胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇
生化实验报告本科
一、实验目的1. 学习和掌握血清中总胆固醇（TC）测定的原理和方法。
2. 培养实验操作技能，提高实验数据的分析能力。
二、实验原理总胆固醇（TC）是指血液中所有脂蛋白所含胆固醇的总和。
测定血清中TC的含量对于评估个体的血脂水平、预防心血管疾病具有重要意义。
本实验采用酶法测定TC，即通过胆固醇氧化酶（Cholesterol Oxidase, COX）将胆固醇氧化为胆汁酸，同时生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶（Peroxidase, POD）的作用下，将邻苯二胺（O-phenylenediamine, OPD）氧化成蓝色产物，其颜色深浅与TC含量成正比。
三、实验材料与仪器1. 仪器：酶标仪、恒温水浴锅、微量移液器、离心机等。
2. 试剂：血清样本、胆固醇氧化酶（Cholesterol Oxidase, COX）试剂、过氧化物酶（Peroxidase, POD）试剂、邻苯二胺（O-phenylenediamine, OPD）试剂、蒸馏水、标准胆固醇溶液等。
3. 试剂规格：胆固醇氧化酶（Cholesterol Oxidase, COX）试剂、过氧化物酶（Peroxidase, POD）试剂、邻苯二胺（O-phenylenediamine, OPD）试剂均按照说明书配制。
四、实验步骤1. 标准曲线绘制（1）取6个试管，编号为1-6。
（2）分别加入标准胆固醇溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μl，然后加入蒸馏水至100μl。
（3）在酶标仪上，设置波长为505nm，读取各管吸光度（A）值。
（4）以胆固醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定（1）取6个试管，编号为1-6。
（2）分别加入血清样本0.5μl，然后加入蒸馏水至100μl。
（3）按照标准曲线绘制步骤，测定各管吸光度（A）值。
（4）根据标准曲线，计算血清中TC含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制标准曲线如下（以胆固醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标）：胆固醇浓度（μmol/L） | 吸光度（A）------------------------|-----------0 | 0.1000.5 | 0.1501.0 | 0.2001.5 | 0.2502.0 | 0.3002.5 | 0.3502. 样品测定血清中TC含量为2.3μmol/L。
酶法检测血清总胆固醇
酶法检测血清总胆固醇酶法检测血清总胆固醇是目前公认为最适于作血清总胆固醇测定的常规方法 [1] ，在各大中小医院实验室测定TC大多采用酶法，既可于作终点法手工操作，分光光度计比色测定，也可于半自动、全自动生化分析仪检测。
它具有试剂单一、试验稳定、使用方便等优点。
现报告如下。
1 原理血清中的胆固醇酯(CE)被胆固醇酯水解酶(CEH)水解成游离胆固醇(Cho1)，后者被胆固醇氧化酶(CHOD)氧化成△4-胆甾烯酮并产生过氧化氢，再经过氧化物酶(POD)催化4-氨基安替比林与酚(三者合称PAP)，生成红色醌亚胺色素(Trind er反应)。
醌亚胺的最大吸收在500 nm左右，吸光度与标本中TC含量成正比。
2 试剂(1)酶试剂：组成因不同商品试剂盒而异，酶用量也因酶制品质量而定。
(2)chol标准参考血清：本法TＣ测定中以准确定值的参考血清为标准，参考血清的Chol浓度最好有高、中、低3种，中浓度血清的Chol含量应在3.8～5.2mmol／L。
(3)试剂与参考血清的稳定性：未开瓶的试剂4℃存放至少稳定1年。
复溶后的酶试剂在2～8℃至少稳定1周，15～25℃3天，如在此期内出现肉眼可辨的粉红色为不合格。
标签上注明出品日期及有效期。
液态的Chol参考血清(含有不抑制CHE、CHOD与POD的防腐剂)，-20℃保存至少稳定2年，冻干品更稳定。
标签上注明出品日期及有效期。
3 操作(1)标本为及时分离的空腹血清、肝素或ED-TA抗凝血浆。
(2)终点法测定时标本管与标准管中分别加入标本与定值血清各10μl，酶试剂1ml，混匀后在37℃放置5分钟，或20-25℃放置10分钟后用光度计比色，以试剂空白调零，波长500nm或520nm，颜色稳定至少60分钟。
4 计算TC(mmol／L)=A测定／A标准×定标血清TC浓度(mmol/L)。
速率法测定根据仪器性能及所用试剂的反应速度设计操作程序，一般要求试剂中酶用量较高。
实验七__胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇
生物化学与分子生物学设计实验（胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟法测定血清尿素）小组成员：班级：麻醉11-2班日期：2012年12月19胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟法测定血清尿素实验目的1、掌握酶法测定总胆固醇的原理和方法。
2、学习用比色法测定血清尿素。
3、巩固有关胆固醇和尿素的知识。
4、进一步熟练UV2100型分光光度计的重点、难点：重点：1、氧化酶法测定总胆固醇的原理2、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项难点：氧化酶法测定总胆固醇的原理一、实验原理（一）氧化酶法测定血清总胆固醇血清总胆固醇(TC)包括：游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)两部分。
本实验是胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶相偶联发生的偶联反应。
第一步：血清胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸(FFA) 。
第二步：胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和H2O2。
第三步：H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC含量成正比。
（二）二乙酰一肟法测定血清尿素二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。
因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。
二、操作步骤（一）氧化酶法测定血清总胆固醇终点法检测TC，取试管3支按下表依次加样。
酶法测定TC操作步骤加入物(μl)空白管标准管测定管血清－－20标准液或定值血清－20－蒸馏水20－－酶试剂 1 000 1 000 1 000混匀后，37℃保温10 min，每管加3ml水混匀，用分光光度计比色，于500 nm波长处以空白管调零，读出各管吸光度。
（二）二乙酰一肟法测定血清尿素取试管3支，按下表依次加样。
二乙酰一肟法操作步骤加入物(ml)空白管标准管测定管血清－－尿素标准应用液－－蒸馏水－－二乙酰一肟溶液酸性试剂混匀，置沸水浴加热12min，取出置冷水中冷却5min，以空白管调零，在540nm处读取各管吸光度。
血清总胆固醇的测定(胆固醇氧化酶法)
化，显色与比色五个阶段。目前临床上常用的是
胆固醇氧化酶法
化学法的种类很多，由于显色反应的特异性不同，其结果有一定 的差异。
Abell-Kendall(L-B反应)法
（化
公学
认测
）定
显色稳定
法
三氯化铁-硫酸反应法（Zak法） 操作简便
灵敏度约5倍于L-B反应
法
特异性差，干扰因素比L-B法多 。Zak法更适合于科研使用 。胆固醇酯与游离胆固醇显 色程度比较接近
（mmol/l）
• 参考值 • 3.0-5.20mmol/l。危险阈值：5.20-6.20mmol/l 。
高胆固醇血症：>=6.20mmol/l
思考题
• （1）血红蛋白，胆红素，维生素c对本实验结果
有干扰，原因是什么？
• （2）试查文献说明胆固醇的定量测定还有哪些方
法？每种方法的原理是什么？
• （3）基础液配置中胆酸钠的作用是什么?
表7-7血清总胆固醇的测定
项目
血清/μL
胆固醇标准 液/μL 蒸馏水/μL
酶试剂/μL
测定管
50
—
— 1.50
标准管 — 50
— 1.5水浴中保温15分钟，用空白
管调零，在500nm波长处测吸光度。
• 计算公式： 血清总胆固醇=A测定/A标准 x5.17
临床意义动脉粥样硬化原发性高血脂症贫血败血症甲状腺功能亢进实验目的血清中总胆固醇游离胆固醇游离脂肪酸低密度脂蛋白高密度脂蛋白极低密度脂蛋白乳糜微粒测定方法化学法
血清总胆固醇的测定 （胆固醇氧化酶法）
主讲人：刘杰
同组人（刘杰、杨宇光、陈琪、刘婷婷）
我们为什么要做这个实验呢？
• 化验介绍：血清胆固醇是血脂的成分之一，
血胆固醇实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本次实验旨在通过血液检测，了解受试者的血胆固醇水平，分析其胆固醇组成，并探讨血胆固醇水平与个体健康状况之间的关系。
二、实验原理胆固醇是人体内一种重要的脂质，分为高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）两种。
HDL-C被称作“好胆固醇”，对心血管有保护作用；而LDL-C被称作“坏胆固醇”，长期偏高会增加心血管疾病的风险。
本次实验采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定受试者的血胆固醇水平。
三、实验材料1. 试剂：胆固醇测定试剂盒（ELISA法）、标准品、酶联反应板、洗涤液、底物、终止液、显色剂等。
2. 仪器：酶标仪、移液器、微量加样器、振荡器等。
3. 样品：受试者空腹静脉血。
四、实验方法1. 样品处理：将受试者空腹静脉血采集后，按照试剂盒说明书要求，分离血清。
2. 标准曲线绘制：将标准品按照试剂盒说明书要求，依次加入酶联反应板孔中，加入底物，避光反应一定时间后，加入终止液，在酶标仪上测定吸光度（OD值），以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 样品测定：将受试者血清按照试剂盒说明书要求，依次加入酶联反应板孔中，加入底物，避光反应一定时间后，加入终止液，在酶标仪上测定OD值。
4. 结果计算：根据标准曲线，计算受试者的血胆固醇水平。
五、实验结果1. 标准曲线：以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为：Y=0.065X-0.013，相关系数R²=0.998。
2. 受试者血胆固醇水平：受试者A的血胆固醇水平为5.2mmol/L，其中HDL-C为1.5mmol/L，LDL-C为3.7mmol/L；受试者B的血胆固醇水平为6.8mmol/L，其中HDL-C为1.8mmol/L，LDL-C为5.0mmol/L。
六、分析与讨论1. 实验结果显示，受试者A的血胆固醇水平为5.2mmol/L，属于正常范围；受试者B的血胆固醇水平为6.8mmol/L，属于偏高范围。
胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇
胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇（标准管法）实验目的：1.了解自动生化分析仪的工作原理2.熟悉血清总胆固醇相关生化的检测项目及检测方法3.掌握血清总胆固醇相关生化检测项目的临床意义。
实验原理：胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇:血清中的胆固醇由游离胆固醇及胆固醇酯构成，胆固醇酯在胆固醇酯酶的作用下水解为胆固醇，再与胆固醇氧化酶作用产生△4-胆甾烯酮及H202;后者在过氧化物酶的作用下，与苯酚及4-氨基安替比林作用生成红色化合物醌亚胺。
测定该红色化合物在500nm波长的吸光度，可以计算出血清总胆固醇含量。
实验操作：1.将准备好的酶工作液（胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、苯酚、4-氨基安替比林）加入空白管、浓度标准管、测定管各1.5ml，再向标准管加20μl胆固醇标准液（5.18mmol/L），再向测定管加入20μl血清。
2.将三支试管放入水浴锅中，37℃保温20分钟3.调节分光光度计波长500nm,透光度T至100%，将空白管试液对光的吸收调节为0，再用空白管调“零”点测定其他各管的吸光度。
实验结果:分光光度计测得标准管吸光度和测定管吸光度，根据朗伯-比尔定律,得到血清样品总胆固醇值=（测定管吸光度/标准管吸光度）x5.18分析讨论：为什么用酶酚混合液作为空白管溶液？酶酚混合液作为空白试剂，调节分光光度计透光度T至100%，可将酶酚混合液对光的吸收调节为0，从而消除对葡萄糖反应产物吸光度测定的影响。
思考题：1.血清甘油三酯升高有和临床意义？血脂代谢紊乱对机体有何危害？血清甘油三酯升高可能代表着各种疾病的发生：如原发性继发性高脂蛋白血症、动脉粥样硬化、糖尿病、肾病、脂肪肝等。
血脂代谢紊乱对机体的危害：血脂代谢紊乱的影响分两种：1）高胆固醇血症引起的危害：主要是动脉粥样硬化，包括大动脉、中动脉、小动脉动脉硬化。
动脉斑块形成主要表现在心、脑、肾等位置，如果动脉硬化斑块较重或者不稳定，发生在心脏可出现急性心肌梗死；在脑血管会出现急性脑血栓，即急性脑梗死，以及肾脏出现急性肾梗死；在外周血管，如腿部可引起坏疽；2）高甘油三酯血症引起的危害：在暴饮暴食的情况下，高甘油三酯可以诱发急性胰腺炎。
血清总胆固醇测定实验报告
血清总胆固醇测定实验报告背景介绍：总胆固醇（TC）是指血浆中所有脂蛋白的胆固醇总和，包括低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）。
总胆固醇水平的高低与心血管疾病的发生密切相关，因此对其进行准确测定具有重要的临床意义。
实验目的：通过本实验，掌握血清总胆固醇的测定方法，了解其在临床诊断中的应用。
实验原理：本实验采用酶法测定血清总胆固醇，其原理为将胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶加入样本中，将胆固醇和脂蛋白水解为游离胆固醇和过氧化物，再由过氧化物与酚类物质发生反应，生成有色产物，最后通过比色计测定其吸光度，从而计算出总胆固醇的含量。
实验步骤：1. 取血清标本，离心分离血清。
2. 用标准吸光度计预热，设置波长为500nm。
3. 取适量样本和对照品，加入试剂A和试剂B，混匀后在37°C恒温水浴中反应15分钟。
4. 加入试剂C混匀，再在37°C恒温水浴中反应5分钟。
5. 用比色计在波长为500nm处对样本和对照品吸光度，计算总胆固醇含量。
实验结果：样本A吸光度为0.6，对照品吸光度为0.3，根据标准曲线计算出样本A的总胆固醇含量为5.0mmol/L。
样本B吸光度为0.7，对照品吸光度为0.4，计算出样本B的总胆固醇含量为6.0mmol/L。
实验结论：根据上述实验结果，样本A的总胆固醇含量正常，而样本B的总胆固醇含量超标，提示可能存在心血管疾病的风险。
因此，血清总胆固醇的测定对于心血管疾病的筛查和诊断具有重要意义，有助于及时采取预防和治疗措施。
总结：通过本次实验，我们掌握了血清总胆固醇的测定方法及其临床意义，了解了其在心血管疾病中的重要性。
在临床实践中，我们应该重视血清总胆固醇的监测，及时发现异常情况并采取相应的干预措施，以保障患者的健康。
血清总胆固醇(TC)测定操作规程
血清总胆固醇(TC)测定操作规程A1．2 原理血清中的胆固醇酯(CE)被胆固醇酯水解酶(CEH)水解成游离胆固醇(Chol)，后者被胆固醇氧化酶(CHOD)氧化成△4—胆甾烯酮，并产生过氧化氢，再经过氧化物酶(POD)催化4—氨基安替比林与酚(三者合称PAP)，生成红色醌亚胺色素(Trinder反应)。
醌亚胺的最大吸收在500nm 左右，吸光度与标本中总胆固醇呈正比。
反应式如下：胆固醇酯+H2O CEH 胆固醇+游离脂肪酸胆固醇+02 CHOD △4-胆甾烯酮十H2022H202+4－氨基安替比林+酚POD 昆亚胺+4H2OA1．3．1 受检者(体检对象或病人)的准备：除总胆固醇不一定用空腹血外，测定甘油三酯、脂蛋白与载脂蛋白的病人必须空腹12h，不饮酒24h后采集血样。
对于体检对象抽血前应有2周时间保持平时的饮食习惯，近期内体重稳定，无急性病、外伤、手术等意外情况。
妊娠后期各项血脂都会增高，应在产后或终止哺乳后3个月检验才能反映其基本血脂水平。
注意有无应用影响血脂的药物，如降血脂药、避孕药、噻嗪类利尿剂、β受体阻滞剂、免疫抑制剂、某些降压剂、降糖药、胰岛素及其他激素制剂等，检验以前应根据所用药物的特性停止用药数天或数周，否则应记录用药情况。
对体检对象及做前瞻性观察者，还应注意采血的季节，因为血脂水平有季节性变动，为了前后比较应在每年同一季节检验。
应嘱体检对象在抽血前24h内不作剧烈运动。
A1．3．2 静脉采血：除非是卧床的病人，一般在采血时取坐位。
体位影响水分在血管内外的分布，因此影响血脂水平。
例如站立5 min 可使血脂浓度提高5％，15 min提高16％，故在采血前至少应***5min。
一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1 min，穿刺成功后立即松开止血带。
静脉阻滞5min可使甘油三酯增高10％～15％。
A1. 3．3 抗凝剂：我国多用血清作血脂检验。
如用血浆，多主张用EDTANa2(1mg／mL)抗凝。
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胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇
【原理】
血清中总胆固醇(total cholesterol ，TC)包括游离胆固醇(free cholesterol ，FC)和胆固醇酯(cholesterol ester ，CE)两部分。
血清中胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸(FFA)，胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和过氧化氢，H 2O 2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC 含量成正比。
【试剂】
1．胆固醇液体酶试剂组成(具体含量见相关文献)
GOOD's 缓冲液(pH6.7) 50mmol/L 胆固醇酯酶 ≥200U/L 胆固醇氧化酶 ≥100U/L 过氧化物酶 ≥3 000U/L 4-AAP 0.3mmol/L 苯酚
5mmol/L
2．胆固醇标准溶液5.17 mmol/L (200 mg/dl) 精确称取胆固醇200 mg ，用异丙醇配成100 ml 溶液，分装后，4℃保存，临用取出。
也可用定值的参考血清作标准。
【操作步骤】 终点法检测TC 按下表依次加样。
酶法测定TC 操作步骤
项目 测定管 标准管 空白管 血清(μl) 50 － － 标准液/定值血清(μl)
－ 50 － 蒸馏水(μl) － － 50 酶试剂(μl)
1.50
1.50
1.50
混匀后，37℃保温5 min ，用分光光度计比色，于500 nm 波长处以空白管调零，读出各管吸光度。
【计算】
血清TC (mmol/L)＝
标准管吸光度
测定管吸光度
×胆固醇标准液浓度
【参考范围】血清参考值：3.0～5.20 mmol/L；危险阈值：5.20～6.20 mmol/L；高胆固醇血症：≥6.20 mmol/L。
【临床意义】
1．TC增高常见于动脉粥样硬化、原发性高脂血症(如家族性高胆固醇血症、家族性ApoB缺陷症、多源性高胆固醇血症、混合性高脂蛋白血症等)、糖尿病、肾病综合征、总胆管阻塞、甲状腺功能减退、肥大性骨关节炎、老年性白内障和牛皮癣。
2．TC降低常见于低脂蛋白血症、贫血、败血症、甲状腺功能亢进、肝脏疾病、严重感染、营养不良、肠道吸收不良和药物治疗过程中的溶血性黄疸及慢性消耗性疾病，如癌症晚期等。
【注意事项】
1．试剂中酶的质量影响测定结果。
2．若需检测游离胆固醇浓度，将酶试剂成分中去掉胆固醇酯酶即可。
3．检测标本可为血清或者血浆(以肝素或EDTAK2抗凝)。
【评价】本方法线性范围为≤19.38 mmol/L (750 mg/d1)。
本方法特异性好和灵敏度高，既可用于手工操作，也可自动化分析；既可作终点法检测，也可作速率法检测。
在终点法中血红蛋白高于2 g/L时引起正干扰；胆红素高于0.1 g/L时有明显负干扰；血中维生素C与甲基多巴浓度高于治疗水平时，会使结果降低。
但是在速率法中上述干扰物质影响较小。
高TG血症对本法无明显影响。
检测TC的血清(浆)标本密闭保存时，在4℃可稳定1周，－20℃可稳定半年以上。