菠萝蛋白酶的制备及活力测定
菠萝蛋白酶的提取实验报告
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。
关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。
1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
中国药科大学生化设计性实验报告参考——菠萝蛋白酶的提取和活力测定课件
本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀 法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品 中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生 酪氨酸，通过在275nm波长下测定吸光度的变化，可以测 得菠萝蛋白酶的活力。
7
8
1.0
0
0
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4
4
0.140 0.582 （稀释5倍）
中国药科大学生化设计性实验报告
6
参考——菠萝蛋白酶的提取和活力
根据上表，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质量为横坐标作图
根据线性拟合关系y=6.2357x,计算蛋白酶的质量
中国药科大学生化设计性实验报告
7
参考——菠萝蛋白酶的提取和活力
（三）菠萝蛋白酶活力的测定
2、菠萝蛋白酶活力=0.868/10=0.0868U 3、比活力=0.0868U/0.1123mg=0.7729U/mg 4、提取率=0.1123mg/0.735kg=0.00001528% （五）结果讨论
从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：
1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响； 2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉
项目一
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
微生物09301班第三实验小组 成员：徐雨婷 杨洋 刘杨
何威 刘鄂龙
中国药科大学生化设计性实验报告
1
参考——菠萝蛋白酶的提取和活力
一、实验目的
1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶； 2、掌握对目的蛋白酶质量的检验； 3、学习酶比活力的计算；
菠萝蛋白酶的提取和活力测定
三、实验材料和试剂
1、实验材料
新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白
2、实验试剂 柠檬酸钠 维生素c 单宁 0.1%EDTA溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化 钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调 PH至7.0） 激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L 硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用）
四、实验器材和仪器
1、榨汁机； 2、离心机； 3、紫外可见分光光度计（2cm石英比色皿）； 4、恒温水浴锅（37℃）； 5、试管、试管架； 6、烧杯、容量瓶； 7、移液管；
五、实验操作方法法和步骤
（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤： 将菠萝切碎
加柠檬酸钠，榨汁 冻存备用
菠萝汁
纱布过滤
酶复合物沉淀
（二）考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量
1、标准曲线的制作 按下表操作
试管号 标准蛋白 （0.1mg/ml) 1 0 0 1.0 4 0 2 0.1 0 0.9 4 0.115 3 0.2 0 0.8 4 0.148 4 0.4 0 0.6 4 0.245 5 0.6 0 0.4 4 0.395 6 0.8 0 0.2 4 0.525 7 1.0 0 0 4 8 0 1.0 0 4
离 心
澄清液
2000r/min，7min离心 加Vc,0.2%单宁溶液 搅拌15min,静置40min 4200r/min,5min离心
上清液 沉淀物
加100ml0.1%EDTA溶液， 200ml1.5%氯化钠液 4200r/min,5min离心
钠加 溶适 液量 ，
1.5% 氯 化
酶复合物
菠萝蛋白酶的提取、初级纯化及活性鉴定
2、测酶活试剂 （1）1%酪蛋白（pI4.8）：200ml。
用0.1 mol/L PBS pH7.8配，50-55℃水浴溶解，不停搅 拌，需1h才能溶解。 2g酪蛋白+200ml PBS（0.1 mol/L pH7.8）。
（2）激活剂 100ml（现配现用）
20 mmol/L半胱氨酸-盐酸盐，1 mmol/L EDTA-Na，用 0.1 mol/L pH7.8 PBS配制至100ml。
2、蛋白质的分离纯化方法：
(一)沉淀法 • 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚 乙二醇（PEG）沉淀法等。
• 在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升 高，这种现象称为盐溶。 • 但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。
•一般进行蛋白质沉淀时，选用的盐是硫酸铵。 优点： ①溶解度大，对温度不敏感； ②分级效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用； ④价格低廉。 缺点：盐浓度含量高。
（3）5%TCA（三氯乙酸）：200ml。
3、透析袋处理 • 将10 cm长的透析袋置于1000ml含1mmol/L EDTA-Na2的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10min后，用 干净镊子取出，经蒸馏水煮沸、漂洗，即可使用。
四.实验步骤
1、粗酶提取 生菠萝皮（每一组） 30g+50ml PBS 0.1 mol/L pH7.8 ↓ 电动搅拌 ↓ 2～4层纱布过滤于烧杯中 ↓ 分装于离心管（10ml/管） ↓
2、酶活测定方法（每组）
试剂 TCA(ml) 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 激活剂（ml） TCA(ml) A275石英比色杯 酶活（U） 酶活（U）平均 值 0 0 对照(调零) 3 1 0.1 0.9 实验1 — 1 0.1 0.9 3 静置 5min 滤纸过滤 实验2 — 1 0.1 0.9 3 实验3 — 1 0.1 0.9 3
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
6、按步骤5混匀，在37℃水浴下反应10 min; 7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液， 摇匀，于室温放置30min; 8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度 9、测定结果如下
试管号
吸光度A
1
2
3
4
ห้องสมุดไป่ตู้
5
实验过后对结果进行分析和计算
数据的处理
1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中 蛋白酶的总质量m 2、菠萝蛋白酶活力=A/10 3、比活力=菠萝蛋白酶活力/m 4、提取率=m/菠萝的质量
应该注意的事项
1.操作过程温度的控制，确保所得的蛋 白不失活。 2.弄清所加试剂和每步操作对实验结果 的影响。 3.在酶活力的测定中，加入氢氧化钠是 为了终止反应。 4.所加酪蛋白溶液的量对实验结果有影 响。需要多次实验确定所加的量，避免 反应不完全或蛋白剩余，影响实验结果。
一、菠萝蛋白酶在食品加工业的应用
1、焙烤食品：将菠萝蛋白酶加入生面团中， 可使面筋降解，生面团被软化后易于加工。 并能提高饼干与面包的口感与品质。 2、肉类的嫩化：菠萝蛋白酶将肉类蛋白质 的大分子蛋白质水解为易吸收的小分子氨 基酸和蛋白质。可广泛地应用于肉制品的 精加工。 3、干酪：用于干酪素的凝结
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
背景介绍
菠萝蛋白酶广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎中，从菠 萝的果实中提取的称为果菠萝蛋白酶（FruitBromelain）， 从菠萝的茎中提取的称为茎菠蛋白酶（Stem Bromelain）。 菠萝蛋白酶的分子量为33000，是典型的巯基蛋白酶，能分 解蛋白质，肽，酯，酰胺。它的水解蛋白的活性比木瓜蛋 白酶的活性高十倍以上，因此有着广泛的用途。它作为一 种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、 明胶、水解蛋白酶的生产。在医药上它可用于生物体内溶 解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症； 它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中 小面积深度烧伤的治疗。这里就菠萝蛋白酶的三种提取方 法
菠萝蛋白酶的制备及其活力测定
1、防腐剂：5%苯甲酸钠溶液：取5g苯甲酸钠加蒸馏水至100ml，混匀，即得。
2、沉淀剂：0.2%鞣酸溶液：取鞣酸0.6g，加乙醇至300ml，溶解混匀，即得。
3、洗涤剂Ⅰ：0.1%EDTA用0.5%的EDTA稀释即得。
1.5%Na Cl ：取Na Cl 12g ，加纯水至800ml，混匀，即得。
4、洗涤剂Ⅱ：0.5%乙酸锌：取乙酸锌2.5g，加水至500ml，混匀，即得。
0.06%抗坏血酸：取抗坏血酸0.12g，加水至200ml，混匀，即得。
0.5%EDTA：取EDTA1.5g，加水至300ml，混匀，即得。
5、洗涤剂Ⅲ：0.5%硫代硫酸钠：取硫代硫酸钠0.5g，加水至100ml，混匀，即得。
0.1% L-半胱氨酸溶液10ml【配制方法：取L-半胱氨酸0.1g,加水10ml,加1mol/L 盐酸溶液(浓盐酸1ml加水至12ml即得)6～8滴，最后用6mol/L的氢氧化钠试液（240g氢氧化钠加水至1000ml即得）中和至pH3～4。
】扩大10倍体积。
6、菠萝蛋白酶活力测定试剂：（此试剂暂不配制，看提取情况再定）0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0):取6.8g磷酸二氢钾(136.09g/mol)加水至1000ml，用0.2M氢氧化钠试液调pH7.0，即得。
激活剂【取6.8g磷酸二氢钾加水至1000ml，用0.2M氢氧化钠试液调pH7.0，加15mol的硫代硫酸钠(158g/mol)，加6molEDTA-2Na(374.26g/mol),现用现配。
】1%酪蛋白：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml烧杯中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，转移至100ml容量瓶内定容，保存于冰箱内。
1mol/L氢氧化钠：去氢氧化钠40g加水至1000ml，即得。
也可以用6mol的稀释。
器材：榨汁机、离心机(本实验室的那太不好用，申请调换)、冰箱、干燥器、研钵、剪刀、紫外分光光度计。
菠萝蛋白酶的提取分离纯化及活性测定
菠萝蛋白酶得提取、初步分离纯化及活性测定１5食安(1)班张凯摘要:本研究运用硫酸铵沉淀法与透析法并结合考马斯亮蓝G520染色法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量,得到同一品种及成熟度得菠萝皮经两种不同得纯化方法处理,菠萝皮中得蛋白酶都能被有效纯化,但就是蛋白酶活性会损失一部分、关键词:菠萝蛋白酶;透析法;分离纯化;酶活性;前言菠萝蛋白酶(bromelａｉｎ)就是从菠萝植株中提取得一类蛋白水解酶得总称,主要存在于菠萝茎与果实中,根据提取部位得不同,分为茎菠萝蛋白酶与果菠萝蛋白酶。
Mａrcaｎo于18９1年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶、随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药与化工领域有很好得利用价值。
1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解酶,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。
目前,菠萝蛋白酶得一些功能成分已得到成功分离,并应用于医药领域、随着提取纯化技术得不断进步,高活性得菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工与食品领域。
[１］利用菠萝皮分离纯化菠萝蛋白酶,不仅可充分利用资源,拓展菠萝蛋白酶得获取途径与应用空间,还可降低菠萝加工废料对环境得污染;随着市场对菠萝加工产品需求量得增大,对于菠萝皮得研究与利用就显得尤为重要,尤其对最主要得功能成分蛋白酶得分离、纯化与性质得研究更有意义、[２]本文通过对菠萝皮蛋白酶得提取,初步分离纯化及活性测定进行了初步研究,探讨影响菠萝蛋白酶活性得影响因素,并解决实验存在得一些问题、1实验材料与仪器１、1实验材料与试剂新鲜菠萝,透析袋(截留相对分子质量８00０~１４０00),0。
１mo1／ＬpH 7.8磷酸缓冲液配制(ＰBS),0.0１mｏ1/L pH 7。
８磷酸缓冲液配制(PBS),1%酪蛋白,激活剂[含20mｍo1/L半胱氨酸-盐酸盐、1mｍo１/L EDTA—Na2(乙二胺四乙酸二钠)],10%三氯乙酸(TCＡ)。
1、2实验仪器７2２型可见光分光光度计:上海舜宇恒平科学仪器有限公司;７52型光栅分光光度计:北京光学仪器厂;TＤL－６0B台式离心机:上海安宁科学仪器厂;D5Ｍ离心机:长沙湘智离心机仪器有限公司;DK-８Ｄ电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;可控硅恒温水浴锅:上海锦屏仪器仪表有限公司;AMPUT电子天平:深圳安普特科技有限公司;BS１１０S分析天平北京赛多利斯天平有限公司;ＤS—１型高速组织捣碎机:上海标本模型厂;HZS-H型水浴振荡器:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。
菠萝中提取菠萝蛋白酶
四、实验器材和仪器
1、榨汁机； 2、离心机； 3、紫外可见分光光度计（2cm石英比色皿）； 4、恒温水浴锅（37℃）； 5、试管、试管架； 6、烧杯、容量瓶； 7、移液管；
五、实验操作方法法和步骤 实验操作方法法和步
（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤： 将菠萝切碎
加柠檬酸钠，榨汁 冻存备用
菠萝汁
5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中 应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实 验没有得到这种结果。 6、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上 清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响。
三、实验材料和试剂 1、实验材料 、 新鲜菠萝、0.1mg/ml牛血清蛋白 2、实验试剂 、 维生素c 0.1%EDTA溶液 柠檬酸钠 维生素 单宁 溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化 氯化钠溶液 酪蛋白溶液 氢氧化 钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调 磷酸缓冲液（ 磷酸缓冲液 溶解磷酸二氢钾， PH至7.0） 至 ） 激活剂（ 磷酸缓冲液， 激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含 ， 磷酸缓冲液 内含15mmol/L 硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用） 现配现用） 硫代硫酸钠和 现配现用
项目一
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
微生物09301班第三实验小组 成员：徐雨婷 杨洋 刘杨 何威 刘鄂龙
一、实验目的
1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶 2、掌握对目的蛋白酶质量的检验 3、学习酶比活力的计算
二、实验基本原理
菠萝蛋白酶是一种具有消炎，抗水肿作用的疏基酶， 能 分解蛋白质、酯和酞胺。 菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取，为浅黄 色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不 溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点9.55 。 本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀 法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品 中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生 酪氨酸，通过在275nm波长下测定吸光度的变化，可以测 得菠萝蛋白酶的活力。
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1%酪蛋白溶液（ml）
8
1
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0
8
0
迅速摇匀，室温下静置30min
取上清液于275nm波长下测定吸光值
五、结果与讨论
1、计算菠萝蛋白酶得率（g/100g），并计算所得酶制剂的活性（U/g）。
(A2+A3)/2－A1
酶活性= —————————
0.15×1/100×1/10
2、洗涤与保护
（1）酶糊倒入烧杯，加0.1%EDTA溶液100ml，搅匀，再加1.5%NaCl溶液200ml搅匀，4000rpm离心7min，倾去上清液，得酶复合物I；
（2）将酶复合物I倒入烧杯，加0.5%乙酸锌溶液20ml，搅匀，静置5min；加0.06%Vc溶液30ml，搅匀，静置5min；再加1.5%NaCl溶液20ml，搅匀静置5min；最后加0.5%EDTA溶液20ml，搅匀静置5min；以4000rpm离心7min，倾去上清液，得酶复合物II；
四、实验步骤
1、提取
（1）取一定量的菠萝皮汁（约ml），加5%苯甲酸钠10ml，搅匀，以4000rpm离心7min，取上清液倒入另一烧杯中；
（2）缓慢加入0.2%单宁溶液75ml，边加边搅拌约15min，沉淀物析出，静置40min；
（3）虹吸除去上清液，沉淀物以4000rpm离心5min，倾去上清液，得酶糊状物。
4、酶活测定
（1）酶液制备
取所得酶制剂0.15g，加入0.05mol/L（pH7.0）PBS(磷酸盐缓冲液)定容至100ml，过滤。滤液即为工作酶液。
（2）活性测定
取3只试管，按下表加入试剂，及其他操作。（各试剂于37℃水浴保温至恒定）
试剂
管号
1
2
3
酶液（ml）
1%酪蛋白溶液（ml）
1
0
1
1
1
1
混匀，37℃保温10min
（3）将酶复合物II倒入烧杯，加0.5%硫代硫酸钠溶液20ml，搅匀静置5min；加1% L-Cys溶液10ml，搅匀，以4000rpm离心7min，倾去上清液，得菠萝蛋白酶糊。
3、冷冻干燥
将所得酶糊放入冰室（－12℃），冷冻15~20h，取出解冻，离心得酶膏；将其放入装有氯化钙或五氧化二磷的干燥器中干燥6~10h，得干酶，研磨成粉状，低温保存。
2、讨论影响菠萝蛋白酶得率及活性的主要因素。
课后体会：
实训三 菠萝蛋白酶的制备及活力测定
一、目的和要求
1、掌握菠萝蛋白酶制备的基本原理和方法；2、掌握菠萝蛋白酶活测定方法。
二、原理
菠萝蛋白酶具有一定的医疗保健功能：1、抑制肿瘤细胞的生长；2、对心血管疾病的防治；3、用于烧伤脱痂；4、消炎作用；5、增进药物吸收。
单宁又称鞣酸、丹宁酸，是多酚中高度聚合的化合物，它们能与蛋白质（酶）形成难溶于水的复合物，是蛋白沉淀剂。本试验即利用单宁沉淀法提取菠萝蛋白酶。
EDTA、Vc和L－半胱氨酸具有保护酶活功能；锌离子、硫代硫酸钠等具有酶活激活的作用。
活性测定方法是以酪蛋白水解释放的酪氨酸在275nm的吸收值为基础，酶活单位定义为：在测定条件（37±0.2℃；pH值7.0）每分钟水解酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm波长有吸光度与1微克酪氨酸的吸光度相当时，所需的酶量即为一个活力单位，用u/g表示。
第十八、九讲2009～2010学年第一学期
2009年月日第节
授课内容
实训三 菠萝蛋白酶的制备及活力测定
授课时数
4
教学目标
1、掌握菠萝蛋白酶制备的基本原理和方法；2、菠萝蛋白酶活测定方法
教学重点
菠萝蛋白酶提取方法原理和酶活保护措施
教学难点
单宁沉淀蛋白的酶活保持
教材教具
教学内容（含教学步骤、时间分配、教法学法、作业布置等）
三、实验材料
1、
2、器材
100ml量筒、500ml烧杯（2个）、100ml烧杯、玻璃棒、漏斗、纱布、干燥器、离心机、紫外分光光度计。
3、试剂
苯甲酸钠、单宁、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）、NaCl、乙酸锌、抗坏血酸、硫代硫酸钠、L-半胱氨酸、Na2HPO4、NaH2PO4、酪蛋白。