中文操作手册 phosflow 小鼠脾细胞 胸腺细胞-9
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
T细胞表面标志及其亚群
CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（help T cell,Th）
CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 细胞毒性 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）
CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）
B细胞表面标志
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、 MACS
2. 根据细胞理化性质 ： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
部分 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分 CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg 分子 为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。
CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞 ， B1 细 胞 为 CD19 和 CD5 双 阳 性 ， 而 B2 细 胞 仅 为 CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。
脾
脾（spleen ）位于腹腔的左上方，是机体内最大的淋 巴器官，呈扁椭圆形，暗红色、质软而脆。
脾脏功能
脾在正常情况下，只产生淋巴细胞及单核细胞，但在病 态及大失血后可产生各种血细胞。脾主要功能是参与免 疫反应，脾内的巨噬细胞能吞噬和清除衰老的红细胞， 细菌和异物，产生淋巴细胞，及单核细胞，贮存血液。 胚胎时期可造血。脾脏在胚胎时期是一个重要的造血器 官，出生后能产生淋巴细胞和单核细胞。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法[发明专利]
![小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/e5baff22cd7931b765ce0508763231126edb77a6.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710321625.1(22)申请日 2017.05.09(71)申请人 成都扬克斯生物科技有限公司地址 610094 四川省成都市高新区益州大道中段722号4栋14楼1404号(72)发明人 彭西 于正强 胡东 李林蔚 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350代理人 汤东凤(51)Int.Cl.G01N 15/14(2006.01)(54)发明名称小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法(57)摘要本发明公开了一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；分别吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色；染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。
本发明成功建立了稳定规范的流式细胞术检测小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的方法，通过对样品前处理、检测和分析过程中的目标细胞选取、补偿调节及参数选择的问题进行改进，避免了试验过程中人为因素造成的误差，提高了结果判断的真实性和客观性。
权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 107132177 A 2017.09.05C N 107132177A1.一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；步骤2，吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入两支流式上机管中一支管中加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体，旋涡混匀，于4℃避光染色，用作检测管；另一支用作阴性设置管；步骤3，染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；步骤4，分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。
复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1）健康小鼠2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3）70汇醇4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK5）0.2%台盼蓝6）细胞计数板、计数器7）离心机8）显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3 计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml3.4 计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为：324- 16/324 X 100%=95.1%在理论范围之内4 实验结果4.1 研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
小鼠脾细胞的制备实验报告
小鼠脾细胞的制备实验报告摘要：
本实验旨在制备小鼠脾细胞，以便进行细胞培养。
通过酶解法和筛选法，成功地制备出了小鼠脾细胞，并进行了初步的鉴定。
材料和方法：
材料：小鼠脾脏，胰蛋白酶，DNA酶，PBS缓冲液，10% FBS 培养液。
方法：
1. 将小鼠用无菌手术刀杀死，取出脾脏，置于PBS缓冲液中。
2. 用无菌手术刀将脾脏切成小块，压碎后加入胰蛋白酶和DNA酶的混合液中，37℃水浴1h。
3. 过筛除去组织团块，收集过滤液。
4. 添加PBS缓冲液，离心定居细胞。
5. 吸上一定数量的10% FBS培养液，放入培养皿中，放入恒温培养箱中，37℃、5% CO2培养。
结果：
经过培养，小鼠脾细胞成功地进行了增殖。
细胞表现出了明显的亲和性，形态也比较正常。
经检测，成功制得小鼠脾细胞。
结论：
通过酶解法和筛选法，本实验成功地制备出了小鼠脾细胞。
它们可以进行细胞培养，被用于后续实验研究中。
小鼠脾细胞分离+CFSE染色步骤
小鼠脾细胞分离+CFSE染色步骤小鼠脾脏淋巴细胞分离与CFSE染色步骤实验材料：小鼠1只、组织剪1把、镊子2把、75%酒精、小鼠固定板、1640培养液（10%FBS，1%双抗）、含0.1%FBS的PBS溶液（无菌）、PBS溶液（无菌）、ACK溶液（无菌）、移液管、枪头、组织研磨棒（无菌）、12孔细胞培养板、15mL离心管、300目尼龙网（无菌），细胞计数板，手术台布。
实验前准备工作：做好上述实验器具的灭菌工作；将手术台布裹在小鼠固定板上，喷75%酒精，组织剪和镊子用75%酒精浸泡后置于生物安全柜中紫外照射30min；实验步骤：1. 取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中5min。
2. 取出小鼠将其固定于固定板上，用组织剪和镊子沿小鼠腹白线剪开腹腔，拨开小肠在腹腔左上方紧贴小肠部位取褐红色长条型脾脏，用组织剪剪开筋膜同时不要把脾脏剪破，将取下的脾脏用PBS冲洗两遍，剪去脾脏上连接的结缔组织。
3. 将脾脏转移入组织研磨棒中，向其中加入2mLPBS溶液后研磨三下，尽量不残留较大组织块；再用3ml PBS冲洗研磨棒后，将脾脏研磨液经300目尼龙网过滤至15mL离心管中，再用2ml PBS冲洗研磨器内壁，同样过滤至15mL离心管中，离心500g，5min。
4. 弃上清后，加入2mL 常温ACK，轻微吹打，裂解红细胞1min 后加入等体积（2mL）PBS 终止裂解，轻微吹打细胞混匀后离心500g，5min。
CFSE染色开始：5. 弃上清，用4ml PBS（0.1%FBS）重新混匀细胞，反复吹打为单细胞悬液，再用300目尼龙网过滤。
取10μL细胞液于细胞计数板上计数，并将细胞浓度调至1.0×107/ml。
6. 提前将CFSE按照说明书配成5mM母液并2ul分装储存于-80冰箱备用，其工作浓度为0.5-25μM.7. 分出一部分细胞加入24孔板中，用于做CFSE空白对照8. 2μlCFSE + 6ml浓度1.0×107/ml的细胞，工作浓度约为1.67μM，37℃，10min，避光。
小鼠尾静脉取血和脾淋巴细胞分离
小鼠尾静脉取血和脾淋巴细胞分离小鼠尾静脉取血所需器材：热光源（如：普通台灯），鼠尾固定器，刀片，1.5mlEP管。
步骤：1.烘烤。
用热源烘烤小鼠使其血管膨胀。
烤至小鼠开始有剧烈反应时，关掉热源。
2.割尾。
烤完后将小鼠固定将尾部露在外面，用刀片割一下鼠尾远心端腹侧静脉血管使血液流出，立即用1.5mlEP收集滴下来的血液。
3.止血。
用干棉球按压伤口或按压尾部近心端止血，以防失血过多死亡。
要点1.烤：烤的不够：血管未膨胀，割尾后血液不易流出。
烤的太过：小鼠死亡。
2.割：割的太浅：血液不流出。
割的太深：鼠尾被割断。
后续应用：取血时可根据需要选择是否需加抗凝剂。
所取血可用于血液学指标的检测，如EPO浓度、甘油三酯浓度、红细胞数及红细胞压积等。
附表：本实验室常用的2种取血方法的比较尾静脉取血VS 眼眶后静脉丛取血小鼠脾淋巴细胞分离所需器材（以下均为取1只鼠脾需准备的量）：手术器械——剪刀、镊子至少2套（高压灭菌），止血钳一个（高压灭菌），细头玻璃吸管一根（高压灭菌），，200目尼龙网一张（高压灭菌），一次性5ml注射器一支，15ml和50ml离心管各一个，60mm 中皿及血球计数板一块。
所需试剂：小鼠淋巴细胞分离液，无血清1640，进口血清，青链霉素（双抗）（100X），NEAA，丙酮酸钠，谷氨酰胺，β-巯基乙醇注：200目尼龙网和小鼠淋巴细胞分离液均从达科为公司购买。
分离原理示意图图一小鼠脾脏研磨示意图图二离心后小鼠脾细胞分层示意图分离步骤及要点：1.断颈处死小鼠，75%乙醇中浸泡几分钟消毒。
2.将小鼠转移至超净台中，先用一套剪刀和镊子剪开小鼠皮肤使腹腔内脾脏可见。
换一套干净的剪刀和镊子剪开腹腔，小心用镊子夹出脾脏，用剪刀尽量去除附着其上的脂肪组织。
脾脏位于小鼠左侧腹部，为一暗红色长条形器官，不要误取肾和肝。
取出后浸泡于RPMI1640中稍作清洗。
注意无菌操作。
3.在一无菌的中皿中加入5ml淋巴细胞分离液，用止血钳将尼龙膜固定在中皿上，放上脾脏开始研磨（如图一所示）。
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
NK细胞表面标志
人类细胞表面标志主要以 CD16、CD56来 认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴 细胞认定为NK细胞。
流式细胞术(FCM)
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光 与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新 技术结合，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FAC： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：实验地点：实验人：1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1)健康小鼠2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3)70%乙醇4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）5)0.2%台盼蓝6)细胞计数板、计数器7)离心机8)显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min，弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml3.4计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为：324-16/324×100%=95.1%在理论范围之内4实验结果4.1研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
小鼠脾细胞/胸腺细胞BD Phosflow™ 操作流程Protocol I (Detergent Method)所需试剂：试剂准备：按照说明书用双蒸水或者去离子水制备1X Lyse/Fix Buffer （货号：558049）。
使用前37°C 预热15-30分钟。
按照说明书用双蒸水稀释制备1 x Perm/Wash Buffer I （货号：557885）。
放置至室温后使用。
操作步骤：1.取小鼠组织样本（如脾脏，胸腺，骨髓等），用PBS或完全培养基制备单细胞悬液2. 350g 离心6- 8 分钟，弃上清3. 混匀细胞（此步动作需要轻柔）4. 以1–10 x 106 cells/mL的浓度将细胞重悬于PBS或完全培养液中。
必要时可以用70μm 的滤器过滤去除细胞团块。
5. （选做步骤）因前处理过程对细胞信号通路有一定程度的刺激，所以有些细胞需要在前处理完成后，可以在完全培养基中静息2-4小时，以保证细胞恢复到未受刺激状态（参见操作说明）。
6. 用适当的刺激剂处理细胞，37°C 孵育适当的时间（1到30分钟，参见操作说明）。
实验需设立未处理样本为阴性对照。
7. 刺激处理完毕后，迅速加入10倍体积的、预热的Lyse/Fix Buffer 裂解固定细胞。
振荡器低速振荡混匀5-10次。
8. 37°C 孵育10-12分钟。
9. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
10. 振荡器低速振荡混匀细胞。
11. 细胞清洗：a．加入与Lyse/Fix Buffer相等量的stain buffer试剂（货号：554656）。
b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c．振荡器低速振荡混匀细胞。
12.（选做步骤）：为保证实验结果，若以上步骤红细胞裂解不充分，继续用溶血剂裂解细胞，但此步骤不得超过2次。
13. 于1–10 x 10^6细胞中加入1ml （最少1ml）Perm/Wash Buffer I进行细胞破膜。
轻柔混匀后，室温孵育15-30分钟。
14. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
15．振荡器低速振荡混匀细胞。
16. 细胞清洗：a．加入与1ml Perm/Wash Buffer I。
b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c．振荡器低速振荡混匀细胞17. 用Perm/Wash Buffer I重悬细胞，使细胞终浓度为5–10 x 106 cells/mL。
18. （选做步骤）每1 x 10^6细胞中加入0.06 μg Fc 封闭抗体（货号：553141 or 553142）。
混匀后冰浴15分钟。
19. 取100 μL 细胞悬液（0.5–1 x 10^6细胞）置于12 x 75-mm BD Falcon™试管中，参考抗体说明书推荐用量加入相应BD Phosflow抗体。
20. 混匀后室温避光孵育60分钟。
21. 细胞清洗：a．加入至少3ml Perm/Wash Buffer I。
b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c．振荡器低速振荡混匀细胞。
22．加入约500 μL的Perm/Wash Buffer I重悬细胞，混匀后上机检测。
Protocol II and III (Mild or Harsh Alcohol Method)**根据所用的表面标记抗体和特异性磷酸化蛋白抗体选择使用Perm Buffer II或者Perm Buffer III 。
更多信息请详见如下链接：Tested Surface Markers及BD FACSelect™ Buffer Compatibility Resource .所需试剂：试剂准备：按照说明书用双蒸水或者去离子水制备1X Lyse/Fix Buffer （货号：558049）。
使用前37°C 预热15-30分钟。
Perm Buffer II（货号：558052）或 III（558050）用前需置于-20°C-4°C预冷。
操作步骤：1.取小鼠组织样本（如脾脏，胸腺，骨髓等），用PBS或完全培养基制成单细胞悬液2. 350g 离心6- 8 分钟，弃上清3.混匀细胞（此步动作需要轻柔）4. 以1–10 x 106 cells/mL的浓度将细胞重悬于PBS或完全培养液中。
必要时可以用70μm 的滤器过滤去除细胞团块。
5. （选做步骤）因前处理过程对细胞信号通路有一定程度的刺激，所以有些细胞需要在前处理完成后，在完全培养基中静息2-4小时，以保证细胞恢复到未受刺激状态（参见操作说明）。
6. 用适当的刺激剂处理细胞，37°C 孵育适当的时间（1到30分钟，参见操作说明）。
实验需设立未处理样本为阴性对照。
7.刺激处理完毕后，迅速加入10倍体积的、预热的Lyse/Fix Buffer 裂解固定细胞。
振荡器低速振荡混匀5-10次。
8. 37°C 孵育10-12分钟。
9. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
10. 振荡器低速振荡混匀细胞。
11.细胞清洗：a．加入与Lyse/Fix Buffer相等量的stain buffer（货号：554656）。
b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c．振荡器低速振荡。
12.（选做步骤）：为保证实验结果，若以上步骤红细胞裂解不充分，继续用溶血剂裂解细胞，但此步骤不得超过2次。
13．于1–10 x 10^6细胞中加入1ml （最少1ml）预冷的Perm Buffer II或 II进行细胞破膜。
振荡器低速振荡，冰浴30分钟。
14. 清洗细胞：a. 加入至少3ml Stain Buffer重悬细胞（对应每1ml Perm Buffer）。
b. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c. 振荡器低速振荡混匀细胞。
15. 重复清洗细胞2次：a. 加入与步骤9中相等量的Stain Buffer。
b. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c. 振荡器低速振荡混匀细胞。
d.重复步骤a-c。
16. 将细胞重悬于Stain Buffer，使细胞终浓度为5–10 x 10^6 cells/mL。
17. （选做步骤）每1 x 10^6细胞中加入0.06 μg Fc 封闭抗体（货号：553141 or 553142）。
混匀后冰浴15分钟。
18.取100 μL 细胞悬液（0.5–1 x 10^6细胞）置于12 x 75-mm BD Falcon™试管中，参考抗体说明书推荐用量加入相应BD Phosflow抗体。
19. 混匀后室温避光孵育60分钟。
20. 细胞清洗：a．加入至少3ml Stain Buffer。
b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c．振荡器低速振荡混匀细胞。
21．加入约500 μL的Stain Buffer重悬细胞，混匀后上机检测。
Protocol IV (Harsh Detergent Method)所需试剂：试剂准备：按照说明书用双蒸水或者去离子水制备1X Lyse/Fix Buffer （货号：558049）。
使用前37°C 预热15-30分钟。
按照说明书用1X PBS稀释制备1X 或 0.5X Perm Buffer IV （货号：560746）。
使用前置于室温。
根据操作说明及如下链接BD FACSelect™ Buffer Compatibility Resource 选择使用1X 或 0.5X Perm Buffer IV。
因Perm Buffer IV破膜能力最强，针对Perm Buffer IV的操作过程中，有Perm Buffer IV存在情况下的振荡、混匀动作必须轻柔，以防细胞破碎。
操作步骤：1.取小鼠组织样本（如脾脏，胸腺，骨髓等），用PBS或完全培养基制备单细胞悬液2. 350g 离心6- 8 分钟，弃上清3. 混匀细胞（此步动作需要轻柔）4. 以1–10 x 106 cells/mL的浓度将细胞重悬于PBS或完全培养液中。
必要时可以用70μm 的滤器过滤去除细胞团块。
5. （选做步骤）因前处理过程对细胞信号通路有一定程度的刺激，所以有些细胞需要在前处理完成后，在完全培养基中静息2-4小时，以保证细胞恢复到未受刺激状态（参见操作说明）。
6. 用适当的刺激剂处理细胞，37°C 孵育适当的时间（1到30分钟，参见操作说明）。
实验需设立未处理样本为阴性对照。
7. 刺激处理后，迅速加入10倍体积的、预热的Lyse/Fix Buffer 裂解固定细胞。
振荡器低速振荡混匀5-10次。
8. 37°C 孵育10-12分钟。
9. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
10. 振荡器低速振荡混匀细胞。
11.细胞清洗：a．加入与Lyse/Fix Buffer相等量的stain buffer（货号：554656）。
b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。
c．振荡器低速振荡混匀细胞。
12.（选做步骤）：为保证实验结果，若以上步骤红细胞裂解不充分，继续用溶血剂裂解细胞，但此步骤不得超过2次13. 向0.5–2.0 x 10^6细胞中缓慢、滴加1ml （最少1ml）预冷的Perm Buffer IV进行细胞破膜。
振荡器低速振荡混匀细胞，室温孵育15-20分钟。
14. 600g 离心6-8分钟，弃上清，将流式管倒置在吸水纸上，吸去多余液体，试管中残余液体量不多于50μL 。
15. 振荡器低速振荡混匀细胞。
16. 清洗细胞2次：a. 加入至少3ml Stain Buffer。
b. 600g 离心6-8分钟，弃上清，将流式管倒置在吸水纸上，吸去多余液体，试管中残余液体量不多于50μL。
c. 振荡器低速振荡。
d.重复步骤a-c。
17. 将细胞重悬于Stain Buffer，使细胞终浓度为5–10 x 10^6 cells/mL。
18.（选做步骤）每1 x 10^6细胞中加入0.06 μg Fc 封闭抗体（货号：553141 or 553142）。
混匀后冰浴15分钟。
19. 取100 μL 细胞悬液（0.5–1 x 10^6细胞）置于12 x 75-mm BD Falcon™试管中，参考抗体说明书推荐用量加入相应BD Phosflow抗体。
20. 混匀后室温避光孵育60分钟。
21. 细胞清洗：a．加入至少3ml Stain Buffer。
b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。