液2-3min（手套操作）定影液都是商品粉剂，后调配而成。
western 步骤
一。
提蛋白配RIPA (10ml配方)RIPA 9mlPMSF（100mM） 100ul10x cocktail 1ml组织剪碎，组织：RIPA=1：5~1:10，或裂解液500ul。
匀浆（过程中每个组织匀浆完清洗，夹出碎组织）。
冰上静置40min-1h，4℃ 12000rpm离心10min-15min。
取上清转移到新离心管内。
如不马上进行定量变性的话，-20℃保存，最好1周内进行变性。
BCA蛋白定量与蛋白变性配BCA液：A液：B液=50:1。
蛋白样品置于冰上。
每孔加5ul蛋白样本（组织样品稀释10倍，2ul组织蛋白样品+18ul RIPA）与100ul BCA液。
标准蛋白与样品蛋白全部加3个孔。
先加蛋白，再加BCA液，加BCA液速度尽量快，保证每孔反应时间相近。
37℃摇床30min，酶标仪读数。
设置波长562nm，标准蛋白浓度mg/ml（2，1.5,1,0.75,0.5,0.25,0.125，0.025,0）。
根据读数计算蛋白浓度，稀释。
一般稀释到1ug/ul或2ug/ul。
配200ul稀释蛋白+50ul 5x loading buffer（有剧毒，臭味，不要沾手上）。
混匀，99℃煮10min。
-20℃保存。
电泳胶板固定，检查胶板是否放平，加水检查是否漏水。
放入电泳槽内。
胶板内加新电泳液加满，胶板外可加回收电泳液，胶板外电泳液液面至少摸过胶板下缘。
拔梳子，垂直，轻。
上样：marker上两端，1ul - 2.5ul均可。
蛋白上样15ul - 25ul（根据实际情况决定），加蛋白过程要轻柔一些，不要把蛋白吹起溅落到相邻孔内。
加完蛋白后再补足新电泳液至溢出。
80V电压跑到marker分开（可以看到红色条带）。
此时可加大电压至100V或120V，也可80V跑完。
BK α大小110KD左右，GAPDH 36KD ，β- Actin 42KD。
蛋白跑到目的条带大小的marker位置与内参大小的marker位置完全分开就可以停止电泳了（至少要能分开35KD和40KD的条带）。
western的操作步骤
western的操作步骤Western Blot操作全过程一，收蛋白a（如果要收集死细胞）1.取冰，将4°C离心机提前降温。
2.将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。
3.弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。
4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。
（1×Cell Lysis Buffer：PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。
PMSF 常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。
）5.冰上裂解15min，将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。
6.小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。
如：100μL。
7.将收集好的蛋白保存与—20°C。
（可长期保存）b （如果不收集死细胞）1．弃上清，孔板PBS洗1-2遍，吸尽PBS。
在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。
（同上）2．冰上裂解15min，用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。
（不同的孔不能用同一个刮子，刮前用水冲洗，擦干。
）3．将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。
4．小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。
5．将收集好的蛋白保存与—20°C。
（可长期保存）二，测蛋白浓度BCA法（或者按照自己的试剂盒说明操作）1.需96孔板，测蛋白浓度的A液，B液，标准蛋白，要测的样品蛋白。
2.按要测的样品蛋白的数量来配AB液，每孔需AB混合液80μl （A：B=50：1）。
例：有5个样品，加上5个标准蛋白和空白对照。
共有11个孔。
则A液取11×80=880μl，B液取880÷50=17.6两液混匀，加入96孔板，每孔80μl。
然后加入标准蛋白及样品蛋白4μl。
western步骤
Western blotting 步骤一、配胶二、电泳三、转膜1、用甲醇润湿硝酸纤维素膜2、用1×transfer buffer浸泡滤纸，海绵，之后将夹板（黑色）朝下，将海绵放底部，两张滤纸，胶放在滤纸上，胶的上样孔朝下，刮走气泡，加上硝酸纤维素膜，加两层滤纸，加海绵，夹住。
3、放到转膜槽内，黑板对黑板，放入仪器带的那个小冰槽。
4、100V电压，100min，在外围加上冰，这个过程中电压会逐渐降低到80V。
四、剪膜，加一抗1、将1g 脱脂奶粉加到15ml的离心管中，加20ml 1×TBST (0.1%Tween) ，震荡混匀即为5%的milk。
2、时间到后将纤维膜取出，用丽春红染色一两分钟，水中洗一下，扫描图片后剪膜，剪去边缘多余的膜。
3、把膜放在一个小盖子中（枪头盒盖子就行），倒入配好的5%的牛奶，封闭30-40min。
4、把膜放在纸上吸一下水，放入自封袋中。
5、配一抗，GST抗体比例一般为（1:1000）即1微升抗体加到1ml TBST 中，混匀加到自封袋中，封袋子。
6、摇床上孵育两小时后可以放在4度冰箱里过夜，也可以继续下面的实验。
五、加二抗1、剪开袋子，取出膜，放入盖子中，加1×TBST，摇床上晃10min。
重复两次即洗三次。
2、加二抗，GST抗体的二抗为鼠单抗，取鼠抗2微升，加到10ml 1×TBST 中，混匀，倒入盖子中，摇床上晃1h。
3、加1×TBST洗三次，10min每次。
六、显色1、配显色液（现用现配）AP buffer 2ml /1mlBCIP 6.66微升/3.33微升NBT 13.33微升/6.66微升2、膜在水中洗一下，纸吸一下水，放到显色液中，显色大约几分钟或者时间更长。
3、扫描图片七、buffer配方1、10×running buffer2、10×transfer buffer30.3g Tris碱+144g 甘氨酸，定容到1L ddH2O中。
western步骤
1、SDS-PAGE电泳将电泳仪的玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上,加满蒸馏水试漏后，准备灌胶。
按说明书配制分离胶及浓缩胶，加入四甲基乙二胺（TEMED）后立即摇匀即可灌胶。
待胶面升到适宜高度后在胶上加水封胶，隔离空气使凝胶速度加快。
分离胶凝固后，吸去胶上层的水，将剩余空间灌满浓缩胶后插入梳子。
待浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子两侧竖直向上轻轻将其拔出。
用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中，加入足量电泳液。
按5：1比例向样品加入溴酚蓝，并于沸水中煮5 min，计算100 µg蛋白的溶液体积即为上样量。
用微量进样器贴壁吸取样品，缓缓加入加样孔中。
恒压100 V，电泳至溴酚蓝刚跑到分离胶最下端即可。
2、转膜2.1 湿转在加有转膜液的瓷盘里放入转膜用的夹子、海绵、玻棒、滤纸和硝酸纤维素膜。
将夹子打开使黑面向下，在上面垫一张海绵，用玻棒赶走气泡。
在海绵垫上滤纸。
撬开玻璃板，将浓缩胶轻轻刮去。
根据marker显示，在所需分子量上下0.5 cm裁胶。
小心剥下胶条置于滤纸上并调整使其与滤纸对齐。
将NC膜盖于胶上，并在膜上盖张滤纸。
最后盖上另一张海绵垫，将夹子夹起。
整个操作在电转液中进行，并不断除去气泡。
将夹子放入电转槽中，并在夹子中加满电转液。
在电转槽中加入冰水，避免转移时大量产热。
恒流1A，电转80 min（电流及转膜时间根据分子量进行调整）。
2.2 半干转将滤纸及NC膜放入盛有半干转液的表面皿中，使NC膜充分浸透。
半干转仪上放滤纸，铺上NC膜，将胶置于膜上并赶气泡，最后盖上滤纸，将夹子夹起，装好仪器，调电流及转膜时间，转膜。
转膜电流=[NC膜（2×8cm）个数×0.04]A;转膜时间=（分子量+3）min（转膜时间根据转膜情况可上下调整）。
3 免疫反应将膜用washing buffer洗涤5 min后，移至含有封闭液的表面皿中，在脱色摇床上摇动封闭3 h。
从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于一抗液面上。
完整word版,Westernblot一、实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的
Western blot一、实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法。
二、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
三、操作步骤（一）样品处理1培养的细胞：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷ 12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
或收取细胞于EP管中加入适量的1×SDS，吹匀，100度5min,重复一次。
1200rpm ,10min.取上清定量。
3．组织：⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml 裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵ 12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
western印迹法原理和流程
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Western Blot操作全过程
一，收蛋白
a（如果要收集死细胞）
1.取冰，将4°C离心机提前降温。
2.将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量
的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。
3.弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。
4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。
（1×Cell Lysis Buffer：
PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。
PMSF 常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。
）
5.冰上裂解15min，将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，
15min。
6.小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。
如：100μL。
7.将收集好的蛋白保存与—20°C。
（可长期保存）
b （如果不收集死细胞）
1．弃上清，孔板PBS洗1-2遍，吸尽PBS。
在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。
（同上）
2．冰上裂解15min，用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。
（不同的孔不能用同一个刮子，刮前用水冲洗，擦干。
）
3．将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。
4．小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。
5．将收集好的蛋白保存与—20°C。
（可长期保存）
二，测蛋白浓度
BCA法（或者按照自己的试剂盒说明操作）
1.需96孔板，测蛋白浓度的A液，B液，标准蛋白，要测的样品蛋
白。
2.按要测的样品蛋白的数量来配AB液，每孔需AB混合液80μl（A：
B=50：1）。
例：有5个样品，加上5个标准蛋白和空白对照。
共有11个孔。
则A液取11×80=880μl，B液取880÷50=17.6两液混匀，加入96孔板，每孔80μl。
然后加入标准蛋白及样品蛋白4μl。
（标准蛋白先配好浓度125，250，500，1000，2000）
3.将孔板放入37°C温箱孵育30min。
4.用酶标仪测蛋白浓度。
5.记下蛋白浓度，根据要上样的μg量算出μl量。
例：蛋白浓度为
1000，需上样15μg。
则需上样15÷1000=？上样量不超过20μl。
三，配胶
1.将薄板和厚板用洁净的布擦干净，对齐，夹好。
（板必须擦干净，
下端对齐，否则容易漏胶。
）
2.配分离胶，根据要跑的蛋白分子量，配相应浓度的胶。
3.快速将分离胶加入薄厚板之间，不能太满，留出浓缩胶的部分。
(浓缩胶高度大约1CM)
4.在分离胶上灌水，要缓慢，为了让胶凝的更好。
5.30分钟左右，分离胶凝了，将水倒掉，滤纸吸干，找好梳子。
制
浓缩胶。
6.灌胶，快速插入相应的梳子。
7.约15min胶可以凝固。
四，煮蛋白
1.煮蛋白前将蛋白中加入6×SDS+DTT(即上样缓冲液)。
例样品蛋白
共有100μl，则需加100÷5=20μl 6×SDS+DTT。
混匀。
（加有DTT的SDS应-20°C保存。
DTT应-20°C保存。
SDS：DTT=9：1）。
2.将蛋白沸水煮10min。
煮过的蛋白在两周内有效。
五，上样，跑胶，转膜
1.电泳巢内加入电泳液，夹好胶板。
拔去梳子。
2.每孔上样量不超过20μl，每块胶应上有Maker。
剩余的孔里上1
×SDS。
3.蛋白上样前要震荡混匀。
4.浓缩胶80V，分离胶120V。
5.转膜
半干法转膜或者湿转自己的试验条件决定。
根据分子量的大小，按照Maker的位置裁胶，根据胶的大小，剪相应大小的NC膜。
（NC膜要先用甲醇活化）。
六，封闭
5%牛奶（TBST稀释的脱脂牛奶）室温封闭1-2h，
七，封一抗
摸清抗体要用的浓度。
用TBST或5%牛奶加抗体。
室温1-2h，或4°C过夜。
用过的抗体要回收，做记号，用的第几次。
放入-20°保存。
八，洗膜
用TBST摇床上洗3遍，每次10min。
（一抗不要摇的太剧烈）
九，封二抗
摸清二抗的浓度。
室温45min-2h。
抗体回收，做记号，用的第几次。
放入-20°保存。
十，洗膜
用TBST摇床上洗3遍，每次10min。
（二抗可以摇的稍快些）
十一，发光
1.在发光板内放入干净的可以夹住NC膜的薄膜，放好已经洗好
的膜。
用滤纸吸干膜上的水。
2.拿齐发光板，发光液，1ml的枪及枪头（至少两根），胶片，一
张滤纸，一个离心管。
3.进入暗室，反锁好门，开红灯，在离心管内配发光液，A液：B
液=1：1。
先A后B。
切记换枪头，打开薄膜，将AB液混匀，均匀的洒在NC膜上。
盖上薄膜，将多余的发光液推开，以防水多膜移动。
漏出薄膜外的可用滤纸吸干。
4.关灯，看见荧光，盖上胶片。
胶片盖上之前先在左上角（个人
习惯）折个角，好辨认方向。
5.根据荧光强度按压几秒或几分钟。
将胶片放入洗片机冲洗。
6.等片子完全洗好，可开灯。
或者DAB显色需要买试剂盒。
十二，扫描保留结果
（注：可编辑下载，若有不当之处，请指正，谢谢!）。