菌与噬菌体的防治

（1）无菌检查
染菌通常通过3个途径发现：无菌试验、发酵液直接镜 检、发酵液的生化分析。其中无菌试验是判断染菌的主要 依据。
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无菌试验方法有双碟培养、斜面培养、肉汤培养等， 其中以双碟和肉汤培养为主。
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（2）染菌的判断
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以肉汤和双碟培养的反应为主，镜检为辅。
每8h一次的无菌检查，至少用2只酚红肉汤及பைடு நூலகம்只双碟同时 取样。
有关种子操作的制度要严格遵守；摇瓶瓶塞要确保严密。
⑥ 无菌试验 无菌试验要严格取样操作，力求减少误差。应同时用 肉汤和双碟作对照，以便迅速作出判断。当发现染菌时， 要通过分辨菌型来探索菌源，并对杂菌做耐热试验考察。 如果怀疑种子罐染菌，则种子不能轻率进发酵罐。
3、 无菌检查与染菌的处理 为了防止在种子培养或发酵过程中污染杂菌，在接种前 后、种子培养及发酵过程中分别进行无菌检查，以便及时 发现染菌，并在染菌后及时进行必要处理是很重要的。
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工厂本身的排放物有时也给重复污染提供了噬菌体来源。 生产过程中发酵气体排出，可以带有大量的生产菌。
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在生产罐污染有少量噬菌体（尚可进行生产）时，噬菌 体也被排到环境中，造成恶性循环。
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废弃的发酵液处理不当可以成为难以对付的污染源。
2、 噬菌体污染与发酵异常
噬菌体污染后的情况因发酵工业的种类、污染的噬菌 体特性、污染时间、感染复度（即培养物内的噬菌体与细 菌的比率）、培养基成分、发酵罐内的物理和化学条件不 同而异。即使同样的噬菌体并不一定引起同样的异常发酵 情况。
③ 用量要小，要经济。
有些噬菌体感染需要双价阳离子(Ca2+、Mg2+)吸附或 DNA注射才能进行。使用络合剂可获得较好的效果，如0.20.3%多磷酸钠、0.1-0.2%肌醇六磷酸 (phytic acid)、0.2-0.5%柠 檬酸或草酸等可抑制乳糖发酵短杆菌的噬菌体。
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非离子去污剂如聚乙烯二醇酯酸、聚羟乙烯烷基醚、吐 温20、吐温60均能明显地抑制噬菌体吸附、复制，或引起流 行性感染。
1、噬菌体的污染源
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噬菌体广泛地存在于适合宿主生存的泥土、污水和空气中；
发酵工业生产菌的噬菌体可以从异常发酵液和工厂环境中分 离出来，溶源性细菌也混杂在工厂周围环境的细菌中；
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一个新的发酵工厂往往在投产不久便会出现噬菌体污染；
研究认为，当有许多细菌存在时，相应的噬菌体就会马上出 现，其浓度在自然条件下很容易增高。
一般来说，噬菌体污染引起的异常发酵有以下表现：
（1）污染较轻，或在发酵末期污染，则使发酵过程减慢或降 低发酵产率。也有的行业在这种情况下产率反而增高； （2）在细菌对数生长期污染，而且污染量大，就会造成细菌 溶解，发酵终止。
噬菌体污染后可以观察到糖消耗减慢，pH异常变化，产 气减少，发酵稀薄，继之活的生产菌减少。通过测定可过滤 性、传染性、宿主特异性、溶菌斑形成能力和电镜观察来鉴 别异常发酵中的噬菌体。
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（3）工艺操作
① 空罐准备
放罐后应进行全面检查和清洗。要清理罐内残渣，去除罐 壁污垢，清除空气分布管、温度计套管等处堆积的污垢及罐内 的“死角”。要防止端面轴封漏气、搅拌添料箱及阀门渗漏等。 蛇管和夹层要按设计规定的压力定期试压。空消时应先将罐内 空气排尽，保持蒸汽畅通，阀门、管道均要彻底灭菌。
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无菌试验时，如果肉汤连续3次变色（红→黄）或产生浑 浊，或双碟培养连续3次有杂菌菌落，即判断为染菌。
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（3）染菌率的统计
以发酵罐染菌批（次）为基准，染菌罐批（次）应 包括染菌重消的重复染菌批（次）在内。整个发酵周期 中，无论前期或后期染菌，均作“染菌”论处。
发酵（罐）染菌批（次 ） 染菌率 100% 总投罐批（次）
（4）染菌的处理
发现染菌后，应立即根据染菌的种类及产生菌的菌龄等 ◆ 种子罐染菌后，种子不能再接入发酵罐中，这时可用备用 具体情况分别进行处理。除据染菌时间及危害程度对污染 种子接种。如无备用种子，则可选一适当培养龄的发酵罐培 罐进行挽救或处理外，对有关设备也应进行处理。 养物作种子，即生产上所说的“倒种”。 发酵罐前期染菌后，如培养基中C、N含量尚高，则可重新 灭菌，接种后再运转；若染的杂菌危害性较大，则放掉部分 料液，补入新料液，重新灭菌、接种。
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发酵中后期染菌或前期染菌轻微而发现较晚时，可加入适当 的杀菌剂或抗生素；或把高单位的后期发酵液压一部分到染菌 罐中，抑制杂菌生长速度；或者降低罐温，减缓杂菌繁殖速度。
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二、噬菌体污染的防治
在国内外，发酵工业中噬菌体的危害是一个普遍的问 题。对于丙酮丁醇、氨基酸、酶制剂和抗生素等发酵都有 噬菌体的危害，所带来的经济损失是相当惊人的。
根据谷氨酸发酵情况分析，染菌原因以
设备问题（设备渗漏、管道不严、设备死角）和 空气问题（过滤器不严、过滤器失效、过滤器受 潮）为主， 种子（二级种子染菌）次之，
而培养基消毒不透的情况较少。
2、 防止染菌要点
（1）空气系统
提高空压机进口空气的洁净度、防止空气带油、水及过 滤器失效。
如提高空压机吸气口位臵并加强压缩前的过滤；防止空 气冷却器漏水而进入空气系统；在空气过滤器灭菌时要防止 冲翻介质而短路，防止烤焦介质或着火；装填纤维介质时要 压紧；操作中要防止空气的压力剧变和流速激增等。
抗噬菌体突变株应具备以下特征：
1）对以前出现过的噬菌体都具有抗性； 2）为非溶源菌；
3）具有与原始菌株相当或更高的生产能力；
4）没有回复突变成噬菌体敏感株的能力。
（3）使用抑制噬菌体复制的化学药物
药物必须具有以下性质：
① 选择性抑制噬菌体而不影响宿主菌生长或发酵过程；
② 在食品发酵工业上要求该化学物质不影响产品质量；
喷洒氯化物或杀藻胺(benzalkonium chloride)气溶胶能杀 灭活噬菌体，紫外线照射用作一种额外的保护措施。漂白 粉(0.2%)、阳离子表面活性剂（如季铵盐0.01%0.1%）和福 尔马林（1%）均可单独使用，如果必要也可联合使用。
（2）选用抗噬菌体突变株
对付噬菌体污染的一个措施就是分离抗正在污染的 噬菌体的细菌突变株，用于发酵生产上。
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防止杂菌和噬菌体污染是保证发酵正常 进行的关键之一
一、杂菌污染的原因与防治
1、 从染菌的现象分析染菌的原因
1）从染菌的时间分析 2）从污染的杂菌类型分析 ● 早期（如接种后12 h或24 h），除了种子带菌外，主要 是培养基或设备灭菌不彻底。 ● 污染耐热的芽孢杆菌，多数是因培养基灭菌不彻底或 3）从发酵罐及批次分析 ● 相反，中、后期染菌则可能与中间补料、设备渗漏以 设备存在死角所致； 及操作不合理等有关，也可能是空气过滤器不严所致。 大批发酵罐染菌是指整个工厂各个产品的发酵罐都出现 个别发酵罐连续染菌，较多地是由于设备问题而造成的。 个别发酵罐偶然染菌的原因最为复杂，各种染菌途径 ● 污染无芽孢杆菌、球菌等不耐热菌，可能是从蒸汽的 杂菌现象，而且染的是同一种菌，主要是空气过滤器除 如阀门的渗漏或罐体破损，特别是蛇形管的穿孔，有时 都有可能引起。 冷凝水中带来的，或空气系统不严造成。 菌不净，空气带菌而造成的。 不易察觉。有时设备破损引起的染菌会出现每批染菌时 间前移现象。
② 实罐灭菌
配制培养基时要防止原料结块。配料罐出口应有筛板过滤器 （筛孔直径≤0.5mm），以防块状物及异物进入罐内。灭菌时，要 保证各路进气畅通及罐内料液翻腾激烈，控制好温度与压力，严 防泡沫冒顶及料液倒流到空气系统中。
③ 连消 料液进入连消塔前需先预热。灭菌过程中，料液温度 及其在维持罐停留的时间都必须符合要求，确保灭菌彻底。 当冷却管开放冷水时，防止因突然冷却造成负压而吸入外 界空气。为确保灭菌温度稳定，连消必须实现自动控制。 ④ 补料 补入发酵罐内的料液一定要保证无菌。 ⑤ 种子
3、噬菌体污染的防治
发酵工业生产中噬菌体污染是一个复杂的问题，虽然 至今还没有完全满意地解决这一问题，但采取一些措施 来防治噬菌体的污染，也有一定的成效。
（1）防止噬菌体入侵和蔓延
发酵工厂生产菌的噬菌体广泛存在于其周围环境中，为了 防止噬菌体的污染，保持周围环境的清洁是必要的，所有设 备和设施如发酵罐、管道系统等要进行灭菌处理。 妥善地保藏菌种、对原料和水进行无菌处理、对工厂空 气、种子、发酵液、泥土和污水的噬菌体浓度进行日常检查， 即使空气中噬菌体浓度极低时，也要进行检测。
（2）设备
发酵罐及其附属设备应注意严密和防止泄漏，避免形成 “死角”。与物料、空气、下水道连接的阀门皆需保证严密 度。
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用超净工作台及净化室代替无菌室，以提高无菌程度。
连消设备的连消塔要简单，易拆装清理，操作时蒸汽能与 物料均匀混合，并易控温度；维持罐在料液输送时培养基在 罐中能均匀地缓慢上升，不走短路。
第四章 发酵工艺过程控制
第九节 杂菌与噬菌体的防治
纯种发酵（单菌或混菌）；菌种以外的微生物都被视 为杂菌。
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所谓染菌，是指在发酵培养基中侵入了有碍生产的其 它微生物。
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几乎所有的发酵工业都有可能遭遇杂菌或噬菌体的污 染。染菌的结果，轻者影响产量或质量，重者可能导致倒 罐，甚至停产，造成原料、人力和设备动力的浪费。
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有些抗生素能抑制多种噬菌体，氯霉素（1g/ml）对 丙酮丁醇乳酸棒杆菌的HM噬菌体有良好的抑制作用，对宿 主菌无影响。
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