土壤中的微生物分离纯化和菌相分析
土壤微生物的分离及鉴定
微生物实验报告——土壤微生物的分离筛选纯化与鉴定山东大学生命科学学院2011级生物基地（周一下午*组）***同组者：指导老师：时间：2012年12月9日——2012年12月21日摘要利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，通过对菌落形态的观察、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果，通过查阅《伯杰氏系统细菌学手册》对照种属特征最终判断所分离纯化的细菌所属的属。
关键词土壤微生物，分离鉴定，生理生化，酶活测定，《伯杰氏系统细菌学手册》前言土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。
土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。
一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌数减少。
通过土壤微生物的分离纯化，得到纯种，再进行相关的实验，如：菌落观察、革兰氏染色、芽孢染色、生理生化试验等，根据实验结果，查阅《伯杰氏系统细菌学手册》确定所分离纯化细菌所属的属。
在此过程中熟悉相关操作。
一．实验目的1.学会设计实验方案；2.分离目的菌，掌握几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；3.复习巩固显微镜使用方法；4.复习配制培养基的一般方法和步骤、复习各种灭菌方法和操作步骤；5.复习、掌握细菌稀释分离、划线分离等技术。
复习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌的培养条件和培养时间。
复习平板菌落计数法；6.复习掌握细菌的简单染色、鞭毛染色、革兰氏染色的基本原理和操作方法，复习霉菌的小室培养法；7.复习生理生化试验的原理及操作方法，学习测定酶活的实验方法；8.学会利用《伯杰氏系统细菌学手册》对所分离纯化的细菌定属。
二．实验原理1.产果胶酶菌株的筛选配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。
实验3：细菌的分离与纯化
实验 3 微生物的纯种分离培养微生物广泛地分布在自然界的土样、水体、空气、动植物体表及人体、动物体的排泄物中。
它们以单个的菌体、无性孢子和芽孢的形式存在。
由于单一的自然界环境并不能完全满足微生物对水、空气、营养物质、温度、pH的综合要求，它们往往以散居”的状态出现，而不能形成人们肉眼可直接观察到菌落。
不同的自然环境中，微生物的种类和数量差异很大。
肥沃的土壤，富养化的水体，是许多微生物麇集、孳生的场所，在这里存活着能分解淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素、木质素、果胶、农药、含磷有机物（卵磷脂、肌醇、核酸等）、石油以及溶解铜矿的细菌、放线菌、真菌等多种类的微生物，如何根据微生物的生理要求，按照人类的需求，将它们从自然界中分离出来，获得纯种，发挥微生物的特长为人类的生产和生活服务，是微生物研究中最基础的实验技术。
一、实验目的：1．学会将混杂的各种微生物分离成纯种，统计分析样品中微生物的种类和数量的方法。
2．学会从菌落及培养特征区分细菌、酵母菌、放线菌和霉菌。
3．学会好氧微生物平板及斜面培养的方法。
二、实验原理：在自然界中，微生物的种类很多，数量很大，为了获得单个菌体，首先必须把要分离的材料进行适当的释放，按其生长所需要的条件，使其在平板上，由一个菌体繁殖成单个菌落，这样，就能从中挑选出所需要的纯种，由于细菌、放线菌和霉菌所要求的营养条件不同，利用不同的培养基制成平板进行分离，然后从菌落形态上的差异，可以把细菌、放线菌和霉菌三大类群区分并可计算出其数量，分别接种到试管斜面上，然后，在平板上反复进行分离培养，最后可获得纯种。
三、实验材料和用具：1．材料（1）土壤样品（ 2 ）培养基：①牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏蛋白胨培养基（% ）牛肉膏0.3-0.5g 蛋白胨1.0g NaCl 0.5g 琼脂2.0g 蒸馏水100mL pH 7.2-7.4 ，0.1Mpa 压力，灭菌20-30分钟。
配制液体培养基时不加琼脂；半固体培养基加0.3-0.5%琼脂。
微生物生态学中的菌群分析
微生物生态学中的菌群分析微生物生态学是研究微生物群落在地球上的分布、作用和相互作用的学科。
菌群分析是微生物生态学中最常用的方法之一，其主要目的是研究不同环境中微生物的种类、数量和群落结构，为环境研究及微生物资源的开发利用提供科学依据。
本文将围绕菌群分析的原理、方法和应用等方面进行阐述。
一、菌群分析的原理菌群分析的原理基于微生物在自然环境中存在着复杂的相互作用关系，菌群特征与环境因素之间存在着密切的关联。
不同环境条件下，微生物群落的组成、数量和种类都不同，且在不同时间和空间上也存在着变化。
因此，菌群分析的主要原理是通过研究微生物之间相互作用和与环境因子的关系，揭示微生物群落结构与功能之间的关联。
二、菌群分析的方法1. 高通量测序技术高通量测序技术是目前菌群分析中最常用的方法之一。
其基本原理是通过高通量测序仪读取大量微生物基因组DNA或RNA样品的序列信息，将其比对到数据库中并进行分析，从而确定微生物群落的组成和数量。
高通量测序技术因其高灵敏度和高精度等特点，已成为研究微生物群落多样性和功能的首选方法。
2. 扫描电镜技术扫描电镜技术主要应用于观察微生物群落的形态结构和形态特征。
该技术使用高能电子束扫描样品表面，产生反射电子和二次电子信号，通过检测信号的强度和位置来获得样品表面的形态信息。
扫描电镜技术可以对单个微生物细胞进行成像，并可观察到该细胞的形态、细胞壁等结构特征，有助于识别微生物类型并确定其形态特征。
3. 蛋白质组学技术蛋白质组学技术主要应用于检测微生物群落中存在的蛋白质，从而确定微生物群落结构和功能的关系。
该技术通过质谱仪检测样品中的蛋白质含量和分子量等信息，并通过比对数据库来鉴定样品中的蛋白质种类和数量。
蛋白质组学技术可以检测到微生物群落中存在的少量和低级别的蛋白质，有助于了解微生物群落的代谢、生长和信号通讯等方面的信息。
三、菌群分析的应用1. 土壤微生物菌群分析土壤微生物是土壤中包括细菌、真菌和原生动物等多种生物群落。
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年 10月16日一、实验目的和要求1.掌握微生物接种培养技术2.掌握微生物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。
在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。
为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。
2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途一般多用于筛选菌株。
实验二：土壤中微生物分离与纯化
了解并掌握微生物的生理生化特征， 如营养需求、代谢途径、酶活性等。
微生物纯化
在分离的基础上，进一步通过反复划 线培养或平板克隆培养，获得纯培养 的微生物。
熟悉微生物分离与纯化的实验操作流程
土壤样本采集
选择具有代表性的土壤样本， 采集时要避免污染，并记录采
样点的环境信息。
微生物的纯化
对分离得到的菌落进行纯化， 通过反复划线或平板克隆培养 ，获得纯培养的微生物。
菌落形态观察
观察纯化后的菌落形态，记录菌落 特征。
微生物的保存与鉴定
菌种保存
将纯化的菌株进行冷冻干燥或甘油保 藏，以备后续实验使用。
微生物鉴定
采用形态学、生理生化实验或分子生 物学方法对分离得到的菌株进行鉴定 。
04
CATALOGUE
实验结果与分析
微生物分离与纯化的结果观察
微生物分离
通过划线分离法，成功将土壤中的微生物分离到了培养基上，观察到菌落形态 各养基
根据目标微生物的特性， 选择适合的培养基。
培养
将土壤稀释液涂布或滴加 在培养基上，放入恒温培 养箱中培养。
观察与记录
观察微生物的生长情况， 记录菌落形态、颜色、大 小等特征。
微生物的纯化
挑选单菌落
从培养基上挑选单菌落，采用划 线法或稀释涂布法进行纯化。
纯化培养
将纯化的菌株进行多次划线培养或 传代培养，确保获得纯培养物。
01
微生物纯化的原理是利用微生物的单一特性进行分离，使同一种微生物在培养 基上形成单一菌落。
02
常用的微生物纯化方法包括划线分离法、稀释涂布平板法、显微操作法等。这 些方法可以根据不同微生物的特性选择使用，以获得纯培养。
03
土壤中微生物实验报告
一、实验目的1. 了解土壤中微生物的种类和数量；2. 掌握土壤微生物的分离和纯化方法；3. 熟悉微生物的形态和生理生化特性；4. 培养无菌操作和实验记录能力。
二、实验原理土壤是微生物生活的良好环境，其中含有大量微生物，包括细菌、放线菌、真菌、藻类、原生动物、噬菌体、病毒和线虫等。
微生物在土壤中发挥着重要作用，如土壤肥力的维持、植物生长的促进、有机物的分解等。
本实验通过分离和纯化土壤微生物，观察其形态和生理生化特性，进一步了解土壤微生物的种类和功能。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖、酵母提取物、琼脂、无菌水、无菌平板、无菌移液器、显微镜、培养箱等。
2. 实验仪器：天平、酒精灯、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、无菌操作台等。
四、实验方法1. 土壤样品的采集：选取有代表性的土壤样品，注意样品的均匀性和代表性。
2. 土壤微生物的分离和纯化：a. 制备牛肉膏蛋白胨培养基，高压蒸汽灭菌后备用；b. 将土壤样品与无菌水按1:10的比例混合，充分搅拌；c. 将混合液进行系列稀释，取适量稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上；d. 将平板倒置放入恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况；e. 挑取单个菌落进行纯化，重复以上步骤，直至获得纯菌株。
3. 微生物的形态观察：a. 将纯菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养后进行显微镜观察；b. 观察菌体的形态、大小、排列方式等特征。
4. 微生物的生理生化特性测定：a. 对纯菌株进行革兰氏染色，观察菌体的染色特性；b. 进行糖发酵试验，观察菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类的分解能力；c. 进行氧化酶试验，观察菌株的氧化酶活性。
五、实验结果与分析1. 土壤样品的微生物数量：通过平板计数法，估算土壤样品中的微生物数量。
2. 微生物的分离和纯化：成功分离和纯化出多种微生物，如细菌、放线菌、真菌等。
3. 微生物的形态观察：观察到的菌体形态、大小、排列方式等特征与文献报道相符。
微生物细菌分离培养实验报告
微生物细菌分离培养实验报告土壤微生物的分离培养技术实验报告重庆大学研究生专业实验教学实验报告书实验课程名称:实验指导教师:学院: 专业及类别: 学号: 姓名: 实验日期: 成绩:重庆大学研究生院制一、实验目的1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法;2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术;;3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能;4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。
二、实验原理1、培养基的种类培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。
一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。
培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基;根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。
微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。
本实验就是使用的固体培养基。
已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。
培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。
2、接种方法与无菌接种将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。
接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。
接种的关键是要严格的进行无菌操作。
微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。
划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。
常用的接种工具为接种环、针等。
在斜面接种和平板划线中就常用此法。
三点接种是把少量的微生物接种在平板表面，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察研究它们的形态。
研究霉菌形态时就常用此法。
微生物学实验报告
微生物学实验报告（格式标准）(生命科学专业)*****目录索引实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 3实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5实验三常用培养基的配制7实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8实验五、微生物大小的测定与显微计数10实验六环境中微生物的检测和分离纯化11实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12实验八（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化13课程名称：微生物学实验班级：化生系生命科学本科实验日期：指导教师：黎勇实验一油镜的使用和细菌的简单染色法〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的运动性的基本方法。
〔基本原理〕1. N·A=n·sinα2. D=λ/2N.A3. 目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。
已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。
4. 用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。
〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的B.subtilis. S.arueus 菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。
〔方法步骤〕：（一）油镜的使用镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触）粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正）仔细观察并绘图取出装片，清洗油镜：擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留（用手指辅助，迅速拭擦一、二次）用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯（2-3次）。
（二）细菌的简单染色法：涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察（三）细菌运动性的观察取洁净盖玻片，四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察〔结果分析〕1、画一圆圈表示视野，选取所观察的微生物绘图，注意特殊结构、形状和排列。
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（二）平板划线分离法
1.倒平板 2.划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环， 挑取待测菌悬液一环在平板上划线。划线的方法很 多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将 样品在平板上进行稀释，培养后能形成单个菌落。
划线方法 方法一：用接种环按无菌操作挑取土壤悬液一环， 先在平板培养基的一边作第一次平行线3-4次，再 转动平板约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷 却后挑取悬液穿过第一次划线部分进行第二次划线， 再用同样的方法穿过第二次划线部分进行第三次划线 或再穿过第三次划线部分进行第四次划线。划线完毕 后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。 方法二：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连 续划线，完毕后，盖上培养皿盖，温室培 养。
二、实验原理
三、实验器材
1.土壤 2.培养基： 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（营养琼脂）（50μg/mL制霉菌素 乙醇溶液） 高氏一号琼脂培养基（10滴100g/L石碳酸和50μg/mL制霉菌 素乙醇溶液） 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（1000mL培养基中加入2mL氯霉素） 3.溶液与试剂： 9mL或4.5mL无菌水的试管，90mL无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶
这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。 但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各 种因素的影响。
二、实验步骤（方法一）
1.编号：取无菌培养皿6套，分别用记号笔表明 10-4、10-5、10-6各2套。另取6支4.5mL无菌水 的试管，依次表明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6。 2.稀释：用1mL无菌吸管准确吸取0.5mL已充分混匀 的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合培养液，加入标 有10-1字样的试管中，此为10倍稀释，吸管中多余的菌 液放回试管中。将10-1试管在手掌中或置于振荡器上振 荡，使菌液充分混匀。另取一支1mL吸管插入10-1试管 菌液中吸取1mL，精确的放0.5mL菌液于10-2试管中， 此为100倍稀释……其余依次类推直至所需倍 数。
5.计数：培养48h后取出培养平板，根据统计的 菌落数，计算出同一稀释度2个平板上的菌落平 均数，按下列公式进行计算：
每毫升样品中菌落形成单位（CFU/mL） =同一稀释度2次重复菌
霉菌
霉菌
酵母
实验方法二
1. 编号：取无菌培养皿6套，分别用记号笔表明 10-4、10-5、10-6各2套。另取6支4.5mL无菌水 的试管，依次表明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6。 2.稀释：用1mL无菌吸管准确吸取0.5mL已充分混匀 的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合培养液，加入标 有10-1字样的试管中，此为10倍稀释，吸管中多余的菌 液放回试管中。将10-1试管在手掌中或置于振荡器上 振荡，使菌液充分混匀。另取一支1mL吸管插入10-1试 管菌液中吸取1mL，精确的放0.5mL菌液于10-2试管 中，此为100倍稀释……其余依次类推直至所需倍数。
4.培养：将平板倒置于37℃温室中培 养1-2d。 5.挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许 菌苔接种在不同培养基的斜面上，置37℃/28 ℃培 养；待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将 细胞图片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物 细胞。若发现有杂菌，须再进行一次分离与纯化直 到获得纯培养。
土壤中的微生物分离纯化和 菌相分析
一、实验目的
掌握用平板分离法和划线分离法分离土 壤中的微生物（好气性细菌、放线菌和 一般真菌）。
• 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某 一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。 • 分离微生物时一般是根据该微生物对营养、PH、 氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件， 或加入某种抑制剂造成只利于该菌生长，不利于 其他菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。 • 微生物分离纯化的方法主要有：平板划线分离法 和稀释涂布平板法。后者除能有效分离纯化微生物 外，还可用于测定样品中活菌数量。
3.倒平板：倒入熔化后冷却至45℃左右的牛肉 膏蛋白胨琼脂培养基约15mL于平皿中，置水平 为止，迅速旋动平皿，待培养基凝固后备用并 标号。 4.取样：用3支1mL的无菌吸管分别吸取10-4、10-5和 10-6稀释菌悬液各0.2mL，放入已标号的平板中，涂 布。静置半小时后，将平板倒置于37℃恒温培养箱 中培养后计数。
实验报告
1描述分离纯化的各种微生物菌落的特性。 2将培养后菌落计数结果填入下表： 稀释度 次数 菌落数 每毫升样品中菌落形成单位（CFU/mL） =同一稀释度2次重复的平均菌落数×稀释倍数×5 1 10-4 2 平均 10-5 1 2 平均 1 10-6 2 平均 CFU/mL
四、操作步骤
（一）稀释涂布平板法 1.倒平板：将培养基加热溶化，保温5560℃，每个培养皿倒入15-20mL培养基，静置 冷却固化。
倒平板的方法：
右手持盛培养基的试管或三角烧瓶置火焰旁边， 用左手将试管塞或瓶塞轻轻的拔出，试管口或瓶口保 持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹 住试管塞。左手持培养皿并将皿盖在火焰旁打开一缝， 迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使 培养基均匀分布在底皿底部，然后平置于桌面上，待 凝后即为平板。
平板划线操作图
A 分段划线
B 连续划线
3.挑菌落：从分离的平板上单个菌落挑取 少许菌苔于不同培养基斜面上，做锯齿状划 线，37℃培养后，涂在载玻片上，在显微镜 下观 察细胞的个体形态，结合菌落形态特 征，综合分析。如不纯，仍需平板分离法进 行纯化，直至确认为纯化培养为止。
活菌计数
一、实验原理
平板菌落计数法（活菌计数）是根据微生物在固 体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖 而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个 单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再 取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分 布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生 长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品 中的含菌数。
倒平板
2.制备十倍梯度菌稀释液：用一支1mL无菌 吸管吸取0.5mL菌悬液加入4.5mL无菌水的 试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类 推制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6六种十倍 梯度稀释的菌悬液。
从土壤中分离微生物 的操作过程
3.涂布：将上述每种培养基的平板底部或培养 皿盖周边用记号笔分别写上10-4、10-5和10-6三种 稀释度字样，每种培养基每稀释度标记2皿，然后 用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6 三管菌悬液中吸 取适量对号放入已写好稀释度的平板中央位置， 每皿准确放入0.2mL，用无菌玻璃涂布棒在培养基表 面轻轻涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻 的来回推动，使之分布均匀，然后改变方向90°沿另 一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂布 棒在涂布几次，室温下静置5-10min。
3.用3支1mL的无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6 稀释菌悬液各0.2mL，放入已灭菌的平板中，然后 倒入冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基约 15mL，迅速旋动平皿，混匀培养基和菌稀释液，后静 置凝固，倒置于37℃恒温培养箱中培养后计数。 4.计数：培养48h后取出培养平板，根据统计的菌落 数，计算出同一稀释度2个平板上的菌落平均数，按 下列公式进行计算： 每毫升样品中菌落形成单位（CFU/mL） =同一稀释度2次重复的平均菌落数×稀释倍数×5