为什么脓性标本(分泌物或穿刺液)常常培养不出细菌
临床细菌检验结果的可靠性分析
临床细菌检验结果的可靠性分析摘要：随着医学技术的飞速发展，细菌检验在临床疾病治疗中有着举足轻重的地位。
临床细菌检验所面临的很重要的一个问题就是检验结果的可靠性。
影响检验结果可靠性的因素有很多，如标本的采集运送、标本的分离培养和鉴定手段等，除此以外还有标本的采集方法以及标本的质量等。
关键词：细菌；标本；微生物：病原菌；质量控制；检验结果【中图分类号】r446【文献标识码】a【文章编号】1674-7526（2012）08-0058-02临床细菌检验面临一个重要问题就是检验结果的可靠性。
细菌检验是实验室检验的一种常用方法，有助于患者所患感染性疾病致病菌的确定，为临床疾病的诊断及指导临床用药提供重要依据。
细菌检验结果的可靠性影响因素很多，包括标本的采取（采取标本的时机、方法）、标本的运送（运送方式及标本的保存）、分离培养技术方法和鉴定手段等。
现从以下三个方面加以简要分析。
1微生物标本的采集不够规范标本的采集主要由医护人员操作，由于实验室与临床的交流沟通不够，医护人员对于临床微生物标本的采集要求和注意事项不甚了解，标本采集前要求患者应该做些什么准备，采集标本应该选择什么时机、什么部位，每天采几次、采多少量以及采样部位应该如何消毒等一系列问题。
多数医院没有明确的文字规定，其结果可能导致标本采集不合格，致使病原菌检出率降低或者即使分离出某种细菌，但未必是致病菌，如此非但不能提供病原信息.反而会造成误导。
如痰标本采集，留取标本前要求患者用清水漱口3次，然后用力咳出。
这种自然的咳痰方式.使得采集到的标本必然要受到上呼吸道分泌物的影响（污染），而上呼吸道分泌物中常有大量的多种细菌（106～109/ml），因此确定痰标本的质量是非常重要的。
建议在痰标本培养之前先涂片进行革兰染色，根据细胞种类以及存在的细菌情况而确定是否培养或者重新留取标本，从而提高结果的可靠性，减少误诊及抗菌药物的滥用。
再如脓性分泌物（包括穿刺液、术后感染分泌物、外伤分泌物等）也存在着标本采集的质量问题，由于取材不规范，往往培养出多种细菌，实际上这些细菌并非引起感染的真正致病菌，而多数是在创面上繁殖的杂菌，因此一定要采集深部的分泌物，必要时要采创面和健康部位过度地段的少量组织进行培养，在培养前对标本先行涂片，革兰镜检以确认标本的质量。
细菌标本的采集及注意事项
• 2 巴氏腺、尿道旁腺：清洗或局部消毒，然后压迫腺体， 使分泌物溢出。
• 3 阴道分泌物：用窥器扩张阴道，先用拭子清除阴道表面 分泌物，弃去拭子，用灭菌女性拭子采取阴道口内4cm内 侧壁或后穹隆处分泌物培养。如果未成年幼女怀疑患性传 播疾病时,不应使用扩阴器,应以无菌拭子在阴道口处采取 分泌物送检。
脓液和创伤分泌物标本的采集
• １．采集方法 • （１）开放性脓肿： 用无菌生理盐水擦洗病灶表面后，用蘸
有无菌生理盐水的灭菌棉拭子采取脓液和病灶深部的分泌物， 置无菌试管内送检。注意尽量采取化脓组织与正常组织交界 处的脓汁。临床有时提出疑问，明明患者有感染的指征也有 大量的炎性渗出，但为什么细菌培养常常阴性呢？这可能与 标本采集的部位有关，如果单纯采集脓液是不行的，因为脓 汁经过我们涂片显微镜观察证实为脓细胞、细菌碎片及粘液 组织的混合物，经常无完整的活的细菌形态，所以这样培养 的结果常常无菌的。而交接处的活菌较多，会提高阳性率。
（咳）痰及呼吸道标本的采集
• 1采集时间：以晨痰为好；支气管扩张症病人，清 晨起床后进行体位引流，可采集大量痰标本。
• 2自然咳痰法：在留取痰之前，用清水反复漱口 （漱口液不能含抗菌物质）；应从气管深部咳出 痰，吐入无菌容器内。
• 3气管穿刺法： • 在环甲膜下穿刺抽取痰液，收集标本，适用于厌
氧菌培养。 • 4气管镜下采集法：在病灶附近用导管或用支气管
生殖道标本的采集
• 1 尿道分泌物 ①男性：清洗尿道口，用灭菌纱布或棉球擦拭，采取从尿道 口溢出的脓性分泌物或用无菌男性拭子插入尿道内2～4cm 轻轻旋转后取出分泌物。如无脓液溢出，可从阴茎的腹面向 龟头方向按摩，促使分泌物溢出。 ②女性：清洗尿道口，用灭菌棉球擦拭，然后从阴道内诊压 迫尿道，或从尿道的后面向前按摩，使分泌物溢出。无肉眼 可见的脓液，可用灭菌拭子轻轻深入前尿道内，旋转拭子， 采集标本。
实验十三 脓汁标本的细菌学检验一
五、试验内容
1.革兰染色 2.分离培养
血平皿及麦康凯平皿
四 步骤和方法
1.标本的采集： 注意防止正常菌群的污染 ①封闭性脓肿 ②开放性脓肿 ③胸，腹水 ④大面积烧伤的创伤分泌物 ⑤瘘管
封闭性脓肿： ①封闭性脓肿 在病灶局部外表消毒后，以 无菌注射器抽取脓液5-10ml 置无菌试管中送检。若怀疑 厌氧菌感染时，抽取脓液后 立即排尽注射器内的空气， 刺入无菌橡皮塞中送检。
开放性脓肿： ②开放性脓肿 先消毒病灶周围，用无菌生 理盐水或70%的酒精擦去表 面渗出物，然后用无菌棉签 采取病灶深部脓液及分泌 物，置无菌试管中送检。 （采集两个拭子，一个做革兰染色，一个做 分离培养）
腹水： ③胸，腹水 由临床医生无菌采集胸腔或腹 腔积液5-10ml，置无菌试管中 送检。（一般应先在无菌试管 中加入灭菌肝素0.5mg,防止标 本凝固）
实验十三 脓液及穿刺 液脓液及穿刺液的标本采集方法 2.掌握脓液及穿刺液标本的细菌学检验程序 和方法
二、器材
1.标本： 脓汁模拟标本 2.培养基：BA 、Mac 3.试剂： 革兰染色液 3. 4.其他： 玻片、接种环、酒精灯、显微镜等
三、常见致病菌
1、革兰阳性需氧菌: 金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、肠球菌等 2、革兰阴性需氧菌: 肠杆菌科细菌、假单胞菌属等 3、厌氧菌: 拟杆菌属及其它厌氧杆菌、梭状芽胞杆菌、 厌氧球菌 4、其他： 放线菌、诺卡菌、白色念珠菌
② 如做厌氧培养，应用厌氧运送系统运送。 标本在2小时以内到达实验室。
2.检验程序 2.检验程序
脓液、 脓液、创伤分泌物及穿刺液
涂片
需氧培养
厌氧培养
隔绝氧气运送
革兰染色 抗酸染色 厌氧琼脂平板 BA 、 Mac
脓液及创伤感染分泌物的细菌学检验
标本的形态学检验
1.湿片检查 脓液标本或以无菌生理盐水稀释的标 本，加盖盖玻片。或取一滴脓液于载玻片上，然后 滴加一滴卢戈碘或0.1%亚甲蓝染液混合，加盖盖 玻片。用高倍镜观察细胞和细菌的分布、细菌的数 量和运动特性等情况。 2.固定染色检查 将标本制成涂片，进行革兰染色 或抗酸染色，必要时再加其他染色方法，用油镜观 察细菌形态结构及染色特征。
采集方法
3.特殊类型化脓性炎症 ①导管治疗引起的感染， 无菌操作将导管尖端用无菌生理盐水或培养基冲洗， 洗液立即送检培养，应同时采血培养。②蜂窝组织 炎、坏疽，用无菌生理盐水或75%乙醇擦拭清洁感 染部位，然后用注射器将少量无菌生理盐水注入病 灶，自病灶中心抽取标本。③烧伤感染部位细菌定 量培养，清洁感染部位后清创，切取3～4mm3的 活组织块送检。④手术切口部位感染，以注射器抽 取脓液或将拭子插入伤口深处采集标本。
细 菌 检 验 操 作 流 程
2.病原菌的鉴定
（1）形态染色特征鉴定 根据患者的临床表现、 细菌的形态染色特点，可以初步判断出细菌的类 属，有些细菌的特殊形态特点具有鉴定意义。如 泌尿生殖道来源的标本中，发现双肾或咖啡豆样， 凹面相对，无动力，无芽胞，或有荚膜的革兰染 色阴性双球菌时，可以判定是淋病奈瑟菌。
2.病原菌的鉴定
（4）分子生物学鉴定 分子生物学技术方法可用 于检测纯培养菌株，还可以直接检测未经分离培 养的标本中的细菌。有多种技术类型可供选择， 目前临床标本检测常用的主要是聚合酶链式反应 （PCR）方法。
2.病原菌的鉴定
（5）药物敏感试验 获得纯培养菌株或疑似致病 菌的优势生长菌株后，应该尽快通过药物敏感试 验选择有效药物，在大面积烧伤感染或脓毒血症 等危重疾病时显得尤为迫切。
标本的分离培养
为何送检的是浓痰，涂片却是阴性？
为何送检的是浓痰，涂片却是阴性？前言痰标本的涂片染色镜检和培养基分离培养是呼吸系统感染病原学诊断的常用方法，对诊断呼吸系统感染具有很高的价值。
痰涂片革兰染色镜检能初步判定病原菌的种类，细菌培养则是诊断感染病原菌。
涂片与培养结果相互结合，可指导临床作出正确的判断，但两者有时也会出现一阴一阳相互矛盾的情况。
事件经过远在北京出差的组长在工作群里发了一段聊天记录，是一位呼吸内科的医生对患者痰涂片结果有异议。
大致内容是该患者第一天送检的灌洗液几乎就是纯痰，非常浓，但涂片镜检结果却是阴性的，临床对此涂片结果有异议。
第二天临床又送检了该患者的灌洗液进行复查，想让我们帮忙多关注一下，看看涂片是否真的未找到细菌并查找原因。
当天中午时刻该患者的标本送来了。
标本虽是灌洗液，但是性状很浓，几乎就是浓痰。
在培养操作完成之后立即涂片，干燥固定后染色镜检，镜下找到革兰阴性杆菌1+，随后该份灌洗液标本的细菌培养结果为铜绿假单胞菌，而第一天送检的细菌培养也培养出假单胞菌。
讨论该案例中，引起医生产生困惑的是送检的明明是浓痰，为何涂片却是阴性？对于该患者第一份标本涂片阴性而培养阳性的情况，我们从以下几方面给临床医生进行解答：1.标本中细菌含量少未达到涂片镜检的下限或挑取涂片时未选到正确的痰液；2.培养操作过程可能受到外界污染，培养出来的细菌是污染菌；3.检验技术人员涂片镜检不够细致，水平所限，导致漏检。
通过与其沟通，得知该患者入院后予头孢美唑+依替米星及哌拉西林他唑巴坦抗感染，病情得到缓解，考虑不能排除假单胞菌引起感染的可能。
此外，脓性标本不管是浓痰还是脓液，其中的脓细胞可能是白细胞吞噬掉细菌后中毒而亡的尸体。
细菌被白细胞吞噬后，其释放出某些抑菌成分会抑制细菌的进一步繁殖，从而导致培养结果阴性。
通过分析解答，医生表示理解并感谢。
此案例值得反思的另外一个问题是，当碰到涂片阳性而培养阴性的情况时，我们又该如何解答。
微生物室可能都应该接到过这样来自临床医生的询问：为什么我送检的XX标本培养不出细菌，结果是无细菌生长的。
细菌室脓汁及病灶分泌物细菌学检验操作规程
细菌室脓汁及病灶分泌物细菌学检验操作规程1、脓汁及病灶分泌物培养常见病原菌革兰阳性菌革兰阴性菌葡萄球菌肠杆菌科细菌链球菌假单胞菌炭疽芽孢杆菌拟杆菌破伤风芽孢杆菌腐败谢瓦纳拉菌产气荚膜梭菌嗜血杆菌结核分枝杆菌产碱杆菌放线菌、奴卡菌弧菌属细菌念珠菌气单胞菌2、标本采集：标本由临床医师行无菌操作术采集，但应注意以下几点：2.l、闭锁性脓肿疑为厌氧菌感染时，取材后立即将空气排空，同时针尖插入橡皮塞内防止空气进入，连同注射器一并送检。
2.2、开放脓肿、脓性分泌物可在患部直接用棉拭或纱布擦抹，如为瘘管亦可在无菌操作下取组织碎片分散在无菌盐水中。
2.3、烧伤创面的分泌物，用灭菌棉拭取多部位创面的脓液或分泌物，置无菌试管中送检。
2.4、取尿道分泌物必须先清洗、消毒尿道后用挤压法使分泌物从尿道溢出，用无菌生理盐水浸湿拭子直接采集标本。
如女性做宫颈分泌物细菌培养，应尽量避免杂菌污染。
2.5、组织脏器碎片的收集，先要消毒表面的污染菌，后用无菌刀切开，取内容物及碎片分散于无菌生理盐水中，然后增菌、接种，如活体微量标本可直接放人肉汤增菌培养基中增菌。
3、检验步骤3.1、涂片检查：脓汁及分泌物标本均应做涂片检查。
涂片做革兰氏染色镜检，根据形态和染色特点，可报告“找到革兰氏×性菌，形似××菌”或报告“未发现细菌”。
涂片检查包括涂片找细菌、淋球菌、酵母菌等。
3.2、培养普通细菌培养：标本接种血平板、麦康凯平板各一只，35℃培养18～24小时，根据菌落特性和形态染色，进行鉴定和药敏试验，如培养48小时无菌生长，即报告“无细菌生长”。
4、报告结果4.1、涂片报告“找到革兰氏×性菌”，淋球菌要报告在白细胞内外是否发现革兰氏阴性双球菌。
4.2、对正常无菌部位的感染，从脓汁或分泌物分离到细菌，均有临床意义，按分离鉴定结果报告细菌名称及药敏试验。
病原生物学综合性实验一脓汁和粪便标本中病原菌的检测解析
综合性实验一脓汁和粪便标本中病原菌的检测从临床标本中分离细菌的目的是为了查找与疾病有关的病原菌，这对于临床治疗及预后调查是很有价值的。
所以，在分离时应掌握以下原则，以便指导检出病原菌，避免漏诊误诊。
1．了解微生物在人体的分布。
人体的很多部位与外界相通，存在正常菌群，分离时应注意标本中的菌群是正常菌群的污染，还是致病菌。
另外，机体的某些部位(如血液、骨髓)是无菌的，如检出细菌，应视为致病菌。
2．了解标本来源及临床情况，以便有目的地检出病原菌。
3．根据标本来源和可能存在的病原菌确定选用各种分离培养基，以提高检出率。
如血平板可用于化脓性链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌等的分离。
常见的化脓性病原菌有葡萄球菌、链球菌、淋球菌、脑膜炎球菌、肺炎链球菌、结核杆菌、假单胞菌、流感杆菌等。
脓汁标本在做细菌分离培养的同时，均须直接涂片检查，观察是否有典型形态的菌体，芽胞有无，为临床提供最初的诊治依据。
粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基(如SS、伊红美蓝平板，碱性蛋白胨水)，尽可能地抑制杂菌，以利于病原菌的检出。
粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。
粪便标本中因各种正常菌群含量甚多，仅以染色性和形态无法分辩是否为病原菌，因此，粪便标本一般不作直接涂片检查，只有检查霍乱弧菌、结核杆菌、疑似葡萄球菌或艰难梭菌引起的伪膜性肠炎，以及菌群失调时，才作直接涂片检查。
细菌鉴定工作的原则及基本方法是：1、必须用纯的细菌培养物作鉴定。
因为不同的细菌生化反应结果相差较大，而反应结果是以阳性或阴性表示的，一旦用混合菌做生化反应，结果不可分析。
2、鉴定方法的选择。
测定细菌特征的实验方法很多，应根据鉴定目的选择有价值的、快速简便的试验项目，既能完成鉴定，试验项目又尽可能少。
一、培养基的制备Preparation of Culture Media【实验目的】1了解细菌生长的基本营养条件。
为什么脓性标本
为什么脓性标本（分泌物或穿刺液）常常培养不出细菌答：1.脓标本细菌培养没有细菌生长，首先要明确标本里是有细菌而培养不出细菌，还是标本里本身没有细菌而培养不出细菌？结合标本直接涂片染色镜检可以解决标本中有无细菌的问题。
2.标本中的脓细胞可能是白细胞吞噬答：1.脓标本细菌培养没有细菌生长，首先要明确标本里是有细菌而培养不出细菌，还是标本里本身没有细菌而培养不出细菌？结合标本直接涂片染色镜检可以解决标本中有无细菌的问题。
2.标本中的脓细胞可能是白细胞吞噬掉细菌后中毒而死亡的尸体。
细菌被白细胞吞噬后，白细胞及死亡后的尸体释放出某些抑菌物质抑制了细菌的进一步繁殖。
3.深部脓液内本来是厌氧菌生长，用常规有氧条件培养，细菌不会生长。
4.标本中可能存在苛养菌或慢生长菌，但受接种的培养基、培养环境和培养时间等因素的影响，可能导致脓标本培养不出细菌。
5.患者体内残余抗生素抑制了细菌的生长。
6.标本采集、保存及送检过程方法不当也可能导致培养不出细菌。
那么如何做才能提高此类标本的阳性培养率呢？待补充！答复：1.脓标本的选择更大程度上依赖于感染的程度和性质而不是可疑的病原体。
2.对大多数开放伤口，采集前应先去除表面定植菌群。
3.除非有渗出物，干燥、结痂伤口，一般不做培养。
4.闭合脓肿应取渗出物和脓肿壁标本，不能用拭子采集标本，防止标本干燥及标本中可能存在的厌氧菌死亡。
5. 开放病灶和脓肿：尽量去除表面菌落，用拭子在病灶活动区域或基底部采集标本，置于需氧培养基中或运送培养基中送检。
也可对渗出液做需氧培养，开放病灶不能做厌氧培养。
创伤标本如没有炎性细胞可能说明采集了表皮正常菌群，与疾病过程无关，应重新采集。
6.不要仅送检脓液，因为脓液不能代表伤口特点，建议同时取活检标本检查，7.脓疱或水疱：酒精消毒使之干燥，对于患儿用23号针头挑破脓疱，拭子采集脓疱液和基底部标本，迅速送往实验室，1小时内不能培养应将标本冷藏。
8.在采集标本时，应注意无菌操作，以防带入与感染无关的皮肤定植菌。
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答：1.脓标本细菌培养没有细菌生长，首先要明确标本里是有细菌而培养不出细菌，还是标本里本身没有细菌而培养不出细菌？结合标本直接涂片染色镜检可以解决标本中有无细菌的问题。
2.标本中的脓细胞可能是白细胞吞噬掉细菌后中毒而死亡的尸体。
细菌被白细胞吞噬后，白细胞及死亡后的尸体释放出某些抑菌物质抑制了细菌的进一步繁殖。
3.深部脓液内本来是厌氧菌生长，用常规有氧条件培养，细菌不会生长。
4.标本中可能存在苛养菌或慢生长菌，但受接种的培养基、培养环境和培养时间等因素的影响，可能导致脓标本培养不出细菌。
5.患者体内残余抗生素抑制了细菌的生长。
答复：
1.脓标本的选择更大程度上依赖于感染的程度和性质而不是可疑的病原体。
2.对大多数开放伤口，采集前应先去除表面定植菌群。
3.除非有渗出物，干燥、结痂伤口，一般不做培养。
4.闭合脓肿应取渗出物和脓肿壁标本，不能用拭子采集标本，防止标本干燥及标本中可能存在的厌氧菌死亡。
5. 开放病灶和脓肿：尽量去除表面菌落，用拭子在病灶活动区域或基底部采集标本，置于需氧培养基中或运送培养基中送检。
也可对渗出液做需氧培养，开放病灶不能做厌氧培养。
创伤标本如没有炎性细胞可能说明采集了表皮正常菌群，与疾病过程无关，应重新采集。
6.不要仅送检脓液，因为脓液不能代表伤口特点，建议同时取活检标本检查，
7.脓疱或水疱：酒精消毒使之干燥，对于患儿用23号针头挑破脓疱，拭子采集脓疱液和基底部标本，迅速送往实验室，1小时内不能培养应将标本冷藏。
8.在采集标本时，应注意无菌操作，以防带入与感染无关的皮肤定植菌。
9.小儿要求：小儿感染常出现皮疹如水泡等，应在这些地方仔细采集标本培养以发现病原体。
10.应尽可能在使用抗生素前采集标本，若患者在采集标本前已用抗生素，应在检验申请单上注明应用的抗生素，并在下次用抗生素前采集标本。
11.采集标本时应注意标本的性状、色泽及气味，为分离鉴定致病菌提供依据。
12.标本采集后应在室温2h内送至微生物室接种处理，若不能及时送检，需氧培养的标本除对环境敏感的淋球菌、脑膜炎双球菌和流感嗜血杆菌等标本外，可保存在4 ℃冰箱中，但保存时间不超过24h。
13.需做厌氧培养的标本若不能及时送检，需室温保存，但保存时间不超过24h。