CRISPR-Cas9体系实验流程 (2)
基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤
基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种革命性的工具，能够精确切割和修改DNA 序列。
它已被广泛应用于实验室研究、农业、医学和生物技术领域。
CRISPR-Cas9的操作步骤分为设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选、验证等几个阶段。
以下是基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤：1. 设计目标序列首先，确定要编辑的基因序列。
识别目标区域，通常选择高度保守的DNA 区域，以最大程度减少非特异性修饰。
目标序列的设计需要遵循一些规则，例如避免重复、剪切酶的PAM序列靠近目标区域等。
2. 构建修饰体根据设计的目标序列，构建CRISPR修饰体。
修饰体通常由CRISPR核酸（包括crRNA或sgRNA）和Cas9核酸组成。
crRNA（或sgRNA）负责定位到目标序列，Cas9则负责剪切目标序列。
合成修饰体的DNA或RNA序列后，可以使用PCR扩增或化学合成的方法得到修饰体。
3. 细胞转染将构建好的修饰体转染至目标细胞中。
转染可以选择不同的方法，例如化学法、电穿孔法、超声波法或病毒载体等。
转染后，修饰体会逐渐进入目标细胞，并开始作用于基因组。
4. 筛选在转染后，大部分细胞仍然具有未被编辑的基因组。
为了筛选出完成编辑的细胞，可以使用筛选方法。
最常用的方法是通过引入荧光蛋白标记的修饰体，利用流式细胞术或显微镜检查标记的细胞。
5. 验证对于筛选出来的细胞，需要进行进一步的验证。
最常用的方法是通过测序确认基因组是否发生了预期的编辑。
此外，也可以使用T7E1酶切或限制性内切酶消化等方法，进一步验证编辑效果的准确性。
总结起来，基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤包括设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选和验证等几个阶段。
通过遵循这些步骤，研究人员可以实现对目标基因组的精确编辑，进而揭示基因功能、治疗遗传疾病，并在农业和生物技术领域开拓新的应用前景。
CRISPR-Cas9细胞-动物KOKI实验基本流程-2
一、CRISPR-Cas9 细胞基因敲除敲入实验基本操作流程1)设计sgRNA ：1.1、确定待敲除基因的靶位点根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。
找到该基因CDS 区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。
按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。
对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子A TG后的外显子上。
如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
1.2、设计识别靶位点的一对DNA Oligos确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input 框中（/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。
一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer AdjacentMotif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。
而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。
因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。
不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。
因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。
根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos （同时设计检测目的基因的引物一起合成）。
1、/2、/mpg/crispr_design/3、/~slin/cas9.html4、/E-CRISP/5、/6、/crispr/,Drosophila7、/index.jsp8、/casot/index.php9、/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx10、/根据酶切方式，选择合适接头，例如，PX458等质粒sgRNA靶点oligo如下（Bbs1酶切）5‘-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3‘- CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-CAAA-5‘（1）对于sgRNA的长度，一般应为20 nt左右；（2）对于sgRNA序列的碱基组成，可选3'末端含GG的sgRNA，同时sgRNA种子序列尽量避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为40%~60%；（3）sgRNA的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低（4）如果构建U6或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需考虑sgRNA的5' 碱基为G或GG，以提高其转录效率；（5）对于sgRNA靶向基因的结合位置，如需造成基因移码突变，需尽量靠近基因编码区的A TG下游，最好位于第一或第二外显子；（6）检查sgRNA靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs；（7）如采用Cas9单切口酶，设计paired-gRNA需考虑成对sgRNA的间距；（8）全基因脱靶效应分析，需考虑脱靶位点最大允许几个错配碱基数，建议最少5个碱基。
基因编辑技术CRISPRCas9的使用方法与注意事项
基因编辑技术CRISPRCas9的使用方法与注意事项基因编辑技术是一种快速、高效修改生物体基因组的方法，近年来取得了显著的进展。
其中，CRISPR-Cas9技术被广泛应用于基因组编辑领域，成为一种常用的工具。
本文将介绍CRISPR-Cas9的使用方法和相关的注意事项。
CRISPR-Cas9基因编辑技术是通过RNA引导的Cas9蛋白复合物识别特定DNA序列，并将其切割，以实现对基因组的修改。
下面将详细介绍使用CRISPR-Cas9的步骤和注意事项。
1. 目标序列选择与设计在使用CRISPR-Cas9进行基因组编辑之前，首先需要选择并设计一个适合的目标序列。
目标序列应具有特异性，同时应具备足够的保守性，以确保CRISPR-Cas9的高效性和准确性。
此外，目标序列还应远离重要基因或调控区域，以避免非特异性的剪切事件。
2. CRISPR RNA合成CRISPR RNA（crRNA）是一种由CRISPR序列和目标序列组成的RNA分子。
它通过碱基配对与Cas9蛋白结合，从而指导Cas9蛋白与目标DNA序列配对，并发生切割。
在合成crRNA时，需要注意避免污染和二聚体的形成。
3. Cas9蛋白表达和纯化Cas9蛋白是CRISPR-Cas9系统的核心组成部分，它能够与crRNA形成复合物并介导DNA的切割。
在使用Cas9蛋白之前，需要将其进行表达和纯化。
选择合适的Cas9表达系统和纯化方法，确保获得高纯度的蛋白样品。
4. CRISPR-Cas9复合物形成将crRNA与Cas9蛋白复合形成CRISPR-Cas9复合物，是基因组编辑过程中的关键步骤。
将纯化的Cas9蛋白与合成的crRNA按照一定的比例混合，在适当的条件下进行复合，形成稳定的复合物。
注意事项包括避免RNase和DNA酶的污染，以及控制复合物的浓度和组装时间。
5. 细胞渗透与转染在进行基因组编辑之前，需要将CRISPR-Cas9复合物引入目标细胞内。
细胞渗透和转染是常用的方法，常用的技术包括细胞渗透剂、转染试剂、电穿孔等。
CRISPRCas9基因敲除细胞株详细构建流程
CRISPRCas9基因敲除细胞株详细构建流程Puro 抗性浓度摸索实验将细胞如下图1稀释。
给药7天后，弃培养液，用台盼蓝染色2 min，显微镜下观察细胞存活情况。
确定细胞多克隆细胞筛选和单克隆细胞筛选浓度。
图1 抗性浓度摸索单克隆形成验证实验细胞计数，将细胞悬液稀释混匀后加入96孔板，用封口胶将孔板封好，放于培养箱中培养。
静置培养48 h后每日观察并记录单克隆形成情况。
sgRNA 靶标设计根据基因序列信息，设计 sgRNA。
靶标位点序列信息确认PCR扩增（图2），测序验证基因序列，以确定sgRNA区域有无SNP。
图2 靶标序列扩增sgRNA克隆引物合成根据sgRNA设计sgRNA克隆引物。
lentiCRISPRv2-sgRNA载体构建退火，连接，转化，涂板（LB/Amp）培养。
lentiCRISPRv2-sgRNA载体验证每个实验组各挑取6个单克隆菌落，于LB/ Amp培养基中扩增，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提效果（图3）。
图3 质粒抽提酶切验证：取3个单克隆进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果（图4）。
选择2个样品送样测序。
图4 单克隆酶切验证病毒包装lentiCRISPRv2-sgRNA无内毒素质粒提取，病毒包装。
细胞转染配制梯度病毒稀释液，细胞于培养箱中静置培养48h。
阳性单克隆细胞株筛选细胞转染48h后，更换完全培养基，筛选至对照组大部分细胞死亡，实验组细胞扩大培养，进行单克隆筛选。
几天后挑选阳性单克隆进行扩增，并取样验证。
阳性单克隆细胞株验证测序验证阳性单克隆细胞株的基因序列，以确定是否敲除成功。
实验结果示例：该基因有两个单克隆细胞株，A1和A2。
单克隆细胞A1的目的基因在sgRNA2位置出现两种突变形式，分别缺失1个和19个碱基，在新序列的第337位和第355位碱基提前出现终止密码子。
单克隆细胞A2的目的基因在sgRNA2位置发生突变，插入1个碱基，在新序列的第340位碱基提前出现终止密码子。
CRISPR-Cas9体系实验流程(2)
CRISPR-Cas9体系实验流程(2)一、材料试剂准备1）质粒：pSpCa9(BB)(AddgeneplamidID:42230)，若实验用gRNA为PCR扩增纯化产物，则需要该质粒做为U6的模版。
pUC19(Invitrogen,cat.no.15364-011)可用于构建gRNA，若用PCR 产物进行转染，则需要该质粒来进行共转染，做为DNAcarrier。
上述三种质粒，根据实验选择gRNA的表达方式（PCR产物/单载体系统/双载体系统）来确定具体使用哪种。
2）超纯水，DNae/RNae-free(LifeTechnologie,cat.no.10977-023) 3）高保真聚合酶，KapaHiFi(KapaBioytem),PfuUltra(Agilen)，HerculaeIIfuionpolymerae均可，只需保真效果好，扩增过程不产生突变。
4）TaqDNApolymeraewithtandardTaqbuffer(NEB,cat.no.M0273S)用于一般检测。
5）QIAquickgele某tractionkit(Qiagen,cat.no.28704)6）QIApreppinminiprepkit(Qiagen,cat.no.27106)7）FatDigetBbI(BpiI)(Fermenta/ThermoScientific,cat.no.FD1014)，如需要将gRNA构建到pSpCa9(BB)-2A-GFP质粒上，则需要该酶。
8）T7DNAligaewith2某rapidligationbuffer(Enzymatic,cat.no.L602L).或者T4DNAligae，二者无区别。
12）T4polynucleotidekinae(NewEnglandBioLab,cat.no.M0201S)13）PlamidSafeATP-dependentDNae(Epicentre,cat.no.E3101K)14）Adenoine5′-triphophate,10mM(NewEnglandBioLab,cat.no.P0756S)15）SOCmedium(NewEnglandBioLab,cat.no.B9020S)二、实验流程或者人工手动选择，在目的区域5′-NGG（即PAM）上游20bp片段均可做为targetite，一般targetite可选在正义链或者反义链，二者均可。
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，CRISPR-Cas9系统已成为现代生物医学研究中常用的基因编辑工具之一。
它为科研人员提供了强大的基因敲除、插入或突变的能力，在多种模型动物制备及疾病研究领域具有广泛的应用前景。
本文旨在介绍利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的过程，为相关研究提供技术参考。
二、材料与方法1. 材料(1) CRISPR-Cas9系统相关组件（包括Cas9蛋白、sgRNA 等）；(2) 小鼠胚胎干细胞系；(3) DUSP9基因特异性敲除载体；(4) 培养基、试剂及其他实验耗材。
2. 方法(1) 设计并构建DUSP9基因敲除载体；(2) 准备小鼠胚胎干细胞系并进行细胞培养；(3) 将DUSP9基因敲除载体与胚胎干细胞共培养，实现基因编辑；(4) 筛选并扩增成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞；(5) 对敲除细胞进行鉴定及保存。
三、实验过程1. DUSP9基因敲除载体的构建根据DUSP9基因序列，设计并合成sgRNA序列，构建DUSP9基因敲除载体。
通过PCR扩增获得目的片段，将其克隆至载体中，构建成功后的载体通过测序验证其准确性。
2. 小鼠胚胎干细胞的培养与准备将小鼠胚胎干细胞置于适宜的培养条件下进行培养，待细胞生长至适宜状态时进行后续实验。
3. 基因编辑及筛选将DUSP9基因敲除载体与小鼠胚胎干细胞共培养，通过CRISPR-Cas9系统实现DUSP9基因的敲除。
随后，通过PCR、测序等方法筛选出成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞。
4. 鉴定与保存对筛选出的成功敲除DUSP9基因的胚胎干细胞进行鉴定，包括细胞形态观察、生长曲线绘制、基因型鉴定等。
将鉴定合格的细胞进行保存，以备后续实验使用。
四、结果与讨论1. 结果通过CRISPR-Cas9系统成功构建了DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系，并筛选出成功敲除DUSP9基因的细胞。
基因编辑工具CRISPRCas9的使用方法详解
基因编辑工具CRISPRCas9的使用方法详解自从科学家于2012年首次使用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑后，这项基因编辑工具引起了广泛的兴趣和研究。
CRISPR-Cas9是一种革命性的基因编辑技术，能够精确地修改细胞或有机体的基因组，为科学家们提供了探索基因功能、治疗遗传性疾病和改良农作物等无限可能。
CRISPR-Cas9的使用方法很简单，主要包括以下几个步骤：1. 设计引导RNA序列（sgRNA）：sgRNA是CRISPR-Cas9系统中的关键组成部分，它能够指引Cas9酶精确地将DNA剪切。
在设计sgRNA时，科学家需要选择一个目标基因的特定区域作为靶点，这个区域应该是单链DNA，并且具有20个连续核苷酸的序列。
2. 合成和验证sgRNA：一旦sgRNA序列设计完成，科学家们可以将其合成，并通过一系列实验来验证其有效性。
验证包括确认sgRNA与目标DNA序列的亲和力以及评估其能否成功引导Cas9酶到达目标基因。
3. 转染sgRNA和Cas9：一旦sgRNA和Cas9酶验证通过，科学家们将两者一起转染到要编辑的细胞或有机体中。
这可以通过各种转染方法实现，例如永生细胞中的电穿孔或胚胎中的胚胎注射。
4. 检测基因编辑：经过转染后，细胞或有机体中的Cas9酶和sgRNA会结合并识别并剪切目标基因的DNA序列。
科学家们可以通过PCR、Western blot、DNA测序等多种方法来检测基因编辑的效果。
一种常用的方法是T7终止测序，通过将目标基因进行PCR扩增，然后使用T7终止测序反应来确定基因编辑的结果。
总的来说，CRISPR-Cas9是一种快速、高效且精确的基因编辑工具。
然而，也需要注意一些潜在的问题和挑战。
例如，CRISPR-Cas9可能会造成非特异性的编辑效应，即不仅编辑目标基因，还会编辑其他非目标基因。
此外，CRISPR-Cas9的编辑效果可能会因细胞类型、转染效率以及sgRNA的选择等因素而有所不同。
CRISPR及Cas9基因编辑技术具体步骤及方法
CRISPR/Cas9基因编辑技术具体步骤及方法CRISPR/Cas9 是一种能够对基因组的特定位点进行精确编辑的技术。
其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA（guide RNA, gRNA）识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割，细胞随之利用非同源末端连接(Non homologous End Joining，NHEJ）或者同源重组（Homologous Recombination, HR）方式对切割位点进行修复，实现DNA水平基因敲除或精确编辑。
CRISPR基因敲除利用CRISPR / Cas9 进行单基因敲除目前研究最透彻、应用最广泛的II 型-CRISPR/Cas9 系统由两部分组成：1. 单链的guide RNA（single-guide RNA，sgRNA）2. 有核酸内切酶活性的Cas9 蛋白CRISPR/Cas9 系统利用sgRNA 来识别靶基因DNA，并引导Cas9 核酸内切酶剪切DNA（图1）。
当基因组发生双链DNA 断裂后，细胞通过非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ) 将断裂接合，在此过程中，将随机引入N 个碱基的缺失或增加，若N 非3 的倍数，则目的基因发生移码突变，实表1 CRISPR/Cas9 基因敲除与RNAi 比较CRISPR过表达利用CRISPR / Cas9 进行单基因过表达通过修饰CRISPR/Cas9 系统中的一些元件，形成一种蛋白复合物-协同激活介质（SAM），可实现对多数细胞内源基因的特异性激活。
该系统灵活方便，为研究基因功能提供了极为便利的工具。
CRISPR-SAM 系统由三部分组成：1. 失去核酸酶活性的dCas9（deactivated Cas9）-VP64 融合蛋白2. 含2 个MS2 RNA adapter 的sgRNA3. MS2-P65-HSF1 激活辅助蛋白CRISPR-SAM 系统中的MS2-P65-HSF1 激活辅助蛋白就是SAM，全称为SynergisticActivation Mediator( 协同激活调节器)，这也就是CRISPR-SAM 的命名由来。
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一、材料试剂准备1）质粒：pSpCas9(BB)-2A-GFP (Addgene plasmid ID: 48138)，用于转染cas9，该质粒含有Cas9与GFP，Cas9的nickase活性将用于特定目的基因的ko，GFP可做为转染标签。
pSpCas9(BB) (Addgene plasmid ID: 42230)，若实验用sgRNA为PCR扩增纯化产物，则需要该质粒做为U6的模版。
pUC19(Invitrogen, cat.no.15364-011)可用于构建sgRNA，若用PCR产物进行转染，则需要该质粒来进行共转染，做为DNA carrier。
上述三种质粒，根据实验选择sgRNA的表达方式（PCR产物/ 单载体系统/ 双载体系统）来确定具体使用哪种。
2）超纯水，DNase/RNase-free (Life Technologies, cat. no. 10977-023)3）高保真聚合酶，Kapa HiFi (Kapa Biosystems), PfuUltra (Agilen)，Herculase II fusion polymerase 均可，只需保真效果好，扩增过程不产生突变。
4）Taq DNA polymerase with standard Taq buffer (NEB, cat. no. M0273S)用于一般检测。
5）QIAquick gel extraction kit (Qiagen, cat. no. 28704)6）QIAprep spin miniprep kit (Qiagen, cat. no. 27106)7）Fast Digest BbsI (BpiI) (Fermentas/Thermo Scientific, cat. no. FD1014)，如需要将sgRNA构建到pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒上，则需要该酶。
8）T7 DNA ligase with 2× rapid ligation buffer (Enzymatics, cat. no. L602L). 或者T4 DNA ligase，二者无区别。
9）Stbl3 chemically competent E. coli (Life Technologies, cat. no. C7373-03)10）dNTP solution mix, 25 mM each (Enzymatics, cat. no. N205L)11）MgCl2, 25 mM (Thermo Scientific, cat. no. R0971)12）T4 polynucleotide kinase (New England BioLabs, cat. no. M0201S)13）Plasmid Safe ATP-dependent DNase (Epicentre, cat. no. E3101K)14）Adenosine 5′-triphosphate, 10 mM (New England BioLabs, cat. no. P0756S) 15）SOC medium (New England BioLabs, cat. no. B9020S)二、实验流程1）确定target site。
根据CRISPR在线设计工具/设计sgRNA，（还有其他设计工具，推荐该软件）。
将目的基因250bp以内的核苷酸序列输入，避免内含子，约10min将会给出备选的target site。
或者人工手动选择，在目的区域5′-NGG（即PAM）上游20bp片段均可做为target site，一般target site可选在正义链或者反义链，二者均可。
2) 准备sgRNA表达体系。
三种方案可选：a, 直接使用PCR扩增纯化产物，该产物片段含有U6+sgRNA，约370bp；b, 将sgRNA载体构建到pSpCas9(BB)-2A-GFPpUC19质粒当中，即单载体系统；c, sgRNA载体构建到构建到pUC19当中，成为双载体系统。
a．PCR扩增sgRNA表达结构。
PCR体系如下：U6-Fwd: GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCU6-Rev:AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAA CGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAA c NNNNNNNNN NNNNNNNNNNCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG(N即与target site反向互补配对的片段)其中聚合酶也可以使用pfu或者Kapa Hifi代替，高保真聚合酶即可，U6模版推荐使用pSpCas9(BB)。
PCR反应条件如下：该程序固定，不推荐更改。
PCR结束后，2%琼脂糖凝胶电泳验证，5ul PCR产物，15 V cm–1，30分。
条带位置为370bp。
PCR产物用QIAquick PCR purification kit纯化，依照试剂盒说明，最终取35ul EB buffer，或者水进行回收。
b. 构建sgRNA载体—单载体系统（pSpCas9(BB)-2A-GFP）。
首先，按照前述方法target site确定，根据target site设计需插入的sgRNA Oligo。
一般来说，sgRNA oligo的形式如下：sgRNA top: CACCgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNsgRNA bottom: AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc两条设计好的oligo需经磷酸化，退火成双链，其体系如下：程序如下：37 °C 30 min; 95 °C 5 min; 每分钟降5 °C 至25 °C。
结束后按照1：200加水稀释（1ul oligo+199 H2O）其次，将合成好的sgRNA oligo插入到目的载体中，本实验将使用pSpCas9(BB)-2A-GFP。
其连接反应体系如下：其中pSpCas9(BB)-2A-GFP 100ng, 根据浓度调整体积。
连接1hr。
设计对照，对照同上，只是不加oligo。
连接反应条件如下：连接反应结束后，推荐使用PlasmidSafe exonuclease去除线性DNA残基，该步骤可选，但强烈建议该步操作。
37 °C 30 min, 70 °C 30 min。
之后保存到-20°C，可保存至少一周。
该步骤结束后的产物可直接用于转化大肠杆菌，推荐使用Stbl3感受态。
采取热击的方法：取2ul PlasmidSafe后的质粒，加入到20ul感受态中，冰上10min，热击42 °C，30 s，立即置于冰上2min，加入100ul SOC，直接涂板。
使用含有Amp100的LB平板。
37°C过夜。
第二天观察，对照板应无克隆，而含sgRNA插入的板中长有克隆。
挑取单克隆摇菌，用QIAprep spin miniprep kit进行质粒提取。
用U6-Fwd primer做为测序引物测序。
c．sgRNA双载体表达系统（构建到pUC19中）若利用pUC19建立双载体表达系统，首先依旧是参照之前的方法，寻找target site，设计引物用于扩增U6+sgRNA scafford；Fwd引物需含E coRI，Rev引物需含HindIII 酶切位点。
之后进行酶切连接等操作。
酶切体系如下：U6+sgRNA PCR产物酶切pUC19质粒酶切酶切产物纯化，使用QIAQuick PCR purification kit，纯化后可-20 °C保存。
连接：酶切后的质粒与PCR产物按照1：3，室温连接15min。
连接反应结束后，推荐用PlasmidSafe exonuclease去除线性DNA残基。
（可选做）后续转化大肠杆菌，热击转化，涂板，挑单菌落，摇菌，提质粒，测序检测方法均与前述方法一致。
验证质粒构建正确后则可进行后续转染细胞实验。
通用pUC19测序引物：（只选一端用于测序即可）pUC-Fwd - M13：GTAAAACGACGGCCAGTpUC-Rev - M13：CAGGAAACAGCTGTAAC3）转染KYSE150等细胞。
首先培养细胞至汇合度70-90%。
转染可利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，依照说明书进行转染。
转染方案如下：稳转：可先转染cas9，得到其稳转株。
其筛选流程如下，待按照lipo2000说明书转染后，2-3d，收细胞，计数，将细胞稀释。
60cells稀释在12ml培养基中，然后将这12ml培养基接种到96孔板中。
待长成克隆，观察绿色荧光即可。
或者直接进行流式单细胞分选，分选后的细胞分种到96孔板，待长成克隆。
单载体系统稳转可参照上述方法。
瞬转：依旧是参照说明书，转染后48-72小时收细胞，转染效率可参照GFP荧光信号，同时可进行WB或者qRT检测。
需注意的是sgRNA PCR产物的转染，其体系如下：注：本实验中Cas9将选用pSpCas9(BB)-2A-GFP，含有GFP标签。
附录:1.L ipofectamine 2000 (Invitrogen)转染体系如下表所示：2.3.pUC19 质粒图谱4.pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒图谱5.pSpCas9(BB)质粒图谱。