无菌检验室、微生物限度检验室、阳性对照室验证方案
微生物限度和无菌检查法验证
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方法验证的步骤与内容 1、制备验证试验用菌液 按药典无菌检查法中培养基灵敏度检查项中试验用 菌液的制备方法将规定需用的试验菌分别制成每毫 升中含10～100个菌（CFU）的供试菌液。 2、样品的前处理方法 样品的前处理方法是验证试验的一部分，需证明所 用的处理方法对各试验菌的生长无影响。 根据供试品的性状，选用以下适宜的方法，或几种 方法联合使用： 溶解：验证所用溶液、助溶剂和水浴助溶温度对微 生物的生长无影响。
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乳化：验证所用乳化剂和水浴助溶温度的有效性、 使用量及对微生物的生长无影响。 破乳：验证所用破乳剂的有效性、使用量及对微生 物的生长无影响。 萃取：验证有机相选择的合理性、有效性及对微生 物的生长无影响。 稀释：验证降低供试品相对抑菌浓度的有效稀释倍 数。 离心：验证所用转速、时间和微生物的分布情况。 应说明采取某种前处理方法的原因，如样品不需要 特别的前处理就能制成均匀的供试液，这一步可以 省掉，直接进入确定样品有无抑菌性的步骤。
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选择适当的方法消除或有效降低供试品的抑菌性 根据供试品的特性选择药典规定的消除其抑菌性的 方法（一种或几种方法联合），或根据药物的化学 特性，寻找出其他合理、有效的方法，特别是有效 的中和剂；并通过模拟试验（验证试验）对消除或 降低抑菌性的效果进行检验。 无菌检查可采用：①薄膜过滤法；②中和法（目前 药典仅收载β-内酰胺酶处理法）。 ①薄膜过滤法适用于液体供试品和可溶于水的固体 供试品（只要许可，应首先采用）。验证的重点是 确定滤膜的适用性、确定冲洗的方法和冲洗液的用 量。
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方法验证中应注意的问题与评价要求 1、验证试验的完整性 验证试验的完整性与方法的科学性密切相关，验 证工作不完整，就不能全面体现供试品和试验过 程对微生物的影响情况，则很可能影响或干扰对 最终试验结果的判断。故应按照中国药典2005年 版的要求进行方法验证。特别是对某些具有抑菌 性的供试品，需采取适当的方法消除或有效降低 供试品的抑菌性。在对供试品进行特殊处理时， 既要考察供试品的抑菌性，还要考察在供试液制 备过程中微生物受影响的程度（稀释剂对照组） 。
GMP检查细则(菌检室)
. GMP检查细则（2008年版）2802 生物检定、微生物限度检定和放射性同位素检定等应分室进行。
-- 微生物检测室一般分：无菌检测室、微生物限度检测室、阳性对照室。
-- 无菌室检测室：万级背景下的百级层流。
有条件的企业可采用隔离操作系统，保证环境条件优于或等于生产环境，防止假阳性-- 微生物限度检测室：万级背景下的百级层流-- 阳性对照室：用于微生物鉴别、毒、菌种传代等。
条件好的企业可以使用生物安全柜，避免致病菌的扩散。
条件差的可使用层流柜，但必须是垂直流的。
阳性对照室的回风应经过处理后直排。
-- 抗生素效价测定、不溶性微粒测定一般要求在避菌条件下进行，可在层流操作台下完成。
◇检查微生物实验室应注意：-- 无菌室和微生物限度室不可公用更衣室及缓冲间，防止污染无菌室；-- 无菌检查时要监测环境，同时作沉降菌检查；定期对微生物实验室作环境监控，测悬浮粒子及沉降菌。
-- 检查企业是否做无菌室及层流柜的高效过滤器检漏试验，是否定期验证。
1．无菌检查室应按无菌操作区管理，至少应在10，000级背景下的局部100级超净工作台内进行，不得与生物检定、微生物限度检查，污染菌鉴别和阳性对照试验使用同一试验室。
2．无菌检查室与非无菌操作间共享人流通道时，有无相应的管理措施，如避免在同一时间同时做不同性质的试验；对检品外表面进行取样，看消毒是否达到预期的效果等。
3．微生物限度试验、生物负荷（Ambient load或Bioburden）检查可在同一室进行；孢子D值测定、污染菌鉴别和阳性对照试验可在同室进行但应使用不同的LAF操作台；细菌内毒素检查不需要无菌操作条件。
这些试验均应有书面规程，并有防止污染的措施。
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无菌检验室微生物限度检验室阳性对照检验室验证方案
无菌检验室微生物限度检验室阳性对照检验室验证方案编号：无菌检验室微生物限度检验室阳性对照检验室空气净化系统验证方案验证方案起草人：日期：验证方案批准人：日期：企业名称年月目录1．引言1．1概述1．2验证的目的2．验证标准3．检验室的自净器和层流罩安装确认4．检验室的自净器和层流罩运行确认4．1风速测定4．2压差测定4．3温湿度测定5．洁净度测定5．1悬浮粒子测定5．2沉降菌测定6．验证结果及评价7．责任8．时间安排1．引言1．1概述无菌检验室是专供医疗器械无菌检验用，微生物限度检验室是专供医疗器械微生物检验用，阳性对照检验室是专供医疗器械菌检时阳性对照实验用，这三个实验室专用。
,检验室顶棚安装自净器一台,向室内送洁净空气,洁净级别为10000级,室内还安装层流罩一个,层流罩下洁净级别为100级。
1．2验证的目的1.2.1检查并确认检验室的自净器层流罩的安装符合设计要求。
1.2.2检测并确认检验室的自净器层流罩的运行性能应能达到药品菌检要求及验证标准。
1.2.3洁净度测试,确认检验室能达到规定的洁净度。
3．检验室的自净器和层流罩安装确认3．1部件安装确认检查人: 日期:3．2高效过滤器的检漏测试采用尘埃粒子计数器对高效过滤器进行检漏测试，采样头离过滤器距离约2cm，沿过滤器出风侧及内边框来回扫描。
检漏测试结果记录在自净器和层流罩运行确认记录上。
4．自净器和层流罩的运行确认4．1风速测定采用风速仪贴近高效过滤器出风口测定，一般测定4个点，求出平均风速。
层流罩测定8个点，求平均风速。
4．2压差测定采用微压表测定4．3温度、相对湿度测定采用干湿球温度计测定自净器和层流罩测试人: 日期:结果分析及评价:5．洁净度的测定5．1悬浮粒子测定5.1.1方法:采用尘埃粒子计数器,每个检验操作室测试3次,每个检验操作室采样点2个,层流罩下采样点4个,采样点的高度离地面1m。
求平均值。
悬浮粒子测定在自净器和层流罩运行30分钟后进行。
阳性对照实验室说明
实验室说明
阴性对照实验区、阳性对照实验区共用人流物流通道未能有效严格区分，易出现交叉污染。
且在《药品检验所实验室质量管理规范》(试行)在第十八条：无菌检查室与阳性对照室应严格分开。
在GMP检查中的2802条项中明确规定：无菌检查室不得与阳性对照室使用同一实验室。
条项解释中提到“无菌室和阳性对照室不可公用更衣室及缓冲间，防止污染无菌室”。
再结合《医药工业洁净厂房设计规范》（GB50457-2008）5.1.13条第2款：各类实验室的设置，应符合下列要求：
1）阳性对照、无菌检查、微生物限度检查和抗生素微生物检定等实验室，以及放射性同位素检定室等应分开设置。
2)无菌检查室、微生物限度检查室应为无菌洁净室，其空气洁净度等级不应低于10000级，并应设置相应的人员净化和物料净化设施。
中检所苏德模老师等主编的《药品微生物学检验技术》一书中提到：现代微生物学实验室应基本满足下列要求：（1）具有开展无菌检查、微生物限度检查、无菌采样等严格分开的、环境洁净度均为10000级、局部100级洁净室。
（2）抗生素微生检定、抗菌作用测定等实验应各自有分开的半无菌实验室。
并与无菌检查、微生物限度检查的实验室严格分开，注意防止抗生素污染引起的实验结果假阴性。
（3）单独分开的细菌培养室、霉菌培养室。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.4.1 试验前的准备:4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天内使用。
4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释：4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。
无菌检验室微生物限度检验室阳性对照检验室
无菌检验室微生物限度检验室阳性对照检验室验证方案无菌检验室微生物限度检验室阳性对照检验室验证方案编号：无菌检验室微生物限度检验室阳性对照检验室空气净化系统验证方案验证方案起草人：日期：验证方案批准人：日期：企业名称年月目录1．引言1．1概述1．2验证的目的2．验证标准3．检验室的自净器和层流罩安装确认4．检验室的自净器和层流罩运行确认4．1风速测定4．2压差测定4．3温湿度测定5．洁净度测定5．1悬浮粒子测定5．2沉降菌测定6．验证结果及评价7．责任8．时间安排1．引言1．1概述无菌检验室是专供医疗器械无菌检验用，微生物限度检验室是专供医疗器械微生物检验用，阳性对照检验室是专供医疗器械菌检时阳性对照实验用，这三个实验室专用。
,检验室顶棚安装自净器一台,向室内送洁净空气,洁净级别为10000级,室内还安装层流罩一个,层流罩下洁净级别为100级。
1．2验证的目的1.2.1检查并确认检验室的自净器层流罩的安装符合设计要求。
1.2.2检测并确认检验室的自净器层流罩的运行性能应能达到药品菌检要求及验证标准。
1.2.3洁净度测试,确认检验室能达到规定的洁净度。
2．验证标准洁净级别项目10000级100级压差Pa5Pa尘埃粒子/M3≥0.5μm ≥5μm ≤3500000≤20000≤3500沉降菌CFU/皿≤10≤1温度/相对湿度18～26℃/45～65%3．检验室的自净器和层流罩安装确认3．1部件安装确认部件名称设计要求安装情况风机风量 1000m3/h 风压 150Pa电机功率 2.2kw高效空气过滤器480×4804个层流罩BCZⅡ-1220/6101个部件名称设计要求安装情况风机风量 1000m3/h 风压 150Pa 电机功率 2.2kw高效空气过滤器480×4804个层流罩BCZⅡ-1220/6101个部件名称设计要求安装情况风机风量 1000m3/h 风压 150Pa 电机功率 2.2kw高效空气过滤器480×4804个层流罩BCZⅡ-1220/6101个检查人: 日期:3．2高效过滤器的检漏测试采用尘埃粒子计数器对高效过滤器进行检漏测试，采样头离过滤器距离约2cm，沿过滤器出风侧及内边框来回扫描。
微生物限度检查方法及其验证报告(修改)
文档来源为:从网络收集整理.word 版本可编辑.欢迎下载支持.文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告目录样品相关信息 基本信息主要仪器设备和试验耗材信息 主要使用的仪器设备 试验用培养基 试验用试剂 试验用菌种 试验环境 无菌室 洁净工作台 生物安全柜 试验方案 验证试验目的微生物限度检查方法草案 方法验证试验菌液制备计数培养基适用性检查控制菌检查用培养基使用性检查 供试液制备 方法验证菌落计数方法验证试验 控制菌检查方法的验证方法验证结论供试品微生物限度检查结果 样品相关信息 基本信息（三批）1 1.12 2.1 2.2 2.3 2.4 3 3.1 3.2 3.3 4 4.1 4.25 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.5.15.5.2 5.6 6 1 1.12主要仪器设备和试验耗材信息2.1主要使用的仪器设备2.2试验用培养基2.2.1对照培养基2.2.2试验用培养基2.3试验用试剂2.4试验用菌种3试验环境《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。
3.1无菌室无菌室按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。
3.2超净工作台超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
超净工作台沉降菌检测记录3.3生物安全柜生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
生物安全柜沉降菌监测记录4试验方案按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过lOOOcfu,霉菌和酵母菌总数不得过lOOcfu，大肠埃希菌不得检出。
微生物限度检查方法验证方案
微生物实验室检测设备配置方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录XI J微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.1.1试验前的准备：4.1.1.1试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃,灭菌30 min,在3天内使用。
4.1.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖甘酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制微生物实验室检测设备配置方案说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃, 灭菌15 min，在3周内使用。
4.1.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
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无菌检验室微生物限度检验室
阳性对照检验室黑曲霉对照检验室
验证方案
上善医疗器械
2011年月
目录
１.验证的目的
２.验证小组成员
３.验证小组分工
４.验证依据
５.标准容
６.检验室的自净器和超净台安装确认
7.自净器和超净台的运行确认
8.洁净度的测定
9.验证结果及评价：
10.责任
1．验证的目的
1.1检查并确认检验室的自净器和超净台的安装符合设计要求。
1.2检测并确认检验室的自净器和超净台的运行性能应能达到检验要求及验证标准。
1.3洁净度测试,确认检验室能达到规定的洁净度。
3验证小组分工：
3.1组长：负责审核验证方案是否可行。
3.2副组长：负责组织实施验证、审核测试结果、评价及结论，负责验证报告的会签与批准。
3.3组员：负责无菌检验室、微生物检验室、阳性对照检验室、黑曲霉对照检验室的验证过程；提供监测结果。
3.4组员：负责无菌室正常管理。
4.验证依据：
GB—T16294—1996 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法
YY0033-2000 无菌医疗器具生产管理规
6．检验室的自净器和超净台安装确认
6.1部件安装确认
6.2高效过滤器的检漏测试
采用尘埃粒子计数器对高效过滤器进行检漏测试，采样头离过滤器距离约2cm，沿过滤器出风侧及边框来回扫描。
检漏测试结果记录在自净器和超净台运行确认记录上。
7．自净器和超净台的运行确认
7.1风速测定
采用风速仪贴近高效过滤器出风口测定，一般测定4个点，求出平均风速。
超净台测定8个点，求平均风速。
7.2压差测定
采用微压表测定
7.3温度、相对湿度测定
采用温湿度记录仪测定
7.4结果记录如下：
结果分析及评价:
8．洁净度的测定
8.1尘埃粒子数测定
采用尘埃粒子计数器,每个检验操作室测试3次,每个检验操作室采样点2个,超净台采样点4个,采样点的高度离地面1m。
求平均值。
尘埃粒子数测定在自净器和超净台运行30分钟后进行。
尘埃粒子数测试记录( )
平均值0.5μm 个, 5μm1 个
平均值0.5μm 个, 5μm 个
测试人: 日期:
结果分析及评价:
8.2沉降菌测定
医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》有关要求采用φ90mm培养皿，将培养皿按要求放置后，打开平皿盖，使培养基表面暴露30分钟后，将平皿盖盖上，然后在30—35℃下培养48小时后计数。
沉降菌测定在自净器和超净台运行30分钟后进行。
沉降菌测定记录表
结果分析及评价:
9．验证结果及评价：
9.1 4个检验室自净器和超净台安装均符合设计要求。
9.2 4个检验室风速、压差均符合运行设计要求。
9.3 洁净度测定表明,4个检验室尘埃粒子数和沉降菌均符合验证标准。
超净台
工作区均达到洁净级别100级。
9.4 建议对4个检验室应加强日常监测,当更换高效空气过滤器后应重新测定风
速和洁净度。
10．责任
验证小组负责验证方案的制定、批准及实施；
品管部经理负责无菌检验室、微生物检验室、阳性对照检验室的验证过程；验证小组负责审核测试结果、评价及结论，负责验证报告的会签与批准，
负责制定无菌检验室、微生物检验室、阳性对照检验室验证的周期。