造血细胞分离、集落培养及表型分析
血细胞分离培养方法和步骤-2
血细胞分离培养方法和步骤-2收集浑浊带分离获得的淋巴细胞，用无钙、镁离子的PBS洗3次后，再用培养基洗1次后计数，分瓶培养。
此法分离获得淋巴细胞纯度高。
分离液的制备：9% Ficoll（20℃下相对密度约1.020）24份与33.4%泛影葡胺（用泛影钠或Conray400也可，在20℃下相对密度约1.200）10份混合后，将其相对密度调至1.077金额可获得淋巴细胞分离液，于12 1℃高压蒸汽灭菌30min，室温保存备用。
若配制高相对密度的分离液用加入高浓度泛影葡胺来调整，若配制低相对密度的分离液用稀释的F icoll来调整。
（二）淋巴器官中淋巴细胞的分离：从脾脏、淋巴结、扁桃体或胸腺等器官中制备淋巴细胞悬液，在免疫学研究中是经常用到的。
方法如下。
无菌取上述淋巴器官，若为扁桃体，应将扁桃体在剥离外表的结缔组织和血块后，在含高浓度抗生素的洗液中4℃浸泡2-4h，以防污染。
将淋巴器官剪成碎块，用镊子压挤碎块，或在金属丝网上研磨，用洗液冲洗，或用玻璃匀浆器研磨，制成悬液。
自然下沉10min后，吸取上层细胞悬液，弃去下层沉淀的组织块，1500 r/min离心，取沉淀物，用无钙、镁离子的PBS洗2次后，混悬于培养基中，分瓶培养。
用上述分离法所获得的拎包细胞，可用于白细胞黏附移动试验、转化试验、细胞毒试验，同时可用于细胞因子的诱生和制备，或扩增外周血造血细胞、树突细胞、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK细胞)、Tδ细胞等，供细胞移植用。
（三）人脐带血细胞分离培养：人脐带血来源方便，采集容易，对母婴均无伤害。
近年来研究表明，脐带血的血浆中富含许多高水平的造血活性物质，具有刺激和促进骨髓造血干/祖细胞增殖、分化和再植能力的功能，是造血生长因子的重要来源。
脐带血中富含类似于骨髓的造血干细胞，其中CFU-G、BFU-E、CFU-GM近似或高于正常成人骨髓和外周血中的造血干/祖细胞，比骨髓更原始，具有很强的自我复制和再植能力。
造血祖细胞培养检测结果
造血祖细胞培养检测结果
首先，我们需要关注的是造血祖细胞的数量。
造血祖细胞的数量反映了骨髓中干细胞的丰富程度，是评估骨髓功能的重要指标。
如果造血祖细胞数量过低，可能提示骨髓功能受损或者其他疾病的存在。
其次，我们还需要关注造血祖细胞的功能。
这包括它们在培养条件下的增殖和分化能力。
功能良好的造血祖细胞能够在适当的条件下不断增殖并分化成各种成熟的血细胞，从而保持机体内血液系统的稳定。
此外，造血祖细胞培养检测还可以评估干细胞的分化潜能和成熟度。
通过观察干细胞向不同细胞系的分化情况，可以了解机体内造血系统的发育和功能状态。
最后，除了数量和功能，造血祖细胞培养检测还可以评估干细胞的遗传学特征和表观遗传学调控。
这些信息对于了解患者的遗传易感性和疾病发展过程具有重要意义。
综上所述，造血祖细胞培养检测结果涉及到造血祖细胞数量、
功能、分化潜能以及遗传学特征等多个方面的信息。
针对不同疾病和临床情况，这些信息都可能提供重要的诊断和治疗参考。
因此，在解读检测结果时，需要综合考虑上述各个方面的信息，结合临床情况进行全面分析和判断。
细胞集落形成实验
细胞集落形成实验方法介绍非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。
纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。
原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。
细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。
集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100%（一）原理细胞集落形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。
每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。
集落形成率表示细胞独立生存能力。
常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。
（二）实验用品1.材料：Hela细胞。
2.器材：（直径 60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。
3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。
（三）方法1.平板克隆形成试验本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。
(1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。
(2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。
细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。
(3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。
一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径 60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。
(4)培养皿置 37℃、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。
(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。
甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。
造血干细胞的异质性
造血干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。
越来越多的证据表明，从细胞增殖、分化、自我更新及寿命等多个角度来看，HSC是一个具有异质性特征的细胞群体。
HSC异质性的存在增加了我们了解HSC功能及其在疾病中作用的难度。
因此，本文讲述HSC异质性的特征、检测方法与技术、与疾病发生的关系和在治疗中的应用。
一、HSC异质性1.HSC表型异质性：HSC表型异质性主要表现在其纯化方案的局限性与非特异性。
自20世纪50年代FORD等发现移植的供体骨髓在致死剂量照射的受体上具有重要的造血重建作用起，骨髓HSC的活性和功能开始受到广泛关注。
20世纪80年代，Spangrude等根据细胞表面标志表达，利用荧光激活细胞分选（FACS）技术，首次从小鼠骨髓中富集得到HSC（Thy-1loLin-Sca-l+）。
此后，其他实验室也开始用不同的表面标志组合对HSC的纯化方法进行改良和优化。
Okada等于1992年提出经典的c-Kit+Sca-1+Lin-（KSL）富集HSC的方案，KSL细胞约占全骨髓有核细胞的0.1%。
至此，HSC已可被相对富集。
但通过移植实验发现，在该群体中具有自我更新能力的长周期HSC（LT-HSC）仅占20%，仍是一个非常异质性的群体，其中包括多能祖细胞（multipotent progenitor，MPP）、短周期HSC（ST-HSC）和LT-HSC。
因此，研究人员不断增添一些附加标志以排除分化的祖细胞，降低HSC异质性。
Morrison和Weissman于1994年在KSL的基础上附加Thy1.1阴性表达，该标志在B6背景小鼠品系骨髓HSC上多不表达，即用KSL Thy1.1-（KTSL）组合纯化小鼠HSC。
接着，Krause等提出附加CD34-表达纯化小鼠HSC，即KSL CD34-；2001年Christensen和Weissman又在之前的组合上附加了Flk-2-表达，即KSL Thy1.1loFlk-2-。
人脐带血间充质干细胞的富集与表型鉴定
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小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
造血祖细胞培养实用PPT
双核晚幼红细胞
巨核系病态造血
淋巴样小巨核细胞
鉴别诊断
骨髓增生良好，而红系显著减少或缺乏为主要诊断依据。
与造血微环境缺陷有关。 Ham试验和Coombs试验阴性。
发病机制
3.T细胞介导的骨髓免疫损伤（虫子学说）
表现: Th1细胞、CD8＋T抑制细胞↑ CD25＋T细胞、γδTCR＋T细胞↑ IL－2、IFN－γ 、TNF↑
多数患者免疫抑制治疗有效。
• 问题（单选）： 2. 再生障碍性贫血与下列哪些关系不显著： A．化学因素 B．饮食习惯因素 C．放射因素 D．生物因素
（四）其他检验
1 骨髓铁染色显示细胞内、外铁均增加。 2 中性粒细胞碱性磷酸酶活性增高。 3 造血祖细胞培养:细胞集落明显减少/缺如。 4 免疫功能检查异常。 5 骨髓核素扫描可判断整体造血功能。
三、诊断与鉴别诊断
（一）诊断
1． 全血细胞减少, 网织红细胞绝对值
减少,
淋巴细胞相对增加。
2．
骨髓至少1个部位增 生减低或重度减低 (如增生活跃，须有 巨核细胞明显减少及 淋巴细胞相对增加)， 骨髓小粒非造血细胞 增多(骨髓活检显示 造血组织减少，脂肪 组织增多)。
本病预后良好，多数在去除病因后1～2周内恢复，治疗目的在于帮助患者度过危象期。
主要根据血象、骨髓象和临床表现，一般诊断不难。
鉴别诊断
（二）MDS-RA
1、相同点：①全血细胞↓ ②网织红可↓
2、不同点：①病态造血 ②幼RBC糖原染色（+） ③染色体核型异常
MDS病态造血
Pelger-Hüet畸形
环形中性杆状核粒细胞
试验、蛇毒因子溶血试验、 1、相同点：可全血细胞减少
丙酸睾丸酮 100mg 肌注 qd.
造血细胞分离、集落培养及表型分析
造血细胞分离、集落培养及表型分析所谓造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC，）是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。
它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞,同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。
图1 造血系统和造血干细胞分化图Fig。
1 hematopoietic system and hematopoietic stem cell differentiation.造血干细胞主要存在于骨髓、动员的外周血、脐血中，与骨髓和动员的外周血相比，脐血来源丰富、受病毒污染的几率小、富含造血干细胞且所含的造血干细胞具有更高的增殖潜能，同时脐血中的淋巴细胞幼稚，具有较低的免疫排斥活性，是优良的造血干细胞来源。
造血干/祖细胞鉴别的传统方法还是应用集落分析方法，它可检测粒-巨嗜细胞集落形成单位（colony - forming unit-granulocyte/ macrophage，CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（burst-forming unit-erythroid，BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（colony-forming unit-megakaryocyte，CFU-MK）、红系-粒系-巨嗜系-单核系集落形成单位（multipotent colony-forming units，CFU-GEMM或mixed colony-forming unit，CFU-Mix），等等，它是在半固体培养基上培养14天，然后在显微镜下计数集落。
造血干细胞的表面标志随着个体发育的不同时期不同，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-已经普遍被认为是造血干细胞的标志。
此外，1997年发现一个新的造血干细胞标志是AC133，但具CD34抗原是目前公认的造血干细胞和祖细胞的共同标志。
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造血细胞分离、集落培养及表型分析
所谓造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC，）是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。
它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞,同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。
图1 造血系统和造血干细胞分化图
Fig。
1 hematopoietic system and hematopoietic stem cell differentiation.
造血干细胞主要存在于骨髓、动员的外周血、脐血中，与骨髓和动员的外周血相比，脐血来源丰富、受病毒污染的几率小、富含造血干细胞且所含的造血干细胞具有更高的增殖潜能，同时脐血中的淋巴细胞幼稚，具有较低的免疫排斥活性，是优良的造血干细胞来源。
造血干/祖细胞鉴别的传统方法还是应用集落分析方法，它可检测粒-巨嗜细胞集落形成单位（colony - forming unit-granulocyte/ macrophage，CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（burst-forming unit-erythroid，BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（colony-forming unit-megakaryocyte，CFU-MK）、红系-粒系-巨嗜系-单核系集落形成单位（multipotent colony-forming units，CFU-GEMM或mixed colony-forming unit，CFU-Mix），等等，它是在半固体培养基上培养14天，然后在显微镜下计数集落。
造血干细胞的表面标志随着个体发育的不同时期不同，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-已经普遍被认为是造血干细胞的标志。
此外，1997年发现一个新的造血干细胞标志是AC133，但具CD34抗原是目前公认的造血干细胞和祖细胞的共同标志。
1、用流式细胞仪分析细胞表型
待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光
染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进
入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，
细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形
成细胞液柱。
这种同轴流动的设计，使得样品流
和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流
的状态。
鞘液和样品流组成一个圆形的流束，一起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来，进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交。
该区称为测量区。
利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。
细胞发出的荧光信号和散射光信号，同时被荧光光电倍增管接收，被积分放大反转换为电子信号输入电子信息接收器、通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞的定量分析。
2、单个核细胞的分离
采用密度梯度原理，利用血液中各类细胞的密度不同进行分离。
3、CD34+细胞分选
利用抗原抗体反应的原理，样品中的CD34+细胞可与偶联有CD34抗原的磁珠反应，将MiniMACS 免疫磁性吸附柱置于磁场中，未与磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34＋细胞保留在吸附柱中，将吸附柱移出磁场后用MACS缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的CD34＋细胞。
4、集落检测
利用造血干细胞的特性，在特定的条件下，造血干细胞可向某一系的细胞分化，从而在半固体培养基上形成一个个的克隆，即集落，一个集落代表一个造血干/祖细胞。
脐血
脐血由上海国际和平妇婴保健院提供。
供者要求身体健康，发育良好的非高龄产妇。
无遗传病史，无病毒病史，无血液系统疾病，无寄生虫病及地方病。
HIV、肝炎、梅毒等检测均为阴性。
健康产妇分娩以后，立即用血袋无菌采取新生儿脐带血，血袋内装有无菌ACD－B25mL抗凝剂(每100mLACD－B 含有：一水合枸橼酸0.48g，二水合枸橼酸钠1.32g，一水合葡萄糖1.47g)，相当于100mL的血液抗凝剂，每次实际采集脐带血50-100mL。
采集后脐带血置于4℃冰箱内保存，一般在6小时内取回分离。
培养基与细胞因子
培养基为IMDM培养基，添加20%的胎牛血清。
细胞因子均为人重组蛋白，干细胞因子（SCF）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-3（IL-3）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、红细胞生成素（EPO）、
三、实验方法
单个核细胞的Ficoll密度梯度离心分离
将脐血用IMDM培养基以1：2稀释，在50mL离心管中加入15mL Ficoll，之后小心加入30mL稀释的脐血平铺在Ficoll上，之后置于吊篮式离心机中在400g下密度梯度离心30min，吸取中间的白层，用IMDM培养基洗涤细胞，除去淋巴细胞分离液和血小板。
集落分析方法
CFU－GM的检测体系为IMDM培养基，添加20％胎牛血清，4mmol/mL 谷氨酰胺，含0.9％甲基纤维素，以及人重组造血生长因子SCF、IL-3、IL-6，GM－CSF、G－CSF,其浓度分别为50 ng/mL、20 ng/mL、20 ng/mL、20 ng/mL 和20ng/mL。
半固体培养在24孔板中进行，每孔加半固体培养基500 L，加入2.5×104个单个核细胞。
在37℃、5％CO2、湿度饱和的二氧化碳培养箱中培养14天后在显微镜下进行集落计数，超过50个细胞的细胞簇为一个集落。
流式细胞分析
取1.0×106细胞用PBS洗两遍，重悬后分配到1.5mL管中离心，加PE偶联的小鼠抗人CD34单抗和FITC偶联的小鼠抗人CD45单抗各10 L，4℃孵育30分钟。
PBS洗两遍，离心后，每管加1mL FACS保存液。
同型对照以PE 偶联的小鼠抗真菌毒素标记。
标记细胞用流式细胞仪（BD公司）分析，结果用Lysis II软件处理，以CD45设门进行分析。
脐血CD34＋细胞的分离纯化
将1.0×108细胞悬浮于0.3mlMACS缓冲液中，加50μl偶联于磁珠的小鼠抗人CD34+抗体，4℃孵育30分钟，采用MiniMACS 免疫磁性吸附柱分离装置洗涤吸附柱中进行分离，未与磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34＋细胞保留在吸附柱中，将吸附柱移出磁场后用MACS缓冲液冲洗吸附柱即获得纯化的CD34＋细胞。
四、实验结果
1、单个核细胞的分离
2、造血干/祖细胞集落计数
3、脐血中CD34+细胞的数量
4、脐血中分离得到的CD34+细胞的数量
五、讨论
1、从一袋血获得的CD34+细胞数与集落形成数之间有和关联？
2、用MiniMACS 免疫磁性吸附柱分离法获得的CD34+细胞数，与流式细胞分析的结果是否一致？若不一致，原因何在？
动物细胞培养、计数、冷冻和复苏
I. 动物细胞的培养和计数
一、实验目的
由动物细胞表达和合成的蛋白质除了具有正确的氨基酸序列之外，在加工过程中还能以正确的方式进行折叠和修饰，且大多能以天然形式分泌到培养基中，从而确保了所生产的蛋白质具有与天然产物一致的生物活性、免疫原性和体内寿命，这些特点使得动物细胞成为工业化生产诊断和治疗用生物产品的理想宿主，如各类重组蛋白质和单克隆抗体等。
另外，目前方兴未艾的组织工程、干细胞工程等也是和细胞培养技术密切相关的，因此，可以说细胞培养技术是细胞工程、组织工程等研究领域的基础。
本实验的目的是让学生学习和了解动物细胞培养的基本操作，以及相关的细胞培养前准备工作、细胞培养的环境条件和其他有关注意事项；用血球计数板对培养瓶中的细胞进行计数以及用台盼蓝计细胞的存活率。
二、基本原理
动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体的细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术，是动物细胞工程的基础。
体外培养可分为原代培养和传代培养，原代培养是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，原代细胞通常只能培养10－50代左右即退化死亡；由原代细胞通过变异、分化等手段筛选出来具有无限次代培养能力的细胞群称为细胞系，这类细胞的培养称为传代培养。
体外培养的细胞根据其生长方式，主要可分为贴附型细胞和非贴附型细胞两类，贴附型细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长，非贴附型细胞可在培养液中悬浮生长，因而也叫悬浮型细胞。
动物细胞培养与微生物培养有很大不同，这主要是因为动物细胞无细胞壁，。