兔软骨细胞的分离

目的探讨兔软骨细胞培养方法。

方法采用胶原酶Ⅱ分段消化法从4周龄新西兰兔的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养。

每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况。

并用甲苯胺蓝异染色进行细胞表型鉴定。

结果软骨细胞形成单层的时间原代培养1周左右,传代培养约4~5天,细胞以圆形或上皮样细胞形态为主。

甲苯胺蓝染色证实细胞可合成蛋白多糖,异染反应主要集中在细胞集落样生长区,异染程度以原代培养最为显著。

结论采用本方法培养兔软骨细胞是可行的。

软骨细胞是关节软骨破坏过程中的靶细胞,研究靶细胞的变化是探索关节软骨破坏、病理和治疗的重要方法,本实验的目的是建立体外软骨细胞培养体系,为进一步实验创造条件。

1材料与方法
1·3动物: 4周龄健康新西兰兔。

1·4软骨细胞的分离和培养
1·4·1软骨细胞的分离步骤:
I)一只健康4周龄新西兰兔脱颈处死,备皮,用碘酊酒精背部皮肤消毒,无菌
操作沿背部中线剪开并剥离皮肤,更换手术器械及手套,以防碘酊等有机
物污染。

(30min) II)游离并用骨剪截取膝关节,置入无菌平皿,带入超净工作台
III)在超净工作台作如下操作:
1)先用双抗的pbs充分漂洗,直到没有碘伏的颜色(5min),离断髌韧
带,内外侧副韧带以及前后交叉韧带,切开膝关节,刮除关节周围
附着的组织如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜, pbs液充分漂洗。

2)用尖刀片充分利用软骨的弹性,削下每个关节表面的软骨,不要
误带软骨下骨和骨膜,一般以不渗血为度。

3)充分漂洗软骨小块,更换洗液3次(pbs液)。

4)用眼科小剪刀剪碎至1 mm3大小,用小刮匙把软骨小块转移至
小锥形瓶中。

5)加入0·2%Ⅱ型胶原酶5 ml,置磁力搅拌器上37℃消化45 min,
将游离出的带有酶溶液的软骨细胞用悬液吸管吸出, 120目尼龙
网筛过滤。

6)所得滤液放入一无菌离心管内, 1200 r/min离心8 min,弃上清,
加入5 ml含有血清的DMEM培养液混匀以终止消化。

7)1200 r/min离心5 min,弃去上清液,只留下细胞球,并加入少量含
有血清的培养液吸打后先封口置放。

8)原消化瓶中再加入0·2%Ⅱ型胶原酶5 ml,如前法消化45 min,
消化后的处理同上。

9)然后把2次消化所得的软骨细胞悬液合并在一起,台盼蓝染色检
查死亡细胞比例,血球计数板计数, 并把细胞悬液稀释成(2~3)×
105细胞/ml,接种于培养瓶中。

1·4·2原代培养:
I)将消化所得的细胞悬液以(2~3)×105细胞/ml接种于25 cm2培养瓶中,共
接种3瓶,每瓶加5 ml的细胞悬液。

II)把培养瓶置于CO2培养箱中培养(温度37℃,饱和湿度, 5%CO2, 95%空气)。

III)48 h后视细胞贴壁情况更换培养液,以后每两天更换培养液1次。

1·4·3传代培养:
I)当倒置显微镜观察软骨细胞汇合成片,长满大部分培养瓶壁后,倾去培养液,
加入0·25%胰蛋白酶2 ml,室温下静置5~10 min,
II)在倒置显微镜下若观察到细胞重新变成圆形,个别细胞开始浮游,此时应迅速而轻柔地弃去胰蛋白酶溶液而不使瓶底细胞随胰蛋白酶溶液流失。

III)重新加入新培养液,吹打细胞使其散开形成软骨细胞悬液,按前述方法分瓶培养或冻存以备用。

1·4·4软骨细胞的组织化学染色鉴定:
I)倾去培养瓶中的培养液后用生理盐水漂洗,置入10%中性福尔马林中固定
过夜。

II)70%乙醇固定20 min以除去四价铵离子,以免阻碍染色。

用0·04%甲苯胺蓝染色20 min,迅速用无水乙醇漂洗1次,空气干燥,倒置显微镜下观察摄影。

2结果
2·1倒置显微镜观察:
I)分离培养的原代软骨细胞呈圆球形,台盼蓝排斥试验示活细胞率约90%左
右。

II)悬浮12 h逐渐开始贴壁, 24 h后大部分贴壁,首先细胞伸出短小的生长突,呈扇形;扇形生长突不断扩大,细胞的两侧或三边都可伸出生长突。

III)此时细胞在倒置显微镜下呈片状贴附,形态呈梭形、或三角形、或多角形,胞浆内可见折光的颗粒,周围有细长的突起,胞核明显呈圆形或椭圆形,核仁清晰,原代培养的软骨细胞7天即可长满瓶壁,部分区域呈多层生长。

IV)在集落生长区和多层生长区细胞被分泌的基质所包埋,形成肉眼可见的结节样组织。

V)传代培养的软骨细胞一般24 h即可完全贴壁,细胞伸出伪足,充分铺展。

VI)传一代的软骨细胞5天左右即可形成单层,细胞仍以圆类、类上皮细胞样外观为主。

VII)随着传代次数的增加,细胞中梭形细胞增多,分泌和增殖能力下降,传代周期延长。

2·2甲苯胺蓝染色形态学观察:
I)原代培养的软骨细胞培养7天后染色见:单层生长区和多层生长区域细胞
正染成浅蓝色,有2~3个核仁,核仁呈紫蓝色。

集落样生长区和多层生长区的中心部分细胞及细胞外基质异染成紫红色,细胞核正染成深蓝色,而其边缘部位异染不及中心区域。

II)细胞经多次传代后主要以单层生长方式为主,甲苯胺蓝染色以正染浅蓝色为主。

许多细胞呈核负染,表明软骨细胞分泌的蛋白多糖等细胞外基质与细胞传代次数有关。

3.注意事项
i.软骨细胞是关节软骨内的唯一细胞成分,只要很好地进行机械解离和
化学解离,注意原代培养和传代培养的方法,就能很好地进行软骨细
胞的分离和培养。

ii.机械解离非常重要,往往决定实验是否成功,解离时不要误带软骨以外的组织,尽可能把软骨切碎至小于1mm3大小。

iii.化学解离主要是用酶法解离,注意消化时间,时间太短软骨细胞不能充分游离,影响软骨细胞的收获量;时间太长死亡的软骨细胞数就会
增多,同样影响软骨细胞的收获量,不利于培养。

iv.换培养液时间一般来讲,生长良好的细胞约两天左右应更换一次培养液,要特别注意培养液的pH值变化, pH值低于6·4时软骨细胞会发
生死亡。

v.常规的培养方法操作步骤较多,且需要多种酶消化,增加了细胞污染的可能性[4-6]。

我们的方法是单用Ⅱ型胶原酶分阶段进行消化,每次
消化45 min,收集一次细胞,并尽快加含有血清的培养液来终止消化,
并加血清培养液保护。

经过二次45 min消化基本上可完全收获细胞。

然后把二次消化的细胞集中在一起计数,分瓶培养。

vi.因为胶原酶接触时间过长对软骨细胞有毒性作用,所以不能一次消化2~3 h或5~7 h才收获细胞。

vii.和大多数软骨细胞一样,兔软骨细胞最适pH值为7·4,所以要经常检查培养液的pH值,如培养液变黄要及时换培养液。

viii.培养液放置于冰箱中保存后常偏碱性,要用盐酸及时调整。

在软骨细胞培养的过程中始终要防止污染,注意无菌操作。

ix.软骨细胞在体外培养过程中有两种转归:一是继续维持表型,具有分泌Ⅱ型胶原纤维和硫酸软骨素蛋白(CSPG)的能力;二是发生反分化,细
胞不仅形态发生改变,而且所分泌的胶原纤维不再是Ⅱ型而成为Ⅰ型,
CSPG的合成能力也随之丧失[7]。

x.我们根据软骨细胞的表型鉴定,认为三代以内的软骨细胞活性较高,保持软骨细胞的表型,是实验研究的理想细胞。

三代以后的软骨细胞
逐渐发生反分化,细胞体积增大,出现许多指状突起,胞核增大,细胞增
殖速度明显减慢,可作为软骨细胞退行变的研究模型。

所以研究药物
的最佳反应和组织工程软骨最好选用三代以内的软骨细胞。

一、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。

如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。

此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

用品：
1. 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。

使用时。

用PBS稀释至0.4%。

2. 吸管、血细胞计数板、显微镜
步骤：
1、制备单细胞悬液。

并作适当稀释（10 *6 细胞/ml）
2、染色：取9mL细胞悬液移入试管中，加1mL0.4%台盼蓝溶液，混匀。

3、观察
注意事项：台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。

否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。

台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时，细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色，在显微镜下观察即可，活细胞不被染色。

方便易用，因此在实验室中比较常用，尤其在心肌细胞原代培养中。

台盼兰染色法价格低廉，操作简单，又不用无菌操作，做这个实验只要是把显微镜调好了，细胞浓度调好了就不会有问题，是一个养细胞的入门实验，所以很适合初学者做。