染色方法总结-免疫学技术讨论版-丁香园论坛
各种染色技术总结
一、原理：1、革兰氏染色原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
2、芽孢染色法的原理:芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。
细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。
芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。
芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basic fuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且也可进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。
用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。
3、荚膜染色法的原理:荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景着色，而把不着色且透明的荚膜衬托出来。
免疫组化染色的操作技巧和注意事项
免疫组化染色的操作技巧和注意事项【摘要】目的本院对免疫组化染色过程中存在的问题及对策进行深入的探讨以及仔细的分析。
方法自从2010 年6 月~2011 年7 月期间, 本院共收治免疫组化染色标本患者有200 例, 对其中存在问题的60例患者标本进行了仔细的分析, 并且要提出科学的应对措施。
结果本院对疫组化染色过程提出了主要的积极应对措施和科学的建议。
结论对于每一个步骤以及环节, 都会影响到染色的最终后果, 对此, 要尽量避免在染色过程中会出现一些问题, 会使免疫组化染色的质量有所提高。
【关键词】免疫组化；技术方法；质量控制；抗原修复；原因分析对于免疫组化(IHC) 技术在上世纪的80 年代之后, 在我国就迅速的开展, 至今已经有20 年快速发展的历程, 现在已经逐渐的成为病理科工作中主要的组成要素。
综合性操作技术主要是导致免疫组化, 这样会使其反应步骤增加, 出现复杂的影响因素, 技术员在基础技术上的操作要求是相对较高的, 对免疫组织学习要进行不断的提高, 了解这种技术在病理诊断方面是主要的辅助方式, 在对疾病诊断、分析、预后以及指导临床个体化治疗等方面, 都有着主要的作用。
在免疫组化的技术方面, 也存在着各种实质性的问题, 收治免疫组化染色标本200 例, 其中有60 例标本存在着问题, 本院对其进行仔细的分析, 并且提出相应的科学对策治疗方式。
1 免疫组化染色不理想的原因分析及改进措施1. 1 由于大分子的化学结构相对稳定, 它在水中呈现胶状体, 不易被机体破坏或排除, 这样在体内存留时间就很长, 有利于持续刺激淋巴细胞。
抗体是人体抵抗感染的一种重要武器, 抗体是人或动物受抗原物质刺激后, 由浆细胞合成和分泌的一种特异性蛋白质, 并具有疏水性, 因此当对抗体进行稀释时可降低它的疏水性, 当pH 接近抗体的等电点时, 抗体的疏水性能十分巨大。
1. 2 抗体与抗原的交叉反应抗原是一类能诱导免疫系统发生免疫应答, 并能与免疫应答的产物发生特异性结合的物质；抗体是人或动物受抗原物质刺激后, 由浆细胞合成和分泌的一种特异性蛋白质。
常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色
常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色1. 原理：链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素（Biotin）连接的部位，且二者间有极强的亲和力，SA的等电位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10，因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。
S-P采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
2. 基本染色方法：（1）石蜡切片脱蜡至水。
（2）3%H202室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
（4）5～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。
（5）PBS冲洗，5分钟×3次。
（6）滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10～30分钟; 或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（7）PBS冲洗，5分钟×3次。
（8）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS 稀释)，37℃孵育10～30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（9）PBS冲洗，5分钟×3次。
（10）显色剂显色（DAB或AEC）。
（11）自来水充分冲洗，复染，封片。
（附，冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。
用3%过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2次。
各种染色方法及应用
各种染色方法及应用染色方法是将其中一种溶液或固体直接或间接地涂在物体表面，使物体表面发生染色变化的方法。
不同的染色方法具有不同的应用。
下面将介绍几种常见的染色方法及其应用。
1.偶氮染色法：这是一种常见的染色方法，其特点是染色剂会通过偶氮键与物体表面发生共价键结合，形成稳定的染色物质。
这种染色方法应用广泛，常用于纺织品、皮革、画布等材料的染色。
2.免疫染色法：免疫染色法是一种基于抗原抗体反应的染色方法，常用于细胞与组织学研究中。
它利用抗体与目标抗原特异性结合的原理，通过标记抗体的染色剂对目标抗原进行染色，从而实现对细胞或组织中其中一种蛋白质的定位和检测。
3.基础性染色法：这种染色方法基于酸碱中心的化学反应，常用酸性染料和碱性染料进行染色。
酸性染料主要用于染色细胞核和酸性细胞组分，碱性染料主要用于染色细胞质和碱性细胞组分。
基础性染色法在细胞学和组织学研究中有着广泛的应用。
4.荧光染色法：荧光染色法是利用荧光染料的特性进行染色的方法。
荧光染料在受到特定波长的激发光后，能够发射出可见光。
这种染色方法常用于细胞与组织的荧光显微镜观察、标记和分析。
5.铅盐染色法：这种染色方法利用铅盐与一些物质产生沉淀反应，从而在物体表面生成一层颜色。
铅盐染色法常用于建筑材料（如石膏、水泥等）的染色，同时也可用于鉴定纤维、纤维素素质等。
6.显色剂染色法：显色剂染色法是利用显色剂与一些物质在化学反应中产生颜色的原理进行染色的方法。
这种染色方法常用于病理学、组织学等领域的染色技术，用于显示细胞和组织中特定化学物质的分布和含量。
7.包裹染色法：这种染色方法是指将其中一种物质（如蜡、树脂等）包裹在物体表面，然后通过对包裹物进行染色的方法。
包裹染色法常用于生物学实验中对载玻片进行固化、染色和显微观察，以便进行组织学研究。
以上是几种常见的染色方法及其应用。
不同的染色方法在不同领域具有特定的优势和适用范围，选择合适的染色方法对于研究和应用具有重要的意义。
免疫组织化学技术：染色步骤
免疫组织化学技术：染色步骤免疫组织化学技术:染色步骤一、免疫荧光法１．直接法（1）冰冻切片、涂片、印片或单层细胞培养物按要求进行固定，石蜡切片常规脱蜡后用酶消化处理，然后水化，用0.01mol/L PH7.2---7.4PBS洗5分钟，冷风吹干，放入湿盒中。
（2）滴加经稀释的荧光抗体，37℃ 30-60分钟或4℃过夜（3）PBS 洗2次，蒸馏水洗1次（4）50%甘油缓冲液封片（5）荧光显微镜下检查（6）对照染色①阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阳性。
②阴性对照，用确知不存在靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阴性。
③空白对照，用免去特异性抗体或用PBS替代特异性抗体，结果应为阴性。
④抑制试验，将标记抗体(例荧光抗体)和未标记的抗体或血清等量混合后，按上述步骤处理切片，结果应为阴性（一步法）。
或将待检切片两张，一张加未标记特异性血清，另一张加未标记同种正常血清，孵育后冲洗，再加入标记的特异性血清（例如特异性荧光标记抗体），加了未标记特异性血清的切片因抗原抗休已结合，故染色被抑制，呈阴性结果，而加同种正常血清的切片则呈阳性反应（二步法）。
对照染色非常重要，开始试验时应做全面对照，每次试验时应做阳性和阴性对照。
2．间接法（1）标本处理同直接法。
（2）滴加适当稀释的特异性抗体于标本上，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟或４℃过夜。
（3）滴加适当稀释的间接荧光抗体，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟。
（５）ＰＢＳ洗２次，双蒸水洗１次。
（６）甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察。
（７）对照染色：可用空白对照和阴性对照等。
３．补体法（１）标本处理同直接法。
（２）滴加适当稀释的特异性抗体及补体的等量混合液，置湿盒中，３７℃３０分钟，ＰＢＳ洗３次。
（３）滴加适当稀释的抗补体荧光抗体，置理盒中，３７℃３０分钟。
ＰＢＳ洗２次，蒸馏水洗１次。
（４）甘油缓冲液封片。
（５）对照染色，可作正常血清替代，灭活补体对照即经５６℃３０分钟灭活处理后，将灭活的补体与特异性抗体等量混合，进行染色，结果均应阴性。
免疫荧光技术：染色方法
免疫荧光技术：染色方法（一）制片选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。
用时取出用绸布擦净。
将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。
也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。
（二）固定除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。
固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。
标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。
（三）水洗固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
（四）染色染色分直接染色法与间接染色法。
1．材料与试剂（1）荧光抗体，稀释至应用浓度。
（2）0.01Mol/L pH7.4PBS液（3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。
甘油有减少非特异性荧光的作用。
（4）带盖方盘2．直接染色法（1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30 min～45min。
（2）PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。
（3）蒸馏水冲洗。
（4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。
2．间接染色法（1）检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS 液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min；④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。
检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液（按1﹕100～1﹕500稀释），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。
常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
免疫组化染色
免疫组化染色一、固定在12孔板中先用PBS洗两遍，把培养液洗掉，然后加入4%的多聚甲醛（PFA）10min（室温），再用PBS洗3次，每次间隔5 min。
二、破膜将玻片夹到封口膜上（在封口膜上滴加PBS），0.05% Triton PBS 破膜2 min（室温条件下），PBS洗3次，每次间隔5 min。
注释：第一步和第二步可以合并，具体操作如下固定和破膜1、在12孔板中加入4%的多聚甲醛（PFA），轻柔摇匀使其铺满孔板后将玻片加到孔板中，37℃，20~30 min。
2、将玻片夹到封口膜上（在封口膜上滴加PBS），0.1 % Triton PBS （浓度最高不超过0.3 %）破膜2 min，PBS洗3次，每次间隔5 min（清洗时应该沿孔壁清洗不要接触玻片，否则其表面的细胞会被清洗掉）。
三、封闭用二抗来源的10% 的血清封闭，室温封闭1 h。
封闭缓冲液（20mL）10 % NGS （山羊血清Normal Goat Serum）0.05 % Tween 20 （10 % Tween 20 100uL）1×PBS 加至20mL注释：如果时间来不及可放置在4°中过夜。
四、一抗用5% 的血清配一抗（血清也是二抗来源的），一抗浓度根据说明书。
4℃过夜，每个玻片150ul。
PBS洗6次，每次间隔5 min。
或者用5% 的血清配一抗（血清也是二抗来源的），一抗浓度根据说明书。
将封闭缓冲液吸掉，加入PBS，轻柔摇匀使其铺满孔板。
将一抗先滴加在封口膜上，用镊子夹起玻片，在纸上吸掉水。
将没有细胞的面擦干，然后将有细胞的面慢慢盖在一抗上，室温放置2~3 h。
五、二抗用1:500 （PBS），每个玻片150ul，避光1 h。
PBS洗6次，每次间隔5 min。
加二抗的方法同上六、封片10ul 封片液先滴在载玻片上，尽量不要产生气泡，用镊子夹起玻片，在纸上吸掉水。
将没有细胞的面擦干，然后将有细胞的面慢慢盖在封片剂上，注意封片剂容易凝固。
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染色方法总结-免疫学技术讨论版-丁香园论坛AAgNOR染色法:1、试剂配制：（1）AgNOR染色液：甲液：明胶2 g 溶于双蒸水至99 ml，在60℃使之完全溶解，再加入纯甲酸1 ml 摇匀待用。
乙液：硝酸银50 g 溶解于双蒸水中至100 ml，4℃冰箱保存。
（2）AgNOR工作液取甲液10 ml，乙液20 ml 临用前混合。
2、步骤：（1）切片脱蜡至水（2）双蒸水洗2次（3）AgNOR 工作液中（25℃）浸染30分钟（暗处进行）（镜下观察）（4）双蒸水洗3次（5）脱水,透明,封固3、结果：油镜观察，细胞核及胞质背景为淡黄色， AgNOR呈棕黑色颗粒状。
B鞭毛染色法:１．试剂配制：甲液：丹宁酸５克氯化铁（ＦｅＣｌ3）１．５克福尔马林（１５％）２．０毫升氢氧化钠（ＮａＯＨ）１％１．０毫升乙液：硝酸银（ＡｇＮＯ3）２克蒸馏水１００毫升制备乙液时，待硝酸银溶解后，取出１０毫升备用，向余下的９０毫升硝酸银液中滴加浓氢氧化铵，先呈很浓厚的沉淀，再继续滴加至刚刚溶解沉淀成澄清液为止。
再将备用的硝酸银溶液慢慢逐滴加入澄清液中，先呈现薄雾，但轻摇则消失，继续边滴加边摇动，待澄清液呈现略有轻微不消散的薄雾状为止。
如雾重，则银盐沉淀，不宜使用。
２．染色方法：（１）将待检菌接种在新制备的肉汤琼脂斜面上，置３７°培养１６—２０小时，备用。
（２）在载玻片的中部相隔一厘米处，用接种环各沾一滴蒸馏水，然后用接种环挑取湿润处的菌苔少许于一端的水滴中，倾斜玻片使培养物流至另一水滴中，两水滴自然相通，菌体从上位自然扩散到下位水滴中，待干燥后染色。
（３）在干燥涂片上加甲液３—５分钟，用蒸馏水冲洗。
将残水沥干或用乙液冲去残水后，加适量乙液保持３０—６０秒钟。
染色时在酒精灯上稍加热，使染液出现蒸汽即可，用蒸馏水冲洗。
（４）镜检：菌体及鞭毛皆染成茶色。
３．注意事项：（１）染液最好随用随配，存放至次日效果则差。
（２）一定要充分洗净甲液后再加乙液，否则背景较脏。
（３）防止水及培养物沾有氯化物。
（４）切忌用接种环涂抹培养物。
（５）载玻片一定要洗净。
先用洗衣粉煮沸，再水洗，干后放在洗液中，浸泡２４小时，取出水洗除去残酸，沥干，存放于９５％乙醇中备用。
（６）加热时最好置金属板上，使载玻片受热均匀。
β－半乳糖苷酶可以催化二糖乳糖水解为单糖：葡萄糖和半乳糖。
β－半乳糖苷酶的活性可以用X-gal（5-溴－4-氢－3－吲哚－β－D－半乳糖苷）等显色底物加以检测，β－半乳糖苷酶可将X-gal转变为不溶性的深蓝色沉淀。
X-gal可以做为组织染色剂，可以在所有表达β－半乳糖苷酶的植物和动物组织上产生颜色。
应该是可以用来病毒感染组织切片染色的。
CCAE染色步骤1、试剂配制：（1）A液：萘酚-AS—D氯醋酸10mg溶于N,N-二甲基甲酰胺1ml中。
（2）4％副品红液：取盐酸副品红(EM级)1g，溶于蒸馏水20ml 内，再加入10m1／L的HCl 5m1，稍加温以增加溶解度，过滤、贮室温下。
于使用前，取等量副品红液与新鲜的4％亚硝酸钠混合，之后用淀粉碘化物试纸测试，瞬间试纸应变为蓝色才合格，如果不变色，应加入更多的亚硝酸盐。
（3）B液：o．1mol/L的Michaelis Veronal-醋酸缓冲液(PH 7.6)30ml，加入新配制的副品红液3滴，用1moI／L HCl使PH值调至6．3。
2、染色步骤：（1）将A.、B二液混合，过滤，加入氟化钠(17mg/10ml), 使之最后浓度为0.04mol/L.（2）切片置于上述溶液内孵育1h(30℃)（3）流水冲洗。
（4）苏木素复染。
（5）空气干燥后封固。
GGrimelius硝酸银反应法（嗜银反应）:1、试剂配制：硝酸银液: 1%硝酸银水溶液 3毫升蒸馏水 87毫升0.2M醋酸缓冲液(PH5.6) 10毫升还原液: 对苯二酚 1克亚硫酸钠 5克蒸馏水 100毫升2、染色步骤:（1）切片脱蜡至蒸馏水（2）60℃硝酸银液内3小时（3）用滤纸吸去周围银液,蒸馏水速洗（4）入45℃的还原液处理1分钟（5）蒸馏水洗（6）5%硫代硫酸钠处理1 分钟(可不做)（7）水洗,脱水,透明,封固3、结果：嗜银颗粒呈棕黑色。
正常时嗜银颗粒存在于神经内分泌细胞，故此法主要用于神经内分泌肿瘤的诊断。
HHID染色法1、染色步骤:（1）切片脱蜡至蒸馏水（2）放入预热的1当量盐酸中10分钟（3）蒸馏水洗（4）Schiff液中染10分钟（5）自来水洗15分钟至细胞核红色（如2～5步不做，可在染好爱先蓝后染核固红2分钟）（6）蒸馏水洗（7）高铁二胺液 18～24 小时（8）爱先蓝液(pH2.5)染10～20分钟（9）蒸馏水洗（10）脱水,透明,封固2、结果: 硫酸化酸性粘液呈棕黑色,羧基化酸性粘液（唾酸粘液）物质蓝色。
硫酸化酸性粘液可见于大肠粘膜，而小肠粘膜仅出现唾酸粘液，此法多用于确定肠化的分型。
HP（硝酸银法）1、试剂配制：（1）醋酸缓冲贮备液，PH3.60.2N醋酸缓冲液，PH3.6 10 ml蒸馏水 240 ml以下各液均用此液配制（2）1 %硝酸银液硝酸银 1 g醋酸缓冲贮备液，PH3.6 100 ml（3）2 %硝酸银液硝酸银 0.2 g醋酸缓冲贮备液，PH3.6 10 ml（4）5 %明胶液明胶 5 g醋酸缓冲贮备液，PH3.6 100 ml先把醋酸缓冲贮备液加温至40℃左右，然后倾入明胶，于37℃温箱内慢慢溶解，搅拌。
（5）3 %对苯二酚液对苯二酚 0.3 g醋酸缓冲贮备液，PH3.6 10 ml（6）明胶对苯二酚液3 %对苯二酚液 1 ml5 %明胶液 15 ml（7）显影液明胶对苯二酚液 16 ml2 %硝酸银液3 ml在操作到第4步完成前5分钟充分混合，置于56℃水浴箱中保温待用。
2、操作方法：（1）组织脱蜡至蒸馏水（2）醋酸缓冲贮备液洗2次（3）入1 %硝酸银液中，56℃，1小时（4）切片不水洗，直接放入预热的显影液中56℃，肉眼呈黄棕色为止。
（5）倾去显影液，于56℃的水中浸洗2分钟（6）水洗（7）脱水，透明，封固。
3、结果：幽门弯曲菌呈棕黑至黑色。
Highman甲醇刚果红染色法（类淀粉染色）1、试剂配制：甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.2 g 80%乙醇 100 ml2、染色步骤:（1）切片脱蜡至水（2）甲醇刚果红染液染10～20分钟（3）用碱性乙醇分化液分化数秒（4）水洗（5）苏木素复染2分钟（6）水洗（7）脱水,透明,封固3、结果：淀粉样物呈桔红色。
4、类淀粉染色的应用：确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色，常用于诊断甲状腺髓样癌和胰岛细胞瘤等。
L六胺银染色法1、试剂配制：六胺银液配制：3%六次甲基四胺水溶液 5 ml2.5%硝酸银水溶液 0.5 ml摇晃，变清，再加2.5%四硼酸钠1.5~2 ml加蒸馏水至30~40 ml2、步骤：（1）切片脱蜡至水，蒸馏水洗（2）0.5%高碘酸浸15分钟，蒸馏水洗（3）六胺银液60℃，1-2小时，（或六胺银液80-90℃，半小时左右）蒸馏水洗（镜下基底膜呈黑色）（4）0.2% 氯化金调色数秒（5）丽春红淡染（6）水速洗（7）烘干，透明，封片。
3、结果：肾小球基底膜呈黑色，霉菌，弹力纤维及一些网状纤维也呈黑色。
MMallory 三色法1、步骤（1）切片脱蜡至水（2）0.5%酸性复红水溶液1 min（3）蒸馏水洗（4）入下液1-2min苯胺蓝0.5g，桔黄G 2g，磷目酸或磷钨酸 1g，蒸馏水100ml。
（5）蒸馏水洗（6）95%乙醇分色（7）脱水，透明，封片。
2、结果：胶原纤维蓝色，红细胞桔黄色，核红色。
M allory磷钨酸～苏木素染色法（PTAH）1、试剂配制：苏木素 0.1 g 磷钨酸 2.0 g 蒸馏水 100 ml先将苏木素加热溶于20毫升蒸馏水,再将磷钨酸溶于80毫升蒸馏水。
等苏木素冷却后，加入磷钨酸溶液，混合，放置数星期后，才可使用。
如急用，可加入0.2 g高锰酸钾,加速其成熟。
2、染色步骤:（1）切片脱蜡至蒸馏水。
（2）放入0.25%高锰酸钾水溶液5分钟。
（3）蒸馏水洗。
（4）2.5%草酸漂白5分钟。
（5）蒸馏水洗多次。
（6）置于磷钨酸苏木素溶液12～24小时。
（7）95%酒精快速分化，滤纸吸去剩余酒精，置60℃温箱中烘干。
（8）二甲苯透明，封固。
3、结果：纤维胶质，肌胶质，神经胶纤维，纤维素，横纹肌等均染成蓝色。
胶原，网状纤维和骨基质着黄色或砖红色。
在工作中常用于观察横纹以证实肿瘤细胞是否有横纹肌分化特征。
Masson 三色染色法、1、试剂配制：丽春红酸性品红液：丽春红 0.7 g 酸性品红 0.3 g蒸馏水 99ml 冰醋酸 1 ml苯胺蓝液: 苯胺蓝 2 g 蒸馏水 98 ml 醋酸 2 ml亮绿液：亮绿 0.2g 蒸馏水 100 ml 冰醋酸 0.2 ml苦味酸酒精液:苦味酸在95%酒精中的饱和液20 ml,加95%酒精10 ml2、染色步骤：（1）切片脱蜡至蒸馏水（2）苏木素染5～10分钟（3）盐酸酒精分化（4）流水蓝化，蒸馏水洗(苏木素可不染)（5）丽春红酸性品红液中染5～8分钟（6）蒸馏水洗（7）1% 磷钼酸中染1～3分钟（8）不用水洗直接入苯胺蓝液或亮绿液5分钟(如染色效果不佳,可在冰醋酸内脱色后重染)（9）水速洗，置60℃温箱中烘干，二甲苯透明,封固3、结果:胶原纤维蓝色（苯胺蓝复染）或绿色（亮绿复染）,肌纤维、纤维素红色。
4、注意：（1）此法广泛用于胶原纤维和平滑肌的鉴别，也为肾组织活检，观察肾小球病变的重要染色法，常用于观察缺血病变的心肌。
用于观察肾小球病变时，一定要用2um以下半薄切片。
（2）细胞核染色后分化很重要，观察控制着色程度。
而HE染色则是最常用的一种常规染色方法，但无法区别胶原纤维和肌肉。
N粘液染色（一）PAS染色法与染糖元的方法相同。
（二）AB(pH2.5)染色法1、试剂配制：爱先蓝8GX 1 g 蒸馏水 97 ml 冰醋酸 3 ml核固红液: 核固红 0.1g 硫酸铝 5g 麝香草酚 50mg 蒸馏水 97ml2、染色步骤:（1）切片脱蜡至蒸馏水。
（2）爱先蓝液染10～20分钟（3）蒸馏水洗（4）核复染(核固红5分钟)，水洗（5）脱水,透明,封固。
唾液酸及弱硫酸化粘液及一般粘液呈蓝色。
常用于确定胞浆内空泡的性质，特别是当细胞呈现印戒样特征时。
J甲基绿派洛宁法（改良Cook，1974）1、试剂配制：（1）2%甲基绿水溶液：甲基绿（methyl green）1g蒸馏水加至50ml用三氯甲烷抽提，方法详后。
（2）5%派洛宁水溶液：派洛宁G（pyronine G）1g蒸馏水加至20ml（3）0.2M醋酸盐缓冲液（pH 4.8）0.2M醋酸液41ml0.2M醋酸钠液59ml（4）甲基绿派洛宁染液：2%甲基绿水溶液（经抽提） 5ml5%派洛宁水溶液 1ml蒸馏水 12ml0.2M醋酸盐缓冲液（pH 4.8） 18ml甲基绿水溶液的抽提：甲基绿为绿色粉末，属三苯甲烷染料，这种染料是由氯代甲烷作用于结果晶紫而形成的一种化合物。