手足口病RT-PCR检测标准操作程序_TianGen_1_2
1、手足口病标本采集及检测技术方案
附件1手足口病标本采集及检测技术方案一、采集标本的种类、保存和运输（一）粪便标本。
采集病人发病3日内的粪便标本，用于病原检测。
粪便标本采集量5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，4℃暂存12小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。
（二）咽拭子标本。
采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。
用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。
4℃暂存并在12小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。
（三）血清标本。
各省（区、市）在手足口病流行年份中均应采集EV71 和CVA16感染的手足口病患儿的双份血清。
采集急性期（发病0-7d）和恢复期（发病14-30d）双份配对血清用于阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。
静脉采集3-5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。
将血清置于-20℃以下冰箱中冷冻保存。
（四）疱疹液。
在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本。
先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。
所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
RT-PCR操作常规
RT-PCR操作规程一，提取RNA1.取中号培养瓶(100ml培养瓶注:此时细胞汇合度≥80%),用PBS洗细胞两次，弃尽PBS，再加入约1ml PBS，用细胞刮子将细胞刮下，将细胞悬液加入1.5 mlEP管，常温，5000rpm2分钟，弃尽上清。
加0.5mlTRIzol，剧烈震荡（TRIzol由粘稠状变为清亮，仍为粉红色）。
2.室温静置30分钟.3.在EP管中各加入0.1 ml氯仿。
盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒（必要时剧烈震荡）并将其在室温静置10分钟.4.在4°C下用12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。
离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层为白色的蛋白层，上层无色的水样层。
5.用移液枪分别转上层水相（约250-300μl）于另一 1.5mlEP管中,加等体积异丙醇（约250-300μl），颠倒混匀-20°C， 10分钟来沉淀RNA→在4°C 下以12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。
注:移液枪的枪头不宜伸入液面太深,以防洗上中层液体!;离心前注意放管的方向,此时RNA沉淀形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。
6.舍弃上清,用750μl的无水乙醇+250μlDEPC水，（预冷保存于-20°C)来洗涤RNA沉淀→在4°C以7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。
;离心前注意放管的方向,注:旋涡振荡混合样品;RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年!7. 弃上清，置于滤纸上，在超净工作台中强风吹到6-7成干（太干不易溶解），用20μl DEPC 水溶解。
(建议装于0.6的EP管中.)8紫外光度检测，使用核酸测定仪读取RNA的浓度及OD260/280比值，为了明确确RNA的质量，可以提前准备一块琼脂糖凝胶，120V，15分钟快速电泳，紫外灯下观察，是否可见5s 18，28s条带。
rt-pcr反应步骤
rt-pcr反应步骤
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种用于检测RNA的技本。
它可以将RNA转录成DNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定的DNA片段。
以下是RT-PCR的一般步骤：
1. 样品处理，首先需要从样品中提取RNA。
这包括细胞或组织
的裂解以释放RNA，并使用适当的试剂将RNA纯化出来。
2. 逆转录，提取的RNA经过逆转录反应，使用逆转录酶（如
M-MLV逆转录酶）将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
3. PCR准备，为了进行PCR，需要将逆转录产生的cDNA与引物（primer）和DNA聚合酶（如Taq聚合酶）放入PCR反应管中。
引
物是一小段与目标DNA序列互补的DNA片段，它们将指导DNA聚合
酶在特定区域合成新的DNA链。
4. PCR扩增，PCR反应进行数个循环，每个循环包括三个步骤，变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应混合物被加热以使DNA解链。
在退火步骤中，引物与目标DNA结合。
在延伸步骤中，DNA聚
合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这些循环会使目标DNA片段
指数级增加。
5. 结果分析，最后，通过凝胶电泳或其他技术，可以分析PCR 反应产生的DNA片段，确定是否存在感兴趣的基因或RNA。
总的来说，RT-PCR是一个用于检测和定量RNA的强大技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以在研究和临床诊断中发挥重要作用。
Rt－PCR实验操作步骤
Rt－PCR实验操作步骤RT-PCR实验操作步骤（转）默认分类2007-12-25 17:51:05 阅读233 评论1 字号：大中小订阅一.所用试剂1.0.01MPBS缓冲液,PH7.4 ：高压灭菌，40C保存。
临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。
2.焦碳酸二乙酯(DEPC)：sigma公司，40C保存。
3.0.1%DEPC处理的灭菌去离子水：100ml去离子水中加入0.1mlDEPC，剧烈振荡混匀，让DEPC充分进入溶液中，370C放置过夜，高压蒸汽灭菌30分钟除去DEPC。
40C保存。
4.单相细胞裂解试剂TRizoL：Invitrogen生命技术公司，40C保存。
临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。
5.氯仿：用新开封的，10ml分装，40C保存。
临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。
6.异丙醇：用新开封的，20ml分装，40C保存。
临用前－200C 放置30分钟，确保冰冷。
7.0.1%DEPC处理的75％乙醇：无水乙醇75ml加0.1%DEPC处理的灭菌去离子水至100ml，4C保存。
临用前－200C放置30分钟，确保冰冷。
8.cDNA反转录试剂盒：MBI公司，－200C保存。
9.2xPCR试剂：MBI公司，－200C保存。
10.5xTBE RNA电泳缓冲液：因为Tris碱可与DEPC发生反应并使之失活，所以含Tris碱的电泳缓冲液可用DEPC处理的灭菌去离子水配制，0.22um滤器过滤除菌。
室温保存，临用前用DEPC处理的灭菌去离子水10倍稀释。
使用本室RNA专用电泳槽，每次需配制0.5x 电泳缓冲液500ml。
11.50xTAE DNA电泳缓冲液：室温保存，临用前用去离子水50倍稀释。
使用本室DNA专用电泳槽，每次需配制1x电泳缓冲液1000ml。
12.6x上样缓冲液：1.5mlDEPC处理的灭菌离心管中称取2.5mg 溴酚蓝，加入0.3ml甘油，DEPC处理的灭菌去离子水定容至1ml，40C保存。
RT-PCR具体实验步骤
品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入 DEPC 水)，过夜后取出(注意： DEPC 水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的 DEPC 物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP 管和 匀浆管装入饭盒后甩干，然后在 37 度孵箱烘干)。高压后烤干备用。如果 DEPC 处理过的物品时 间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。
组织 100mg/细胞 1×107 ↓
加 1mlTRIzol ↓
组织：匀浆(彻底，分几次打，是匀浆时产生的热量能散出，后转至 EP 管) 细胞：用 1ml 加样器吹至液体澄清且无细胞团块 ↓ 颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟 ↓
加氯仿 1/5 体积(0.2ml)(必须按总体积的 1/5) ↓
颠倒混匀 10 下，室温 5 分钟 ↓
装 DEPC 水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在 40-45 分钟，所以水要适当多加一 点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。
3．异丙醇：放入棕色瓶中。 4．氯仿：放入棕色瓶中。 5．琼脂糖
四．缓冲液配制 1．电泳缓冲液(5×TBE 贮存液)：Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加
一．实验器具： 1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl 2.吸头：1ml、200μl、20μl 3.匀浆管：5ml 4.EP 管：1.5ml、500μl、200μl 5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放 75%乙醇) 6.量筒：100ml 7.容量瓶：1000ml 8.试管架：5ml、1.5ml、20μl 9.铝制饭盒：1-2 个 10.大瓷缸：1 个 11.锡泊纸：一卷 12.卷纸：2 卷 13.三角烧瓶：带盖，稍大
天根 一步法逆转录PCR试剂盒说明书
通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书前言本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。
用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。
一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。
由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。
规格20人份适用仪器适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。
试剂盒组成试剂准备根据下表配制反应液：振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。
PCR扩增将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实时检测。
结果判断扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。
保存及有效期-20℃保存，有效期为6个月。
注意事项1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。
2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。
3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。
4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。
5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。
6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。
生产企业：上海蓝创生物科技发展有限公司。
RT-PCR实验步骤及注意事项
RT-PCR实验时间:2013-01-05 22:32 来源:作者:生物界RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng 或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA 存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
RT-PCR操作流程及其相关注意事项
1、基因表达：DNA
RNA
Protein
2、PCR 技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应，其特异
性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：
A、变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链 DNA；
操作步骤：
1、 均质化： 单层培养的细胞，直接在培养瓶中裂解。倒掉培基，中号培养瓶中直接加入 1mlTrizol 试剂，加入后即反复抽吸、吹打细胞数次（约 20~40 次） ↓ 室温(15~30℃)孵育 5min（以利于匀浆样品中核蛋白体完全解离） ↓ 转移均质溶液到新的 1.5mlEP 管中
2、 相分离： ↓
a、引物长度:一般为 15～30bp ，引物太短会影响 PCR 的特异性，引物太长 PCR 的最适延
伸温度会超过 Taq 酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现 3
个以上的单一碱基。GC 含量（Tm 值）：40％～60％，PCR 扩增的复性温度一般是较低 Tm
逆转录（应用 GeneCopoeiaTM First Strand cDNA Synthesis Kit）
：1、准备：缓慢颠倒混匀试剂，避免起泡，并经瞬时离心后，放置冰上待用。 用于制备 RNA-Primer Mix 的 EP 管需在冰上预冷。
2、制备 RNA-Primer Mix,轻弹几下混匀，瞬时离心
值减去 5～10 度。
c、 3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构
的可能。末位碱基是 A 时错配的引发效率最低，G、C 居中间，因此引物的 3’端最好选用 A、
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手足口病RT－PCR检测标准操作程序
（试用）
（2008年5月22日第1版，2008年5月29日修改）
内部标准编号：
检测项目：肠道病毒EV71、CA16，其他肠道病毒
检测方法：RT－PCR
PCR仪器：Bio－Rad iCycler
1.检测原理
根据已知肠道病毒5’－UTR区基因序列及EV71、CA16的VP1－VP3基因序列，设计特异性引物（PE、EV71、CA16），通过Nested RT－PCR扩增基因片段，检测标本中是否存在肠道病毒EV71、CA16和其他肠道病毒。
所用引物序列、扩增产物大小和配制如下：
引物核酸序列(5’–3’)产物长度
加DEPC水量(uL) （1 OD配制25 uM）
PE2 TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA
ATC C
116 bp 156
PE1 ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC
GGT CC
180
EV71-S GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC
226 bp 196
EV71-A ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC 208
CA16-S ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC
208 bp 220
CA16-A TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG 208
2.应用的范围
检测血清、血浆、粪便、咽拭、疱疹液、脑脊液等标本中肠道病毒EV71型和CA16型病毒基因片段。
3.标本处理
3.1 粪便标本处理：
3.1.1将1.5ml Eppendorf管上标记标本号;
3.1.2每一管中加入900ul生理盐水、100ul 氯仿;
3.1.3在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约0.1g约绿豆大小，加入标记好的离
心管中，剩余原始标本最好留在原容器中并冻存于- 20℃。
3.1.4 确保拧紧离心管，用机械振荡器剧烈振荡20min。
3.1.51500g* （约3500转）离心20分钟。
3.1.6 将每一份标本上清吸入新1.5ml Eppendorf管中。
注意：若上清不清澈，应再用氯仿处理一次。
以上标本处理方法适用于从患者排泄物、呕吐物（均简称样品）中提取病毒RNA。
3.2咽拭子标本处理
咽拭子要在保存液中充分搅动（40下左右）或用机械振荡器剧烈振荡5~10min，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后10000rpm 离心20min或4℃静置10min，取上清吸入2个有外螺旋盖的标记好的冻存管中。
注意：以上标本处理方法适用于从疱疹液拭子、肛拭子（均简称样品）中提取病毒RNA。
脑脊液、血清标本不需要处理可直接用于RNA提取。
3.3 提取病毒RNA模板
应用RNA提取试剂盒（TianGEN公司产品，Cat. No：DP315-R）方法
试剂准备：
a打开新试剂盒，需将310uL Rnase－free ddH2O加入310ug Carrier RNA获得1 ug/uL 的溶液。
溶解后需分装保存于-20℃。
（每管分装56uL可做10次提取）。
此溶液反复冻融不能超过3次。
b Carrier RNA工作液配置：根据样品的数量计算所需裂解液RL和Carrier RNA溶液的体积，将裂解液RL与Carrier RNA溶液颠倒混匀，即得到Carrier RNA工作液。
为避免溶液出现气泡现象，请勿使用涡旋振荡。
N ×0.56 mL＝Y mL
Y mL ×10 uL/mL=Z uL
N－样品数目；Y－裂解液RL溶液体积；Z－需加入Carrier RNA溶液体积
注意Carrier RNA冻干粉不能直接溶解于裂解液RL中，必须先溶解在Rnase－free ddH2O 中，再溶解至裂解液RL中。
溶解后2-8℃最多能保存48小时，最好现用现配。
c缓冲液GD、漂洗液RW 为浓缩液，第一次使用前加入无水乙醇（试剂瓶上标注的量）混匀，室温可储存1年。
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 提取病毒RNA模板：
3.3.1 吸取560 µl含有Carrier RNA的RL到1.5ml Eppendorf离心管中。
3.3.2 加140 µl 1标本到上述离心管中，回旋振荡15秒。
3.3.3 室温（15～25℃）孵育10 min。
3.3.4 短暂离心一次。
3.3.5 加560 µl乙醇（96～100％）到离心管中，盖上离心管帽，回旋振荡15秒。
短暂
离心一次。
3.3.6 从离心管中吸取630 µl溶液至Rnase-free吸附柱CR2中，注意不要滴到柱子边缘
上。
盖上离心管帽，6000g（8000rpm）离心1 min。
用移液器把吸附柱套管中的
滤液吸出弃掉，将套管套回原吸附柱中。
3.3.7 重复第6步的步骤。
3.3.8 加500 µl 缓冲液GD，盖上离心管帽，6000g（8000rpm）离心1 min。
用移液器
把吸附柱套管中的滤液吸出弃掉，将套管套回原吸附柱中。
3.3.9 加500 µl漂洗液RW，盖上离心管帽，6000g（8000rpm）离心1 min。
用移液器
把吸附柱套管中的滤液吸出弃掉，将套管套回原吸附柱中。
3.3.10 13400g（12000rpm）离心3 min。
用移液器把吸附柱套管中的滤液吸出弃掉，将
套管套回原吸附柱中。
3.3.11 可选：打开吸附柱盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干。
3.3.12 将吸附柱放入一个新的1.5ml 无RNA酶离心管中，打开柱子帽，加入60µl Rnase
－free ddH2O，盖上盖子，在室温孵育5min，6000g（8000rpm）离心1 min。
3.3.13提取的病毒RNA模板可立即进行逆转录，或贮存于－70℃备用。
4.RT－PCR反应
4.1 准备引物
4.1.1 引物溶解方法
4.1.1.1 将盛放冻干引物干粉的Eppendorf离心管放入离心机，插入离心管时应注意放
置方向，10000rpm离心10min。
4.1.1.2 小心取出离心管，放置到合适的试管架上，在PCR实验室的“准备间”溶解稀
释引物。
4.1.1.3 小心打开Eppendorf管，按照4.2“引物加水配制表”加入RNase－free ddH2O，
用枪头仔细搅刮或吹打离心管底部引物沉淀处，使引物充分溶解至水中，关闭
离心管盖，在回旋振荡器上振荡10min。
短暂离心，使管壁液体集中到管底。
4.1.2 引物加水量
引物加水稀释，配制成25uM的母液，各引物每管（1 OD）加水量如下表
引物加水配制表
4.2 一步法逆转录PCR（RT－PCR）（中国CDC全国学习班推荐方法）
配制如下逆转录及PCR反应体系（TianGen公司RT－PCR试剂盒）
程序：50℃40分钟；94℃5分钟；
94℃30秒，50℃40秒，65℃50秒，35个循环；
65℃10分钟。
（总时间约170分钟）
5.结果判断
PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，出现相应长度的扩增产物即为该基因检测阳性。
（产物：EV71S-EV71A引物：226bp；CA16S-CA16A引物：208bp; PE2－PE1引物：116bp）
6.检测的局限性
待查
7. 参考文献
7.1 中国疾控中心网站，手足口病专题，EV71、CA16检测方案
7.2 其他中外文文献
第1版制定人：马宏杜燕华制定时间：2008年5月22日
第1版修订人：马宏杜燕华修订时间：2008年5月29日
操作规程修改记录
2008年5月29日修改：
1.增加引物溶解、稀释内容。
2.修改2008年5月22日版中反应体系引物浓度，表“一步法逆转录PCR（RT－PCR）
（中国CDC全国学习班推荐方法）”中上、下游引物量由“1.2 uL”改为“0.6 uL”。
3.修改2008年5月22日版中其他部分笔误。