实验七__胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇
血清胆固醇测定实验报告
一、实验目的1. 了解血清胆固醇测定的原理和意义。
2. 掌握血清胆固醇测定的方法。
3. 熟悉实验操作步骤和注意事项。
二、实验原理血清胆固醇是指血液中所有脂蛋白所含胆固醇之和，包括游离胆固醇和胆固醇酯。
胆固醇是人体内重要的生物活性物质，参与细胞膜的构成、激素的合成、维生素D 的生成等生理过程。
血清胆固醇水平与心血管疾病、动脉粥样硬化等疾病的发生密切相关。
血清胆固醇测定通常采用酶法，其中胆固醇氧化酶法是临床上最常用的方法。
该方法利用胆固醇氧化酶将胆固醇氧化成胆烷4烯3酮，再通过过氧化氢、4-氨基安替比林和酚的作用生成红色醌亚胺，颜色的深浅与标本中胆固醇含量呈正比。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：血清样本、胆固醇标准溶液、胆固醇氧化酶试剂、过氧化氢、4-氨基安替比林、酚、蒸馏水等。
2. 仪器：721型分光光度计、移液器、试管、试管架、恒温水浴箱等。
四、实验步骤1. 标准曲线的绘制（1）取6个试管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL胆固醇标准溶液。
（2）向各试管中加入1mL胆固醇氧化酶试剂，混匀后置于37℃恒温水浴箱中保温15min。
（3）取出试管，加入0.1mL过氧化氢、0.1mL 4-氨基安替比林和0.1mL酚，混匀后静置5min。
（4）以蒸馏水调零，于510nm波长处测定吸光度，以胆固醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
2. 样本测定（1）取3个试管，分别加入0.5mL血清样本、0.5mL胆固醇氧化酶试剂，混匀后置于37℃恒温水浴箱中保温15min。
（2）取出试管，加入0.1mL过氧化氢、0.1mL 4-氨基安替比林和0.1mL酚，混匀后静置5min。
（3）以蒸馏水调零，于510nm波长处测定吸光度。
（4）根据标准曲线计算血清胆固醇浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制以胆固醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，结果如下：胆固醇浓度（mg/dL） | 吸光度---------------------|--------0 | 0.0000.5 | 0.1201.0 | 0.2401.5 | 0.3602.0 | 0.4802.5 | 0.6002. 样本测定根据标准曲线计算血清胆固醇浓度，结果如下：血清样本1：5.20mg/dL血清样本2：4.80mg/dL血清样本3：6.00mg/dL六、实验结论本次实验采用胆固醇氧化酶法成功测定了血清胆固醇浓度，结果与正常参考值相符。
血清总胆固醇测定实验报告
血清总胆固醇测定实验报告血清总胆固醇测定实验报告胆固醇是一种脂类物质，它在人体中起着重要的生理作用。
然而，当胆固醇水平过高时，就会增加心血管疾病的风险。
因此，了解自己的胆固醇水平对于保持健康至关重要。
本实验旨在测定血清中的总胆固醇水平，并通过结果分析对参与者的健康状况进行评估。
实验材料和方法：1. 实验材料：- 血清样本- 高精度血清胆固醇测定试剂盒- 试剂盒使用说明书- 分光光度计- 定量移液器和移液枪- 试管和离心管2. 实验步骤：a. 收集参与者的血液样本，并将其离心分离血清。
b. 根据试剂盒使用说明书，准备所需试剂和标准品。
c. 将标准品和血清样本分别加入试管中，并按照说明书中的步骤进行试剂添加和混合。
d. 使用分光光度计测量各试管中的吸光度，并记录结果。
e. 根据标准曲线计算出各样本中的总胆固醇浓度。
实验结果：通过实验测定，我们得到了参与者血清中的总胆固醇浓度。
根据标准曲线和试剂盒提供的计算公式，我们可以将各样本的吸光度值转换为胆固醇浓度。
根据实验数据，我们将参与者的胆固醇水平分为以下几个等级：1. 理想范围：参与者的胆固醇水平在正常范围内，表明其心血管健康状况良好。
他们应继续保持健康的生活方式，包括均衡的饮食、适当的运动和定期体检。
2. 边缘范围：参与者的胆固醇水平略高于正常范围，但尚未达到危险水平。
他们应该注意饮食结构，减少高胆固醇食物的摄入，并增加运动量。
此外，定期监测胆固醇水平也是必要的。
3. 高风险范围：参与者的胆固醇水平明显升高，表明他们存在心血管疾病的风险。
他们应立即采取行动，改变生活方式，如低脂饮食、戒烟、减少酒精摄入等。
此外，医生可能会建议他们接受进一步的检查和治疗。
实验讨论：通过本实验，我们不仅可以测定参与者血清中的总胆固醇水平，还可以根据结果评估其心血管健康状况。
然而，需要注意的是，本实验只是初步评估，并不能替代专业医生的诊断和建议。
对于高风险范围的参与者，他们应该咨询医生，制定个性化的治疗方案。
血清总胆固醇的测定实验报告
血清总胆固醇的测定实验报告实验报告
实验目的：
测定血清总胆固醇的浓度。
实验原理：
血清总胆固醇（total cholesterol, TC）可被酶促反应分析法（enzymatic reaction method）测定。
在反应液中加入胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，使血清中的TC被水解成自由胆固醇和酯化胆固醇，同时释放出的氢过氧化物（H2O2）与4-氨基安替比林（4-AAP）和3,5-二溴-4-硝基苯磺酸（DHNS）在高温下作用形成紫色化合物，其吸光度与TC的浓度成正比。
实验原料：
1. TC标准品（10.0 mmol/L）
2. 4-AAP（0.5 mmol/L）
3. DHNS（0.65 mmol/L）
4. 胆固醇酯酶
5. 胆固醇氧化酶
6. 磷酸盐缓冲液（pH
7.4）
实验步骤：
1. 取血清标本1.0 mL，并用离心机离心10分钟，除去沉淀后得到澄清的血清。
2. 取1.0 mL澄清的血清加入10 μL胆固醇酯酶，放置于37℃恒温槽中加水浴反应30分钟。
3. 倒入10 μL胆固醇氧化酶，再加入2.0 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.4），混匀。
4. 加入15 μL4-AAP和15 μLDHNS，混匀后在37℃恒温槽中加水浴反应10分钟。
5. 记录吸光度（A）值，以TC标准品作为对照，计算出血清中TC的浓度。
实验结果：
本实验测定血清总胆固醇的浓度为X mmol/L。
实验结论：
采用酶促反应分析法测定血清总胆固醇的浓度，结果可靠，该方法操作简便，对临床诊断有参考意义。
血清总胆固醇测定标准操作规程
血清总胆固醇测定标准操作规程1.检验原理：（氧化酶法）血清中总胆固醇（TC ）包括游离胆固醇（FC ）和胆固醇酯（CE ）两部分。
血清中胆固醇可被脂蛋白酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸（FFA ），胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成胆甾烯酮和过氧化氢，过氧化氢在4-氨基安替比林和对羟基苯甲酸钠存在时，晶过氧化物酶（POD ）催化，反应生成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC 含量成正比。
胆固醇酯+22O H −−−→−胆固醇酯酶胆固醇+脂肪酸 胆固醇+2O −−−−→−胆固醇氧化酶胆甾烯酮+22O H 222O H +4-AA+对羟基苯甲酸钠−−→−POD红色醌类物质+422O H 2.试剂主要组成成分3.样本要求：新鲜无溶血血清。
在22～25℃保存8小时，2～8℃保48小时，-20℃可保存1年。
样本应避免反复冻融！4.检验方法；仪器法（详见DF-603/DI-600标准操作规程） 5参考范围：6.检验结果的解释：6.1样本含量超出线性范围时，建议用0.9%（W/V）的氯化钠溶液稀释样本。
6.2.单位换算：mg/dl=mmol/L×38.77.检验方法的局限性7.1结果的准确性依赖于仪器的校正和测定温度、时间的控制。
7.2若试剂浑浊，或以水空白在500nm处吸光度大于0.080时不能使用。
8.试剂性能指标8.1试剂外观：无色透明或淡黄色液体，无悬浮物及沉淀。
8.2装量：不低于标识值。
8.3空白吸光度：在500nm处，光径1cm时，空白吸光度A≤0.0808.4线性区间：试剂的线性区间为[0.5-20.0]mmol/L，在此线性区间内：a）线性相关系数r应不小于0.9900；b)[2.0-20.0]mmol/L区间内，线性相对偏差不超过±10%。
8.5准确度：使用具有溯源性的标准品进行测定，实测值与标识值的相对偏差应在±10%内。
8.6分析灵敏度：在500nm处，光径1cm时，测量已知浓度样品换算成1mmol/L 的总胆固醇时，吸光度变化△Ammol/L≥0.0028.7批内精密度：CV≤4.0%8.8批间差：R≤6.0%8.9稳定性：（2-8）℃下，原包装存放的试剂有效期为12个月.取到期后1个月的试剂进行测试，应满足1-8.7的要求。
总胆固醇实验报告
实验名称：血清总胆固醇测定实验目的：通过本实验，掌握血清总胆固醇的测定方法，了解血清总胆固醇在临床诊断和预防治疗中的重要性。
实验原理：血清总胆固醇（Total Cholesterol，TC）是血液中所有胆固醇的总和，包括游离胆固醇和胆固醇酯。
血清总胆固醇的测定方法主要有酶法、比色法、沉淀法等。
本实验采用酶法测定血清总胆固醇，其原理是利用胆固醇酯酶（Cholesterol Esterase）将胆固醇酯水解为游离胆固醇，然后利用胆固醇氧化酶（Cholesterol Oxidase）将游离胆固醇氧化为胆汁酸，最后在碱性条件下与磷钼酸反应生成磷钼蓝，通过比色法测定其吸光度，从而计算出血清总胆固醇的浓度。
实验材料：1. 血清样品：取自健康志愿者，经离心分离后获得。
2. 胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、磷酸盐缓冲液、磷钼酸、抗坏血酸、硫酸铜、邻苯二甲酸氢钾、氯仿、无水乙醇等试剂。
3. 仪器：酶标仪、移液器、恒温水浴锅、离心机等。
实验步骤：1. 样品处理：取血清样品1.0ml，加入氯仿和无水乙醇（1:2，V/V）混合液5.0ml，涡旋混合，离心10分钟，取上清液待测。
2. 标准曲线绘制：将胆固醇标准品配制成一系列浓度梯度的标准溶液，分别加入胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、磷酸盐缓冲液、磷钼酸等试剂，按照实验步骤进行操作，测定吸光度。
以胆固醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 样品测定：取处理后的血清样品，按照标准曲线绘制步骤进行操作，测定吸光度。
根据标准曲线，计算样品中血清总胆固醇的浓度。
实验结果：1. 标准曲线绘制：以胆固醇浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
结果显示，胆固醇浓度在0.5-10.0mg/dl范围内，吸光度与胆固醇浓度呈线性关系。
2. 样品测定：根据标准曲线，计算样品中血清总胆固醇的浓度为X mg/dl。
实验讨论：1. 血清总胆固醇是人体内重要的脂质成分，其浓度异常与心血管疾病、动脉粥样硬化等疾病密切相关。
酶法检测血清总胆固醇
酶法检测血清总胆固醇酶法检测血清总胆固醇是目前公认为最适于作血清总胆固醇测定的常规方法 [1] ，在各大中小医院实验室测定TC大多采用酶法，既可于作终点法手工操作，分光光度计比色测定，也可于半自动、全自动生化分析仪检测。
它具有试剂单一、试验稳定、使用方便等优点。
现报告如下。
1 原理血清中的胆固醇酯(CE)被胆固醇酯水解酶(CEH)水解成游离胆固醇(Cho1)，后者被胆固醇氧化酶(CHOD)氧化成△4-胆甾烯酮并产生过氧化氢，再经过氧化物酶(POD)催化4-氨基安替比林与酚(三者合称PAP)，生成红色醌亚胺色素(Trind er反应)。
醌亚胺的最大吸收在500 nm左右，吸光度与标本中TC含量成正比。
2 试剂(1)酶试剂：组成因不同商品试剂盒而异，酶用量也因酶制品质量而定。
(2)chol标准参考血清：本法TＣ测定中以准确定值的参考血清为标准，参考血清的Chol浓度最好有高、中、低3种，中浓度血清的Chol含量应在3.8～5.2mmol／L。
(3)试剂与参考血清的稳定性：未开瓶的试剂4℃存放至少稳定1年。
复溶后的酶试剂在2～8℃至少稳定1周，15～25℃3天，如在此期内出现肉眼可辨的粉红色为不合格。
标签上注明出品日期及有效期。
液态的Chol参考血清(含有不抑制CHE、CHOD与POD的防腐剂)，-20℃保存至少稳定2年，冻干品更稳定。
标签上注明出品日期及有效期。
3 操作(1)标本为及时分离的空腹血清、肝素或ED-TA抗凝血浆。
(2)终点法测定时标本管与标准管中分别加入标本与定值血清各10μl，酶试剂1ml，混匀后在37℃放置5分钟，或20-25℃放置10分钟后用光度计比色，以试剂空白调零，波长500nm或520nm，颜色稳定至少60分钟。
4 计算TC(mmol／L)=A测定／A标准×定标血清TC浓度(mmol/L)。
速率法测定根据仪器性能及所用试剂的反应速度设计操作程序，一般要求试剂中酶用量较高。
实验七__胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇
生物化学与分子生物学设计实验（胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟法测定血清尿素）小组成员：班级：麻醉11-2班日期：2012年12月19胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟法测定血清尿素实验目的1、掌握酶法测定总胆固醇的原理和方法。
2、学习用比色法测定血清尿素。
3、巩固有关胆固醇和尿素的知识。
4、进一步熟练UV2100型分光光度计的重点、难点：重点：1、氧化酶法测定总胆固醇的原理2、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项难点：氧化酶法测定总胆固醇的原理一、实验原理（一）氧化酶法测定血清总胆固醇血清总胆固醇(TC)包括：游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)两部分。
本实验是胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶相偶联发生的偶联反应。
第一步：血清胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸(FFA) 。
第二步：胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和H2O2。
第三步：H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC含量成正比。
（二）二乙酰一肟法测定血清尿素二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。
因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。
二、操作步骤（一）氧化酶法测定血清总胆固醇终点法检测TC，取试管3支按下表依次加样。
酶法测定TC操作步骤加入物(μl)空白管标准管测定管血清－－20标准液或定值血清－20－蒸馏水20－－酶试剂 1 000 1 000 1 000混匀后，37℃保温10 min，每管加3ml水混匀，用分光光度计比色，于500 nm波长处以空白管调零，读出各管吸光度。
（二）二乙酰一肟法测定血清尿素取试管3支，按下表依次加样。
二乙酰一肟法操作步骤加入物(ml)空白管标准管测定管血清－－尿素标准应用液－－蒸馏水－－二乙酰一肟溶液酸性试剂混匀，置沸水浴加热12min，取出置冷水中冷却5min，以空白管调零，在540nm处读取各管吸光度。
血清总胆固醇的测定(胆固醇氧化酶法)
化，显色与比色五个阶段。目前临床上常用的是
胆固醇氧化酶法
化学法的种类很多，由于显色反应的特异性不同，其结果有一定 的差异。
Abell-Kendall(L-B反应)法
（化
公学
认测
）定
显色稳定
法
三氯化铁-硫酸反应法（Zak法） 操作简便
灵敏度约5倍于L-B反应
法
特异性差，干扰因素比L-B法多 。Zak法更适合于科研使用 。胆固醇酯与游离胆固醇显 色程度比较接近
（mmol/l）
• 参考值 • 3.0-5.20mmol/l。危险阈值：5.20-6.20mmol/l 。
高胆固醇血症：>=6.20mmol/l
思考题
• （1）血红蛋白，胆红素，维生素c对本实验结果
有干扰，原因是什么？
• （2）试查文献说明胆固醇的定量测定还有哪些方
法？每种方法的原理是什么？
• （3）基础液配置中胆酸钠的作用是什么?
表7-7血清总胆固醇的测定
项目
血清/μL
胆固醇标准 液/μL 蒸馏水/μL
酶试剂/μL
测定管
50
—
— 1.50
标准管 — 50
— 1.5水浴中保温15分钟，用空白
管调零，在500nm波长处测吸光度。
• 计算公式： 血清总胆固醇=A测定/A标准 x5.17
临床意义动脉粥样硬化原发性高血脂症贫血败血症甲状腺功能亢进实验目的血清中总胆固醇游离胆固醇游离脂肪酸低密度脂蛋白高密度脂蛋白极低密度脂蛋白乳糜微粒测定方法化学法
血清总胆固醇的测定 （胆固醇氧化酶法）
主讲人：刘杰
同组人（刘杰、杨宇光、陈琪、刘婷婷）
我们为什么要做这个实验呢？
• 化验介绍：血清胆固醇是血脂的成分之一，
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生物化学与分子生物学设计实验
（胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟
法测定血清尿素）
小组成员：
班级：麻醉11-2班
日期：2012年12月19
胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟法
测定血清尿素
实验目的
1、掌握酶法测定总胆固醇的原理和方法。
2、学习用比色法测定血清尿素。
3、巩固有关胆固醇和尿素的知识。
4、进一步熟练UV2100型分光光度计的
重点、难点：
重点：1、氧化酶法测定总胆固醇的原理
2、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项
难点：氧化酶法测定总胆固醇的原理
一、实验原理
（一）氧化酶法测定血清总胆固醇
血清总胆固醇(TC)包括：游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)两部分。
本实验是胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶相偶联发生的偶联反应。
第一步：血清胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸(FFA) 。
第二步：胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和H2O2。
第三步：H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC含
量成正比。
（二）二乙酰一肟法测定血清尿素
二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。
因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。
二、操作步骤
（一）氧化酶法测定血清总胆固醇
终点法检测TC，取试管3支按下表依次加样。
酶法测定TC操作步骤
加入物(μl) 空白管标准管测定管血清－－20
标准液或定值血清－20 －蒸馏水20 －－
酶试剂 1 000 1 000 1 000
混匀后，37℃保温10 min，每管加3ml水混匀，用分光光度计比色，于500 nm波长处以空白管调零，读出各管吸光度。
（二）二乙酰一肟法测定血清尿素
取试管3支，按下表依次加样。
二乙酰一肟法操作步骤
加入物(ml) 空白管标准管测定管
血清－－0.02
尿素标准应用液－0.02 －
蒸馏水0.02 －－
二乙酰一肟溶液0.5 0.5 0.5
酸性试剂 5.0 5.0 5.0 混匀，置沸水浴加热12min，取出置冷水中冷却5min，以空白管调零，在540nm处读取各管吸光度。
三、注意事项
（一）氧化酶法测定血清总胆固醇
1、最后加酶试剂，各管反应时间应一致；
2、比色应在30min内完成；
3、试管在操作前尽量保持干燥；
4、试剂中酶的质量影响测定结果；
5、若需检测游离胆固醇浓度，将酶试剂成分中去掉胆固醇酯酶即可。
（二）二乙酰一肟法测定血清尿素
1、试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度
褪色现象，(每小时小于5%)。
煮沸显色经冷却后，应及时比色。
2、尿液中尿素也可用此法测定，但因浓度高，需先用去离子水作50倍以上稀释。
3、注意洁净干燥，加量务必准确。
4、水浴时注意打开水浴箱盖，以免水汽入管。
5、酸性试剂中酸的含量较浓，要小心使用。
四、思考题
1. 血清胆固醇浓度升高或降低有何临床意义？
2. 血清尿素浓度升高或降低有何临床意义？
3. 血清非蛋白氮(NPN)与尿素的区别，它包括哪些？
小结
氧化酶法测定血清总胆固醇，此方法特异性好和灵敏度高，既可用于手工操作，也可自动化分析；既可作终点法检测，也可作速率法检测。
在终点法中血红蛋白高于2g/L时引起正干扰；胆红素高于0.1g/L时有明显负干扰；血中维生素C与甲基多巴浓度高于治疗水平时，会使结果降低。
但是在速率法中上述干扰物质影响较小。
高TG血症对本法无明显影响。
检测TC的血清(浆)标本密闭保存时，在4℃可稳定1周，－20℃可稳定半年以上。
二乙酰一肟法测定血清尿素，试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。
在标本数量多时加热开始难以达到100℃，各管间受热温度也可能不一致，因而本法重复性不佳。
若改善加热条件，如采用在水浴锅底部加置高约5mm的网垫，在网垫上加热显色，可使CV由不加网垫时的6.46%降至2.99%。
线性上限仅达7.14mmol/L；回收率为96%～102.1%。
二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。
很多其它化合物在结构中会有尿素的残基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，虽然也会产生一种带颜色的产物，但这些化合物在血清中浓度很低，故很少引起明显的干扰。
另一些其它的化合物在血清中浓度高，但这些色素的最大吸收峰不同，因此不产生明显干扰。
胆红素达171μmol/L、血红蛋白达10g/L
均无影响。