生化实验2_电泳共28页文档
高级生化实验报告二
实验二Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白一、背景印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern blotting。
之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授又发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blotting相似，故命名为Northern blotting。
George Stark这位教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测方法。
1981年，在Neal Burnette所著的Analytical Biochemistry中，首次将单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western blotting。
此后开发的Eastern blotting是Western blotting的变形，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern blotting。
30多年来，Western blotting 技术已成为蛋白质研究中最常用的工具，用于鉴定目的蛋白是否存在（定性），目的蛋白质的表达量和不同样品之间的表达差异性（定量）。
pET系统是在大肠杆菌（Escherichia coli）中克隆表达目的基因、产生重组蛋白的经典表达系统。
目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。
T7 RNA 聚合酶被充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
目的蛋白可用于进一步的SDS-PAGE分析、Western blotting检测或亲和层析分离纯化。
二、实验目的利用Western Blotting技术，定性检测苦荞二氢黄酮醇4-还原酶基因（FtDFR）在BL(DE3)中的诱导表达。
双向电泳实验双向电泳实验过程及相关溶液配置（经典）
双向电泳实验双向电泳实验过程及相关溶液配置（经典）双向电泳实验双向电泳实验过程及相关溶液配置(经典)3.2点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul,按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels(18cm，pH 3-10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品双向电泳实验过程及相关溶液配置A.实验过程一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息二、实验步骤：1.样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白：100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时其中每隔10~15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，-80oC保存2.Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul,5ul,10ul,15ul,20ul的BSA溶解液，另2管中分别加入2ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值(测量过程要在一个小时内完成)例如：编号蛋白量(ul)Buffer(ul)Bradford(ml)OD595值1 080 40 25 75 40.024 310 70 40.061 415 65 40.091 520 60 40.116 Bt4 278 40.079 Bt4 476 4转Bt4 278 40.075转Bt4 476 4标准曲线方程式：Y=aX b.其中Y为OD值，X为蛋白含量a、b 通过作图输入数据可知相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得OD值测量过程：比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值3.双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1水化液的制备称取2.0mg的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05%的溴酚兰，3.5ul(0.5%v/v)IPG buffer(pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min除杂质，取上清在含300ug蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定(跑胶温度为20oC)S1(30v,12hr,360vhs,step)S2(500v,1hr,500vhs,step)S3(1000v,1hr,1000vhs,step)S4(8000v,0.5hr,2250vhs,Grad)S5(8000v,5hr,40000vhs,step)共计44110vhs,19.5小时其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦3.4平衡用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干(胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去)，再以超纯水冲洗，滤纸吸。
电泳实验报告
电泳实验报告电泳是一种常见的生物分析技术，通过电场的作用将带电粒子在凝胶或溶液中移动，从而实现分离与检测的目的。
本次实验旨在通过蛋白质电泳分析样本中蛋白质的分布情况和相对含量。
以下将从实验原理、实验过程和结果讨论等方面进行说明。
实验原理电泳的基本原理是带电粒子在电场作用下受力并进行移动。
在本实验中，我们使用了聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，并将电场施加在凝胶上，使得带电的蛋白质在凝胶孔隙中移动。
蛋白质根据其大小和电荷性质，在电场作用下移动的距离和速率不同，从而实现分离。
实验过程首先，我们制备了聚丙烯酰胺凝胶。
将聚丙烯酰胺粉末溶解在缓冲液中，然后加入过氧化铵等试剂混合均匀，在模具中固化。
接着，将样本与电泳缓冲液混合，并加载到凝胶孔洞中。
将电泳仪连接到电源上，并设置所需的电压和电流参数。
开启电源后，等待一段时间，直到电泳进行结束。
最后，取出凝胶，进行染色以观察分离效果。
实验结果与讨论经过电泳分离后，观察到凝胶上出现了一系列不同距离的蛋白质带。
这些带的位置和宽度表明了蛋白质的分子量和电荷性质。
分析不同带的迁移距离和相对含量可以得出蛋白质样本的组成和纯度信息。
首先，我们通过与已知分子量的标准品进行比对，确定了不同蛋白质的分子量。
根据标准品带的位置和已知分子量的对应关系，我们能够推断出样本中蛋白质的大致分子量范围。
这对于进一步研究蛋白质的结构与功能有着重要意义。
其次，观察带的宽度可以得知蛋白质的电荷性质。
在电泳过程中，蛋白质分子受到缓冲液中离子的影响，会发生电荷遮盖现象，使得蛋白质的分离效果减弱。
当蛋白质具有多种电荷状态时，其带的宽度可能会增加，提示样本中存在多种同种蛋白质的变异形式。
最后，通过比较不同带的相对含量，可以推断出蛋白质样本的组成情况。
通过定量分析电泳带的强度或使用显色剂染色，我们可以得出不同蛋白质在样本中的相对丰度，从而评估样本的纯度和组分分布。
总结与展望通过电泳实验，我们成功地分析了样本中不同蛋白质的分子量、电荷性质和相对含量。
电泳技术生化实验资料
力（Size sieving capacity），故将此现象称为分子筛效应 （Molecular sieving effect）. • 有效孔径取决于凝胶的总浓度 T％，孔径随着 T% 的增加而减 小。
影响电泳速度的相关因素
• F＝E·q V=E·qf 1. 带电颗粒在电场中泳动的速度和带电颗粒
的净电荷量成正比，与颗粒的半径和介质 粘度成反比。
2. 电场强度 E 愈高，带电颗粒的泳动速度 愈快，反之亦然。
3. 溶液的 PH 偏离分子的等电点愈远，觧离 度愈大，净电荷愈多，泳动速度越快。离 子强度加大，电流加大，泳动速度加快。
界面移动电泳: 在界面移动 电泳仪的中间漏斗装上待测 溶胶，U型管上端装电极，底 部两个活塞的内径与管径相 同。 实验开始时，打开活塞， 使溶胶进入U型管，使两壁液 面等高。接通电源，小心打 开活塞，观察液面 的变化。 根据通电时间和液面升高或 下降的刻度，计算电泳速度。 若是无色溶胶，用紫外吸收 或其它光学方法读出液面的 变化，
区带电泳: 区带电泳是将惰性的固 体或凝胶作支持物，在其上面进行 电泳，而将电泳速度不同的各组成 分离。区带电泳实验简便易行，分 离效率高，样品用量少，是分析和 分离蛋白质的基本方法。 用滤纸 作为载体的称为纸上电泳,聚丙烯 酰胺凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳等. 各组分即以不同速度沿载体运动， 经一 段时间后，形成距起点不同 距离的区带，区带等于样品中的组 分数。再用适当方法，进行分析。
6.筛孔：人为控制电泳介质的有效筛孔。根据要求调节、控制、基 质中交联剂的浓度或筛孔的大小，影响颗粒移动的速度。
生物大分子迁移的方式
生化试验-电泳
电泳技术
1.电泳技术的基本原理 1.电泳技术的基本原理
电泳类型 ⑴区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝 电泳、凝胶电泳。
凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、 聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、免疫电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、
电泳技术
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
②缓冲液离子成份的不连续性 大孔胶 pH=6.7 先行离子：Cl 存在于凝胶层中任何PH值下 先行离子：Cl-存在于凝胶层中任何PH值下
HCl > Cl + H+
随后离子：Gly 随后离子：Gly-存在于电极缓冲液中 pI=6.0 pKα1=2.34 pKα2=9.70 在pH=6.7时，只有少数解离为Gly-，多数为Gly+-。 pH=6.7时，只有少数解离为Gly ，多数为Gly Pr分子在pH6.7时以Pr-形式存在 Pr分子在pH6.7时以Pr
①凝胶孔径不连续性 ②缓冲液离子成份的不连续性 ③PH的不连续性 PH的不连续性
电泳技术
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
①凝胶孔径不连续性 单体浓度 T(%) = Acr(g) + Bis(g) ×100%
V(ml)
交联度
Bis(g) C(%) = ×100% Acr(g) + Bis(g)
电泳技术
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光) 光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。 化学聚合：制小孔胶。 化学聚合： 过硫酸铵(NH 过硫酸铵(NH4)2S2O3 APS N,N,N’,N’ N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 TEMED 剂) (引发剂) 引发剂) (加速
生物化学实验-电泳
O
O
催化剂 聚合形成的C三H2维=C网H-状C-N结H构-C。H2-NH-C-CH=CH2
五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理
2.聚丙烯酰胺凝胶的聚合
催化剂
（1）过硫酸铵-TEMED系统 碱性条件下催化作用 温度与聚合快慢成正比 （2）核黄素-TEMED系统 光激发的催化反应 用量少，对分析样品无影响 聚合时间可自由控制
分配层析
纸层析 薄层层析
离子交换层析 离子交换柱层析
吸附层析 亲合层析
吸附薄层层析 气体吸附层析 酶与底物 抗原与抗体
液体
固体 固体 固体 固体
液体 溶解度
液体
液体 气体
带电性 静电引力
吸附力
液体 配体专一性
凝胶层析
凝胶过滤
固体 液体 分子大小
3、常用的层析原理
（1）分配层析——纸层析
原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同， 在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数， 即分配系数（α）。
五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理
3.聚丙烯酰胺凝胶的孔径
凝胶越浓T，凝胶孔径↓，所受阻力，机械强度
丙稀酰胺浓度
分离物质分子量
4％
大于100万
7－7.5％
1－100万
15－30％
小于1万
胶的孔径为蛋白质分子平均大小一半时效果好
凝胶强度的选择
先用7.5%的标准凝胶或4%--10%的凝胶梯度测试
酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。
电泳技术
一.电泳的概念 二.电泳技术分类 三.电泳技术基本原理 四.几种常见电泳方法的比较 五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理
一.电泳的概念
带电质点在电场中移动的现象。
实验二 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定免疫球蛋白
将制备好的凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液， 拨除梳子。用微量移液器点样。 5、电泳
样品在浓缩胶时，低电压（60~80V，起始电流不超过10~15mA）， 进入分离胶后，提高电压（100~200V，电流不超过30mA），当 指示剂溴酚蓝前沿距离胶1~2mm，终止电泳。最好在低温下进行。
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6、染色与脱色
7、加入一抗，室温平缓摇动2h；
8、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min；
9、加入二抗，室温下孵育1h；
10、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min；
11、显色 在DAB中显色约10-30min，待蛋白质带的颜色
深度达到要求后，用水漂洗，拍照或扫描。
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实验报告要求与思考题
1、就实验中出现的各种问题进行分析 讨论。
以膜上的蛋白或多肽为抗原与相应的第一以膜上的蛋白或多肽为抗原与相应的第一抗体起免疫反应再和酶标记的第二抗体反抗体起免疫反应再和酶标记的第二抗体反应用适当的溶液漂洗去未结合抗体后置应用适当的溶液漂洗去未结合抗体后置含底物的溶液中温育即可检测出样品中的含底物的溶液中温育即可检测出样品中的特异蛋白质组分
实验二 SDS-PAGE分离鉴定 免疫球蛋白
凝胶浓度/% 2~5
100~500 40~100 10~40
<10
5~10 10~15 15~20 20~30
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1、配制10ML12%分离胶
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2、装配好电泳用双层垂直玻璃板，保证底部不漏水。将混合均匀的 分离胶凝胶溶液灌入双层玻璃板之间，控制溶液高度距离矮玻璃 板上缘2~3cm，立即在凝胶顶部加入2~3cm水层，室温静止 30~60min，待凝胶凝固后吸去顶部水层，灌浓缩胶至 双层玻璃板灌满为止，立即插入梳子，静止30~60min， 待凝胶凝固。
生化实验报告电泳
生化实验报告电泳生化实验报告：电泳引言：生化实验是生物科学领域中重要的研究方法之一，其中电泳是一种常用的技术手段。
电泳通过电场的作用将带电的生物大分子（如DNA、蛋白质等）在凝胶或液体介质中进行分离和分析。
本报告将介绍电泳的原理、分类和应用，并结合实验结果进行讨论。
一、电泳原理电泳是利用电场对带电粒子进行分离的技术。
在电泳过程中，带电粒子会受到电场力的作用，从而在凝胶或液体介质中移动。
电泳的原理可以归纳为两个关键因素：电场力和摩擦力。
1.1 电场力电场力是电泳中最主要的驱动力之一。
当电场施加在带电粒子上时，粒子会受到电场力的作用而移动。
电场力的大小与电荷量和电场强度成正比，与粒子的大小和形状无关。
电泳中通常使用直流电场，以确保粒子在凝胶或液体介质中的移动方向一致。
1.2 摩擦力摩擦力是电泳中的阻力因素，它与带电粒子在介质中的移动速度成正比。
摩擦力的大小与粒子的大小和形状有关，较大的粒子会受到更大的摩擦力。
凝胶或液体介质的性质也会影响摩擦力的大小。
二、电泳分类根据不同的分离目标和实验条件，电泳可以分为几种不同的分类。
2.1 凝胶电泳凝胶电泳是最常见的电泳方法之一，通常用于分离DNA和蛋白质等生物大分子。
凝胶电泳中，凝胶作为介质，通过调节凝胶的浓度和孔隙大小，可以实现不同大小的分子的分离。
常见的凝胶电泳包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2.2 毛细管电泳毛细管电泳是利用毛细管作为分离通道的电泳方法。
毛细管具有极小的内径和高表面积，可以实现高效的分离。
毛细管电泳常用于分离离子和小分子化合物，如氨基酸、核苷酸等。
2.3 聚合物链反应（PCR）电泳PCR电泳是一种结合了聚合物链反应和凝胶电泳的技术。
PCR电泳用于检测和分离DNA片段，广泛应用于基因检测和疾病诊断等领域。
三、电泳应用电泳作为一种重要的生化实验技术，广泛应用于科学研究和生物医学领域。
3.1 DNA分析电泳在DNA分析中起着关键作用。
通过凝胶电泳，可以将DNA片段按照大小进行分离，从而确定DNA的长度和形态。