腹泻儿童及灵长类动物肠道病毒宏基因组学研究
宏基因组学
广义的宏基因组：特定环境下所有生物遗传物质的总和 狭义的宏基因组：特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和
宏基因组测序（Metagenomics Next Generation Sequencing,mNGS)
NGS:也称高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。 mNGS:m指宏基因组。mNGS指宏基因组二代测序，以特定环境中整个微生物群落作为研究对象，利 用高通量测序平台进行基因组DNA测序，DNA不需要进行PCR扩增，测序结果具有较好的无偏性， 不仅可以提示微生物群落的物种组成，更能获需段序列分析不依赖 于任何已知序列信息进行筛选。其中以功能筛选法最为常用。
能够直接发现全新的活性物质和功能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子 缺陷：
工作量大,效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
谢谢！请大家批评指正
其前端关键性技术是环境DNA(e DNA)的提取A的提取
直接提取法（原位提取法） 不经过样品中微生物的培养和分离，通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释 放，并对DNA进行纯化。 操作简便、省时、成本低，所获得DNA具有较好的完整性，并能够代表某一生境的微生物群落多样性。 但常会出现细胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题，所以一般需要进一步的 DNA纯化处理，同时所提取获得的DNA片段较用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来，再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物 细胞提取DNA。 该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较少，纯度较高、DNA完整性好(20kb~大、DNA得率较低，其产率只是直接裂解法的1%~10%,且获得的DNA往 往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。
导致0～5岁婴幼儿发生急性腹泻的常见病原微生物检验结果分析
导致0～5岁婴幼儿发生急性腹泻的常见病原微生物检验结果分析目的：检验分析导致0～5岁婴幼儿发生急性腹泻的常见病原微生物。
方法：对入院就诊的80例0～5岁急性腹泻婴幼儿进行临床资料分析，并采集粪便标本进行病原菌培养鉴定及病毒学检验，统计病原微生物种类及构成比。
结果：采集的80例标本中，共有59例检出病原微生物，检出率为73.75%（59/80）；检出病原菌感染18例，检出率为30.51%（18/59），其中沙门菌检出率为44.44%（8/18），显著高于其他几种病原菌；检出病毒感染41例，检出率为69.49%（41/59），其中人轮状病毒（HRV）检出率为70.73%（29/41），人杯状病毒（HuCV）检出率为19.51%（8/41），显著高于其他病毒；且病毒检出率显著高于病原菌，差异均有统计学意义（P＜0.05）；主要病原微生物感染具有季节差异，沙门菌感染在夏季（6～8月）达到高峰期，占全年病例的75.00%（6/8）；HRV感染在冬季（12～次年2月）较为多发，占全年病例的55.17%（16/29），且全年均有HRV感染的发生；HuCV在夏季（6～8月）感染率最高，占全年病例的62.50%。
结论：HRV、HuCV及沙门菌是导致婴幼儿急性腹泻的主要病原微生物，且病原微生物感染呈现明显的季节分布，夏季以HuCV及沙门菌感染为主，冬季以HRV感染为主。
标签：0～5岁婴幼儿；急性腹泻；病原微生物婴幼儿腹泻在世界范围内均属于常见病和多发病，根据我国发布的资料显示，我国每年因腹泻病死亡的儿童比例高达0.51%，每个儿童每年约发生腹泻3.5次[1]；由此可知，防治腹泻对儿童身体健康及生命安全至关重要。
了解导致婴幼儿腹泻发生的病原微生物类型，有助于采取对应的措施预防疾病的发生，并可以指导临床治疗[2]。
本研究对在笔者所在医院住院的急性腹泻婴幼儿进行了病原微生物检验，现将相关结果分析总结如下。
1 资料与方法1.1 一般资料选择2016年1-12月笔者所在医院诊治的80例0～5岁急性腹泻婴幼儿粪便标本进行研究；患儿入院时病程均在14 d以内，其中男46例，女34例；3周岁以下患儿约占94%（75/80）。
宏基因组测序在感染性疾病病原学诊断中的应用
宏基因组测序在感染性疾病病原学诊断中的应用感染性疾病一直是世界范围内疾病主要致死原因之一。
WHO监测统计数据显示，在2016年全球约5690万例死亡患者中，有3项感染性疾病（下呼吸道感染、腹泻病、结核病）位列前10大死因，共造成的死亡数约占总死亡数的10%，其中下呼吸道感染造成约300万例患者死亡，腹泻病造成约140万例患者死亡，结核病造成约130万例患者死亡。
感染性疾病的病原体十分复杂，包括细菌、病毒、真菌及寄生虫等，而在目前的临床微生物检测工作中，微生物实验室对病原体的诊断主要还是依赖自19世纪即开展的培养、染色镜检等传统检测方法，以及后续发展的核酸扩增检测（例如PCR）、分子免疫学检查（例如ELISA）等检测手段，这使得临床医生对感染性疾病的病原学诊断、病情评估及治疗方案制定等存在许多困难。
目前仍有约60%的感染性疾病病例的病原体是诊断不明的。
由于宏基因组测序（mNGS）对病原学诊断具有无偏移、全覆盖、高效率等优势，越来越多的学者尝试将其应用于临床病原学诊断之中。
在此，我们回顾了近些年宏基因组测序在病原学诊断中的临床应用进展情况。
１．临床宏基因组学宏基因组的概念最早在1998年被学者提出，指在一份独立的土壤标本中，所有微生物的基因组信息的总和，包括那些无法培养的生物体的基因组信息。
后来，宏基因组的概念不仅仅局限于描述环境来源的标本，还被逐渐沿用于描述临床来源标本中的生物遗传信息特征。
临床宏基因组学指为获取临床相关的微生物信息而对临床来源的标本中所有的核酸序列进行测序分析的一门学科间。
宏基因组测序主要是通过以新一代测序为代表的高通量测序技术，对临床来源的标本进行宏基因组学分析，以获取病原体的物种分类、血清型、耐药性、毒力等一系列生物信息。
由于宏基因组测序不依赖病原体培养结果且可以不对可疑病原体的标志核酸序列进行靶向扩增，这使得检测结果更具客观性和全面性，且更迅捷，这是对传统实验室检测手段的有效补充。
病毒学检验知到章节答案智慧树2023年山东第一医科大学
病毒学检验知到章节测试答案智慧树2023年最新山东第一医科大学绪论单元测试1.病毒是一种专性细胞内寄生的非细胞型微生物。
（）参考答案:对2.病毒的种类较多，其中可以感染细菌的病毒我们称之为（）。
参考答案:噬菌体3.病毒学检验的一般原则包括（）。
参考答案:质量控制原则;足够的硬件设施;生物安全原则;标本的采集原则4.下列属于病毒直接检测方法的是（）。
参考答案:细胞病理学检测;病毒蛋白检测;电子显微镜技术;病毒核酸检测5.下列选项中，属于病毒学检验应用范围的是（）。
参考答案:病毒性传染病的的检验与检疫;新发病毒性疾病的病原和防治研究;病毒感染和病毒性疾病的诊断;病毒变异的研究6.新发传染病多是动物源性病毒性传染病。
（）参考答案:对7.病毒的变异类型包括遗传漂变（genetic drift）和遗传转移（genetic shift）两种类型。
（）参考答案:对8.下列因素中能够影响新发传染病发生与传播的有（）。
参考答案:病毒变异;国际旅行和商务;气候变化;公共卫生投入不足9.使用分子生物学检测新病毒核算室，需要用到非序列依赖性的方法，下列属于上述方法的是（）。
参考答案:病毒宏基因组学;随机引物PCR;简并PCR;非序列依赖性单引物扩增技术第一章测试1.在细胞培养系统中，培养一代细胞需要经过四个阶段，下列不属于这这四个阶段的是（）参考答案:游离期2.细胞在冻存时要掌握的原则是（）参考答案:慢冻快融3.常作为细胞培养液的指示剂是（）参考答案:0.4％的酚红溶液4.因为细胞培养液的营养丰富，更易于发生微生物污染，如细菌、真菌、支原体等，加（）可控制支原体的污染.参考答案:卡那霉素5.实验室器材的清洗过程正确的是（）参考答案:浸泡→刷洗→酸浸→冲洗6.从组织分离的原代细胞是一群对原有组织有较好代表性的细胞，但细胞间存在异质性，即差异性。
（）参考答案:对7.用胰蛋白酶做消化液时，浓度越大作用越强，对细胞的培养越有利。
(完整版)宏基因组测序讲解
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组学的PPT
宏基因组学的PPT宏基因组学是通过收集宿主的粪便里的微生物、以及培养皿中的微生物，利用专业的宏基因组技术进行分析。
它能够获得宏基因组信息和相关序列，从而为疾病相关症状的诊断和治疗提供依据。
随着人类健康问题愈演愈烈，为了降低成本，并能通过生物技术进行治疗，研究人员开发了宏基因组学技术。
其通过收集环境中存在的特定细菌，来分析它们在土壤、水源或大气中的分布，以了解它们在整个生态系统中所扮演的角色。
宏基因组学（宏测序法）是一种对人体和环境进行科学评价（包括微生物菌群与疾病之间关系）的工具。
它是一种高通量方法来鉴定微生物群落或疾病（包括寄生虫病等),并用于进行疾病和环境健康状态跟踪和诊断。
虽然宏基因组学可以通过分析病原体来诊断疾病——但目前还没有针对特定微生物群落或某一种病原体开展研究。
1.目的宏基因组学通过收集宿主的粪便和排泄物，以及在培养皿或土壤中的特定微生物群落来检测微生物菌群。
它们在宿主的整个生命周期中都是重要的，并且是许多宿主健康相关问题发生和治疗的潜在因素之一。
通过对宿主宏基因组学数据进行统计分析，可以更好地了解宿主微生物多样性与环境健康状况之间的关系；进而有助于了解宿主肠道微生物及其他微生物群落对人体健康所发挥作用；同时也有助于了解特定微生物群落与其健康状况之间的关系。
此外，还可以通过研究宿主体内微生物种群之间互相作用机制，从而更好地理解宿主微生物群落结构及疾病发生背后原因。
这为人类健康提供了新的见解。
在环境方面，宏基因组学可以从宿主微生物群落中发现与生态系统结构相关、通过检测宿主体内微生物群落来揭示生命现象本质和机制；还可以通过感染或死亡微生物群落以及与宿主相互交互作用规律来揭示微生物群落与疾病发生之间关系：同时宏基因组学还可以为相关研究人员提供研究资源、为治疗提供科学依据。
此外，宏基因组学还能为环境健康状态跟踪和诊断提供参考——为了解环境健康状态和健康风险提供科学依据。
2.方法原理在了解宿主肠道中的微生物群落的组成之后，宏基因组学可以分析宿主的粪便样本。
肠道菌群宏基因组学研究技术与应用护理课件
具有全面性、系统性和综合性，能够 全面解析肠道微生物的多样性和复杂 性，为深入研究肠道健康、疾病发病 机制和药物研发提供有力支持。
研究目的与意 义
目的
探究肠道微生物群落的结构、功能和演化规律，揭示肠道微生物与宿主之间的 相互作用机制，为肠道相关疾病的预防、诊断和治疗提供科学依据。
意义
肠道微生物宏基因组学研究有助于深入理解肠道微生物在人体健康和疾病中的 作用，为精准医疗和个性化护理提供重要支持。
01
研究肠道菌群与感染性疾病的关系，为预防和控制感染提供依据。
肠道菌群与慢性疾病
02
研究肠道菌群与慢性疾病（如糖尿病、肥胖症等）的关系，有
助于早期发现和干预。
肠道菌群与心理健康
03
研究肠道菌群与心理健康的关系，为心理疾病的预防和干预提
Байду номын сангаас供新思路。
个体化护理方案
肠道菌群监测与评估
通过监测和评估个体肠道菌群，为制定个体化护理方案提供依据。
间的关联。
临床转化
越来越多的研究成果被应用于临 床实践，为疾病预防、诊断和治
疗提供了新的思路和方法。
数据共享与隐私保护
数据安全
在肠道菌群宏基因组学研究中， 涉及大量个人敏感信息，需要采 取有效的加密和匿名化措施，确
保数据安全和隐私保护。
数据共享
为了促进学术交流和合作，需要建 立规范的数据共享机制，确保数据 合法合规地被使用和传播。
PART 02
肠道菌群宏基因组学研究 技术
测序技术
16S rRNA基因测序
通过对肠道细菌16S rRNA基因的测序，鉴定不同种类的肠道细菌。
全基因组测序
对肠道细菌的全基因组进行测序，了解肠道细菌的基因组结构和功 能。
宏基因组学
,已发现的新基因主要有生物催化 剂基因、 抗生素抗性基因以及编码转运蛋白基因
• 土壤宏基因组学技术最引人注目的贡献是新生物 催化剂的发现 , 包括腈水解酶和淀粉酶( Rondon et al . , 2000 )、 蛋白酶、 氧化还原酶(Knietsch et al . , 2003)、 脂肪酶、 酯酶 ( Ki m et a l . ,2004; 2006)等 ,并且在此基础上获得新酶的许 多特征信息.
• 海表层水样 为研究海洋生命的代谢潜力和海洋生态学提供
了前所未有的原始素材；海洋蕴藏着巨大的生物 多样性和复杂性 ,宏基因组学研究将大大促进人 们对它的认识。 • 极端环境水体 (如酸性矿水、 深海 )
由于其苛刻的物理化学条件,使得其中的微生 物群落也较为独特 ；利用环境基因组学对其开展 微生物生物群落结构及生理代谢对环境变化响应 的研究 ,将促进我们更好地理解这些极端环境生 态系统并对其加以调控和利用。
序列分析法
• 微序列技术 (Micr oarray)采用集约化和平面处 理原理 ,在微小片基上高密度而有序地排列大量 基因片段、 EST或寡核苷酸片段 ,从而形成 DNA 微矩阵 ,又称基因芯片。
• 焦磷酸测序技术( Pyrosequencing) 是在焦磷酸 盐测序法的基础上结合一种乳胶材料和皮升级反 应孔 ,将基因组 DNA进行随机切割 ,批量地进行 整个测序反应，能够在相同的时间内破译 6 × 106组以上的基因组序列 ,比 Sanger法要快100 倍 ,提高了测序的效率。
将一条完整的目标序列随机打断成小的片段 , 分别测序 ,然后利用计算机根据序列间的重叠关 系进行排序和重新组装, 并确定它们在基因组中 的正确位置 。
• 优点：为筛选新的天然产物提供了 一种可选择的途径, 从中挖掘上百 万个新基因,揭示不可培养微生物 的代谢途径.
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腹泻儿童及灵长类动物肠道病毒宏基因组学研究腹泻是全球重要的公共卫生问题,是感染性疾病中引发死亡的第三位病因。
急性腹泻在儿童群体内属于常见病和多发病之一,在发展中国家急性腹泻是导致婴幼儿死亡的主要主要病因之一,其致病因素主要为寄生虫、细菌和病毒感染。
随着抗生素的发现和有效使用,加上水源供应和公共卫生条件的改善,寄生虫和细菌感染所导致的腹泻类疾病得到了有效控制,而病毒性腹泻大多没有有效控制和治疗方法,引起人们越来越多的关注。
人类及动物消化道中存在庞大的病毒群落,这些病毒绝大多数是未知的。
目前,人类对于新型病毒性腹泻仍然没有特殊的有效防治措施。
因此,人类想要真正克服新型病毒导致的传染性疾病,只有通过有效的方法提前发现潜在的致病性新型病毒,在此础上对新型病毒进行基因组结构、流行病学、疫苗研究和治疗性抗体开发等方面进行深入研究,从而为病毒性腹泻防控、临床诊疗等提供理论基础和技术支持。
病毒宏基因组学(Viral Metagenomics)是一种新型的病毒分子生物学检测技术,该技术的创立和发展是基于宏基因组学(metagenomics)理论,结合现有的分子病毒学检测方法开创的一个新的宏基因组学分支。
该研究技术突破了传统方法的局限,直接以临床样本中的所有病毒核酸为研究对象,有效地避开了病毒细胞培养、血清病毒抗原／抗体检测和基于病毒已知序列的PCR扩增；病毒宏基因组学方法不仅能够开速检测出样品中存在的已知病毒,更为重要的是该方法还能够有效的检测出新型及未知病毒；从而可以在获得病毒基因序列的基础上解析临床标本中的病毒群落的组成甚至是病毒滴度,实时监控特定病毒动态变化及分布,揭示新型或未知致病性病毒与特定疾病之间的关联性,对于临床诊治新型或未知病毒所致疾病具有重要的理论和现实意义。
灵长类动物与人类不仅体质特征很相似,而且社会行为也很相近,灵长类动物体内可能携带诸多人畜共患病病原体。
因此,本研究采用病毒宏基因组学方法分析比较腹泻儿童及灵长类动物群体粪便中病毒群落的差异并挖掘潜在的新型腹泻相关病毒,研究结果对于病毒性腹泻的诊断、治疗及疾病暴发的防控具有重要的实际意义。
本研究主要内容和结果如下：(一)腹泻儿童肠道病毒群落的组成构建儿童腹泻及健康对照组肠道病毒组基因文库,通过Miseq高通量测序结合生物信息学调取文库中所有可能的病毒基因,分析病毒群落的组成。
结果显示儿童肠道病毒群落的组成包括：杯状病毒科(Caliciviridae),腺病毒科(Adenoviridae),微小RNA病毒科(Picornaviridae),呼肠孤病毒科(Reoviridae),噬菌体,细小病毒科(Parvoviridae),指环病毒科(Anelloviridae)及未分科病毒和少量的其他病毒。
病毒群落分析提示：(1)尽管健康对照组儿童粪便样品中病毒多样性与腹泻组无明显差别,但病毒滴度显著低于腹泻组样品。
(2)腹泻组和健康对照组所有文库均为杯状病毒阳性,但腹泻组病毒滴度显著高于健康对照组。
(3)星状病毒不是本研究腹泻群体的主要病因。
(二)腹泻灵长类动物肠道病毒群落的组成构建灵长类动物腹泻及健康对照组肠道病毒组基因文库,通过Miseq高通量测序结合生物信息学调取文库中所有可能的病毒基因,分析病毒群落的组成。
结果显示灵长类动物肠道病毒群落的组成包括细小病毒科(Parvoviridae),帚状病毒科(Virgaviridae),腺病毒科(Adenoviridae),微小RNA病毒科(Picornaviridae),噬菌体,双生病毒科(Geminiviridae)病毒,圆环病毒科(Circoviridae),修道院病毒科(Closteroviridae),二顺反子病毒科(Dicistroviridae),传染性软腐病病毒科(Iflaviridae),星状病毒科(Astroviridae),番茄丛矮病毒科(Tombusviridae), 杯状病毒科(Caliciviridae)及未分科病毒和其他病毒。
病毒群落分析提示：(1)腹泻组病毒群落的组成和病毒滴度与健康对照组无明显区别。
(2)灵长类动物腹泻粪便中可以感染哺乳动物的病毒主要为细小病毒和圆环病毒,但病毒滴度在两组之间无明显差异。
(3)最近发现的picobirnaviridae病毒在灵长类动物肠道中广泛存在。
(4)星状病毒不是本次研究的灵长类动物腹泻的主要病因。
(5)灵长类动物肠道内植物病毒种类多且病毒滴度高。
(三)儿童与灵长类动物肠道病毒群落的比较本研究比较儿童与灵长类动物肠道病毒群落的组成,结果提示：(1)灵长类动物肠道病毒组成的多样性高于儿童肠道病毒群落,灵长类动物肠道内病毒群落可以分为15个主要病毒科或者病毒种类,而儿童肠道病毒群落主要为9个病毒科或病毒种类组成。
(2)灵长类动物肠道病毒群落中植物病毒占多数,而儿童肠道病毒群落内感染哺乳动物的病毒占多数。
原因可能是由儿童和灵长类动物的食物谱不同造成的。
(3)总体上灵长类动物肠道内的病毒滴度高于儿童肠道内病毒。
(四)儿童及灵长类动物肠道内新型病毒及腹泻相关病毒的鉴定(1)腹泻相关的新型星状病毒本研究在儿童肠道病毒群落中发现了2种不同的新型星状病毒(HAstV-JS1和HAstV-JS2),而在灵长类动物中发现了1种新型星状病毒(MAstV-JS)。
序列比对及系统进化分析表明本研究中3株星状病毒与GenBank中星状病毒毒株没有近源毒株,说明该3株星状病毒毒株为新型星状病毒。
基于该3株毒株的特异性引物进行PCR检测表明HAstV-JS1在腹泻儿童群体的阳性率为12.20%,健康对照组样品均为阴性。
HAstV-JS2在腹泻群体内的阳性率为10%(9/90),健康对照组样品均为阴性。
MAstV-JS在腹泻灵长类动物群体的阳性率为3。
5%(2/58),健康对照组均为阴性。
提示本研究发现的3株新型星状病毒与腹泻有一定的相关性。
(2)腹泻相关的诺如病毒本研究在腹泻儿童及灵长类动物群体的粪便样品中检测除了多个诺如病毒毒株。
通过Geneious软件de novo组装成4个完整的基因组(NoV-JS1、NoV-JS2、NoV-JS3和NoV-JS4)。
4株诺如毒株与GenBank之前发现的毒株在核苷酸水平相似度大于95%,系统进化分析显示NoV-JS1与广州地区分离NoV毒株(KC894943)聚类,NoV-JS2与NoV-JS1所在的聚类群同处在同一个聚类群；NoV-JS3与另外1株广州分离的NoV毒株(KF989075)紧密聚类；NoV-JS4与我国荆州地区的NoV(KF306214)紧密聚类。
提示江苏地区腹泻儿童群体内有3种不同的NoV在儿童群体流行。
利用Geneious软件在灵长类动物肠道病毒群落中拼接l株诺如病毒全基因组序列。
序列比对显示该株诺如毒株与GenBank中提交的唯一1株灵长类动物的calicivirus序列相似度为85%；PCR检测发现腹泻灵长类动物粪便标本该病毒阳性率为10%,说明该杯状病毒可能与灵长类动物的腹泻有相关性。
(3) Picornaviridae与Picobirnaviridae本研究显示,在儿童腹泻病毒群落中,picornaviridae与儿童腹泻有一定的相关性。
而在灵长类动物病毒群落中,picornaviridae家族的病毒与灵长类动物的腹泻相关性不高。
儿童腹泻病毒群落内没有发现picobirnaviridae,说明picobiranviridae与本次研究的儿童腹泻无相关性。
而在灵长类动物腹泻组,picobirnaviridae家族的病毒与灵长类动物的腹泻有一定的相关性。
(4)新型戊型肝炎病毒样新型病毒(Hepeliviridae)本研究在灵长类动物粪便样品中发现1株新型戊型肝炎病毒样病毒(命名为MHEV-JS)。
MHEV-JS全基因组为7289bp,与人类HEV相似,该基因组主要编码3个开放阅读框,其衣壳蛋白与人HEV的相似度约30%。
基于RdRp蛋白的氨基酸序列及病毒基因组的核苷酸碱基组成分析结果均显示MHEV-JS属于脊椎动物病毒,说明该病毒不是来自动物食入的植物病毒或昆虫病毒。
基于RdRp区设计一套巢式PCR检测引物,RT-PCR检测结果显示7份灵长类动物粪便样品为阳性,均来自同一个样品采集点,其中5份来自腹泻样品,2份来自健康对照样品,结果提示本研究中发现的新型HEV与灵长类动物的腹泻没有相关性。
(5)圆环病毒及圆环病毒样病毒本研究在儿童肠道病毒群落(GemyV-JS和CycV-JS)及灵长类动物肠道病毒群落(MGemyV-JS)内发现了3个具有环形基因组的单链DNA病毒。
该3株圆环病毒样病毒均含有1个Rep基因,编码病毒的环形复制酶Rep,含有一个编码病毒capsid衣壳蛋白的Cap基因。
系统进化结果显示：GemyV-JS与1株分离自Dragonfly的Germycircularvirus毒株聚类,它们的Rep蛋白在氨基酸水平相似度为49.4%；MGemyV-JS与分离自人类血液的Gemuycircularvirus 聚类,它们的Rep蛋白在氨基酸水平相似度为48.5%。
CycV-JS与其他Cyclovirus聚类在一起,其Rep蛋白在氨基酸水平相似度为56.3-58.9%。
基于该3株病毒基因组序列设计的PCR引物进行病毒基因检测,发现该3株病毒的阳性样品均只有1份,说明本研究中发现的3株环形DNA病毒均与腹泻无明显相关性。
(6)灵长类动物新型腺病毒在灵长类动物病毒群落中发现1株新型腺病毒毒株(SAdV-Chl),本研究对该腺病毒毒株进行了全基因组测序,该毒株在基因组大小、基因组结构、碱基组成上与人类A型腺病毒相似,而与其他灵长类动物的腺病毒毒株明显不同。
基于全基因组序列和病毒主要基因序列进行的系统进化分析,结果显示该灵长类腺病毒毒株其他4株来自人A型腺病毒毒株紧密聚类形成一个单独的分支,与其他灵长类腺病毒毒株遗传关系较远。
基于腺病毒全基因组序列的重组分析表明SAdV-Ch1作亲代毒株参与病毒基因同源重组,即由SAdV-ch1和HAdV-61作为母代毒株进行基因同源重组产生子代毒株HAdV-31.以上结果提示该灵长类腺病毒毒株具有跨种间传播的潜在可能。
结论：(1)本研究运用病毒宏基因组学方法成功解析了我国腹泻儿童及灵长类动物群体的肠道病毒群落；(2)灵长类动物肠道病毒群落病毒种类多样性高于儿童群体肠道病毒群落；(3)在儿童及灵长类动物肠道病毒群落内发现并鉴定了3株新型星状病毒、1株新型戊型肝炎病毒样病毒、3株圆环病毒样病毒、1株新型腺病毒；(4)灵长类动物肠道病毒群落内的新型腺病毒具有跨种间传播的潜在可能。