重组质粒电穿孔转染条件探讨
重组质粒的连接、转化及筛选
重组质粒的连接、转化及筛选概述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。
如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。
在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。
但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。
通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。
也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。
由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。
所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。
还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。
带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
ti质粒转化的原理
ti质粒转化的原理质粒转化是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，它能够将外源DNA导入到目标细胞中。
这项技术在基因工程、遗传转化和生物制药等领域具有重要的应用价值。
在本文中，我们将深入探讨质粒转化的原理，并分享对这个主题的观点和理解。
一、质粒转化的原理质粒转化的原理是通过改变细胞膜的通透性，使质粒能够进入目标细胞。
这样一来，外源DNA就能够在目标细胞内进行重组和复制。
下面将介绍两种常见的质粒转化方法：热激转化和电穿孔转化。
1. 热激转化热激转化是一种利用温度和钙离子改变细胞膜通透性的方法。
目标细胞在低温条件下与质粒一起处理，使细胞膜发生冷冻/融化循环。
接下来，细胞在高温条件下暴露于热激，此时细胞膜通透性增加，质粒得以进入细胞内。
将细胞培养在适当的培养基上，质粒就能够在细胞内进行复制和表达。
2. 电穿孔转化电穿孔转化通过应用电场脉冲的方式改变细胞膜通透性。
目标细胞和质粒混合，形成电穿孔转化液。
将电穿孔转化液暴露于电脉冲中，电场脉冲使细胞膜产生瞬时的微小孔洞，从而使质粒得以进入细胞内。
将细胞培养在适当的培养基上，质粒能够在细胞内进行复制和表达。
二、观点和理解质粒转化作为一项重要的分子生物学技术，具有广泛的应用前景。
通过质粒转化，我们能够将感兴趣的外源DNA导入到目标细胞中，进行基因操作和功能研究。
这项技术在基因工程领域有着重要的应用，例如构建重组蛋白表达系统、揭示基因调控机制以及研究细胞信号通路等。
作为文章写手，我认为质粒转化的原理和方法对于理解基因操作和基因功能的研究具有重要意义。
通过质粒转化，我们能够探索不同细胞中的基因表达方式、调控机制以及细胞间的相互作用。
这对于研究生物学中的许多重要问题，如发育生物学、细胞信号传导、肿瘤发生等，提供了强有力的工具和方法。
质粒转化不仅在基础研究中有着广泛应用，也在农业、医药和生物制药等应用领域发挥着重要作用。
通过质粒转化技术，我们能够将外源基因导入植物细胞中，创造出具有特定性状的转基因植物。
重组质粒导入细胞的方法
重组质粒导入细胞的方法重组质粒导入是一种常用的基因转染技术，它将外源DNA导入到目标细胞内，经过DNA定向插入和表达，使研究者能够在细胞和组织模型中对基因和蛋白质的功能和行为进行研究。
本文将介绍重组质粒导入细胞的方法。
一、化学法转染化学法转染是最传统的基因转染方法之一，主要优点在于操作简单、适用范围广，不需要任何特殊设备或技能。
化学法转染的工作原理是利用一种封闭性较强的转染剂（例如聚乙烷醇）将目标质粒导入到细胞内。
虽然化学法转染方法简单，但其转染效率通常较低，DNA损伤和细胞毒性都会影响转染效果。
二、电穿孔法转染电穿孔法转染是一种利用电场导致细胞膜通透性改变增强质粒DNA导入效率的方法。
在电穿孔法转染前，将目标细胞与DNA及电极置于石墨电极板之间，应用连续的高压电脉冲将DNA导入到细胞内。
这种方法在独立单元上进行转染，非常适合小规模的试验。
电穿孔法转染具有高效性和灵活性，但也存在一些局限，如只能转染特定类型的细胞，而且该方法的DNA递送不是特别生物稳定。
三、超声波法转染超声波法转染是目前使用最广泛、最有效的基因转染技术之一。
利用高强度超声波打破细胞壁和细胞膜，让DNA等外源分子透过细胞膜，进入细胞内。
这种方法无需使用化学或物理转染试剂，不会引起毒性或细胞破坏。
因此，超声波法转染是一种相对安全、简单、快速高效的细胞转染技术。
但由于超声波聚焦效应难以控制，其应用范围有一定的限制。
四、病毒载体法转染病毒载体法是一种基因转染方法，把表达目标基因的所需DNA片段嵌入virus vector，再将其加入到细胞培养基中，由病毒携带入细胞，通过表达相关的基因来达到其作用。
这种方法具有高效性和高选择性，已被广泛应用于分子和细胞生物学和基因工程等领域。
五、染色体介导法转染这种转染方法利用已存在于基因组中的序列，将目标序列插入到它的喉管上，依赖于细胞的DNA修饰系统，将目标DNA插入到靶标染色体的特定位点上。
染色体介导法转染无需使用外源RNA、DNA分子，也无需添加任何刺激物，相对于其他转染技术更加可靠和可重复。
细胞的脂质体转染法和电穿孔法
细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法（一）脂质体转染一、实验试剂及器材Lipofectamine® 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM®减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。
二、实验步骤1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染；2. 使用Opti-MEM®减血清培养基稀释Lipofectamine® 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM®培养基为125 μL× 2，Lipofectamine® 3000为3.75和7.5 μL）；3. 在每管已稀释的Lipofectamine® 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）；4. 室温孵育5分钟；5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中；6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。
三、注意事项1. 在无血清培养基（如Opti-MEM®减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine® 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）；2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；3. Lipofectamine® 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine® 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染；4. Lipofectamine® 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。
附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：（二）电穿孔转染法一、实验试剂及器材BTX ECM2001®2001细胞电融合仪，细胞，胰蛋白酶，电转液，DMEM，培养板，离心机等。
电穿孔法转染细胞原理
电穿孔法转染细胞原理
电穿孔法转染细胞是一种常用的基因转染技术，它利用高压电脉冲破坏细胞膜，使外源DNA进入细胞内。
其原理如下：
1. 电场诱导细胞膜孔洞形成
电穿孔法转染细胞的第一步是利用高压电脉冲产生强电场，电场的作用下，细胞膜内部的离子和分子会发生移动，形成孔洞。
这些孔洞的大小和数量取决于电场的强度和持续时间。
2. DNA进入细胞内
一旦细胞膜形成了孔洞，外源DNA便可以通过孔洞进入细胞内。
这些DNA分子可以是裸露的质粒DNA，也可以是DNA与载体复合物。
3. 细胞修复孔洞
在电穿孔的过程中，细胞膜受到了破坏，但细胞会尽快修复这些孔洞。
细胞膜修复的过程中，外源DNA可能会被稳定地整合到细胞基因组中，从而实现基因转染。
总的来说，电穿孔法转染细胞利用高压电脉冲破坏细胞膜，使外源DNA进入细胞内，然后通过细胞修复孔洞的过程，使外源DNA整合到细胞基因组中。
这种技术可以用于基因敲除、基因表达、基因编辑等多种研究应用。
电穿孔转染质粒DNA
质粒的构建：1. 酶切反应按照1ugDNA需1-10u内切酶的用量，在反应体系中加入相应的10×缓冲液，内切酶的体积不得大于总体积的十分之一，ddH2O补足体系，如需长时间消化，还需加入适量的BSA 已稳定内切酶活性。
2. DNA片断的回收欲回收的DNA片断经琼脂糖凝胶电泳分离后，切下所需片断所在的凝胶（胶的体积尽可能小），加入3倍体积的BufferQX1,及适量的QIAXⅡ(Glassmilk),55℃10分钟，每隔2分钟涡旋1次，待凝胶完全溶解，12000转离心1分钟，BufferQX1洗涤沉淀1次以消除剩余凝胶.。
再用BufferB洗涤沉淀2次，将沉淀晾干，加入适当体积的ddH2O,离心后收集上清，琼脂糖凝胶电泳确定回收效率。
3. DNA片断3凹端的补平于Eppendorf管中依次加入DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10×）2ul,加水至19ul。
然后加入1-5单位Klenow酶，混匀后室温下反应15分钟。
待补平反应结束后，于65℃水浴20分钟使Klenow酶失活，电泳定量后即可用于连接反应或-20℃保存备用。
4. DNA片断3凸端的补平于Eppendorf管中依次加入DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10×）2ul。
,加水至19ul。
然后加入1-2单位T4噬菌体DNA聚合酶，12℃温育15分钟，于75℃加热10分钟，使T4噬菌体DNA聚合酶灭活。
5. 载体的脱磷酸化：载体质粒经内切酶酶切后可直接进行脱磷酸化处理。
40ul的酶切反应体系，景点永建车酶切完全后可加入10×CIAP（牛小肠碱性磷酸酶）缓冲液5ul,水4ul和适量CIAP进行脱磷酸化反应。
CIAP的用量依载体5端磷酸的摩尔数及末端性质而定，对于5突出的末端，每100pmol 5末端磷酸需1单位CIAP，对于5凹端或平末端，每2pmol 5端末端磷酸需1单位CIAP,一般2ug 5kb的线性化质粒DNA约翰1.4pmol 5端磷酸。
细胞的脂质体转染法和电穿孔法
细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法（一）脂质体转染一、实验试剂及器材Lipofectamine® 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM®减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。
二、实验步骤1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染；2. 使用Opti-MEM®减血清培养基稀释Lipofectamine® 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM®培养基为125 μL× 2，Lipofectamine® 3000为3.75和7.5 μL）；3. 在每管已稀释的Lipofectamine® 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）；4. 室温孵育5分钟；5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中；6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。
三、注意事项1. 在无血清培养基（如Opti-MEM®减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine® 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）；2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；3. Lipofectamine® 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine® 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染；4. Lipofectamine® 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。
附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：（二）电穿孔转染法一、实验试剂及器材BTX ECM2001®2001细胞电融合仪，细胞，胰蛋白酶，电转液，DMEM，培养板，离心机等。
电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化
电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化(作者：___________ 单位： __________ 邮编：___________ )作者：单铁英苏安英唐军民【摘要】目的：通过电穿孔法将带有增强型绿色荧光蛋白基因(enhan ced gree n fluoresce nt protein EGFP )的真核表达载体plRES2-EGFP( IRES2 in ternal ribosome en trysite 2 内部核糖体进入位点2)质粒导入未成熟树突状细胞( Immature Den driticCell,imDC)，探讨不同电穿孔条件对imDC电转染率和存活率的影响。
方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞，采用细胞因子体外培养诱导其成为imDC在大肠杆菌中扩增plRES2-EGFP质粒，选择不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、DNA剂量等。
应用电穿孔仪将PIRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞，荧光显微镜下和光镜下分别计算绿色荧光阳性细胞数和总细胞数。
0.4%锥虫蓝(trypan blue) 染色，计数电转染后细胞存活率。
结果：当imDC浓度为5X 106/mL 与6卩g DNA质粒混合，设定电转染仪电压为300 V、脉冲时间为500 卩s时,其电转染率到最高，细胞存活率最高，转染后24 h明显表达，48h后表达最强。
结论：在适当的电压、脉冲时间下，选择适当的细胞浓度、DNA剂量，在转染后的一定时间范围内，电穿孔法转染imDC可使目的基因获得较高的转染率，且细胞死亡最少。
电转染提供了外源基因转染imDC的可行技术。
【关键词】电穿孔转染绿色荧光蛋白树突状细胞Abstract Objective:plRES2-EGFP was successfully tran sfactedinto immature dendritic cells by means of electroporation in order to investigate the effect of electransfection efficiency and survival rate of immature dendritic cells in different con diti ons.Methods:M ono cytes obta ined form huma n peripheral blood by density guadient centrifugation are induced into imDCs in the presenee of cytokines in vitro.plRES2-EGFP was amplified inE.coli.imDCs were tran sferred with pIRES2-EGFP by means of electroporati on with differe nt electric voltages,times of impulse,cell concen trati onsand the doses of DNA.Numbers of green fluorescence positive cells and the total cell number were coun ted respectively un der fluoresce nt microscope and visible light microscope.the cells were stained with 0.4% trypan blue,electransfection efficiency and the cell survivalrate were counted.Results:Electransfection efficiency wasin creased to the highest value whe n imDCs with theconcentration of 5X 106 cells/mL were mixed with 60 卩g-total DNA,the electric voltage of electroporation apparatus was set at 300V,and the time of impulse was 500 卩s.There wassig ni fica nt and the highest expressi on of plRES2-EGFP respectively at 24 h and at 48 h after tran sferri ng.C on clusio n:A higher tra nsfecti on efficie ncy of target genes can be obta ined by means of electroporati on with suitable electric conditions.Electric transfection provides atech ni cal possibility to make DNA into imDCs.Key words Electroporati on; Tra nsfect;Gree n fluoresce nt protein;Dendritic cell;Human树突状细胞（dendritic cell,DCs ）作为体内惟一能活化初始T细胞的抗原递呈细胞（antigen presentingcell,APC），是激发机体特异性免疫反应的关键，其在抗肿瘤免疫治疗领域中的作用受到广泛关注，以DCs为基础构建的各种类型的疫苗在多种肿瘤免疫治疗的基础和临床研究中显示了旺盛的生命力和良好的前景[1,2] 。