咖啡因的液相标准图谱
实验7液相色谱法测雪碧、可乐中的咖啡因含量
仪器分析实验液相色谱分离测定雪碧、可乐中的咖啡因2018年4月30 日. . ..液相色谱分离测定雪碧、可乐中的咖啡因【摘要】色谱法是一种分离和分析方法，本实验采用的是液相色谱中的反相分配色谱，反相色谱的固定相极性小于流动相，样品根据在固定相和流动相中的分配系数不同而进行分离。
通过标准样品的保留时间进行定性，以峰面积对浓度绘制的工作曲线定量测定可乐和雪碧中的咖啡因。
【关键字】液相色谱反相色谱咖啡因外标法【Summary】Chromatography is a separation and analysis method. This experiment uses reversed-phase distribution chromatography in liquid chromatography. The reversed-phase chromatography has a smaller stationary phase than the mobile phase. Samples have different distribution coefficients in the stationary phase and the mobile phase. And separation. Quantitative determination of caffeine in Cola and Sprite was performed by quantifying the retention time of the standard sample and by plotting the peak area versus the concentration plotted.【Keywords】liquid chromatography reversed phase chromatography caffeine external standard method 【实验目的】. . ..1、学习液相色谱仪的基本原理，尤其是反相色谱的基本规律，构成和使用方法2、了解高效液相色谱仪（以安捷伦1260 为例）的结构及基本操作；3、掌握色谱的基本定性、标准曲线定量方法。
高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因
2.1 咖啡因标准溶液 国标 GB/T 5009.139-2003 中，紫外分 光光谱法的咖啡因标准储备液和标准使用液均用重蒸的三氯 甲烷配制，高效液相色谱法的咖啡因标准储备液和标准使用液 均用甲醇配制。有机溶剂容易挥发，导致浓度不准确；1g 咖啡因 能溶于 46mL 水，故本法直接用蒸馏水溶解咖啡因粉末。实验表 明，咖啡因水溶液的峰形也十分尖锐（见图 1）。但不同的溶剂体 系，咖啡因的最大吸收波长会有差异。 2.2 色谱条件 嘌呤类生物碱基均具有共轭离域大 π 键结 构，在紫外光区有强烈吸收。由紫外光谱扫描可知，咖啡因的水 溶液在接近 207nm、273nm 处有两个依次降低的吸收峰，本法 采用最大吸收波长 207nm 作为检测波长。
题，多年来，各级部队卫生行政部门和疾病预防控制机构，针对
这一难题都不断的进行探讨、研究。目的在于即要解决住外部 队蝇害防制问题，又要不给部队训练和生活造成影响，单纯的 使用物理方法、化学方法、生态方法中的一种，都不能达到有效 的控制蝇害的目的。此次在海南省武警部队黄金支队这一特殊 场合蝇类防制进行了探讨，采用多种方法同时进行灭蝇，使得 该部队蝇密度明显下降，近期灭蝇明显。
取含咖啡因的样品，按低、中、高三个水平分别准确咖啡因 标准溶液，按样品处理测定其回收率，结果见表 1。回收率在 97.4％～101.4%之间。
表 1 咖啡因的回收率
本底值（μg/mL） 加标量（μg） 测定值（μg/mL） 回收率（%）
116.45
200
高效液相色谱法测定咖啡因
四、注意事项
1、流动相和样品溶液需过滤后使用。 2、流动相还进样器。 5、实验结束后要冲洗系统和色谱柱。
五、数据处理
1、根据标准溶液色谱图进行咖啡因成分的定性；
2、绘制标准曲线并打印；
2、计算样品中咖啡因含量。
End！
O H3C N CH3 N N CH3
O
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。
二、实验原理
色谱法
利用混合物不同组分在固定相和流动相中 分配系数(或吸附系数、渗透性等)的差异，使不
同组分在作相对运动的两相中进行反复分配，
实现分离的分析方法。
色谱法分类
色谱法
气体
超临界流体
液固色谱 （LSC）
液体
液液色谱 （LLC） 胶束电动色谱 （MEKC）
气固色谱 超临界流体色谱 （GSC） (SFC) 气液色谱 （GLC）
键合相色谱 亲和色谱 吸附色谱 (BPC) (AC) （LSC） 尺寸排阻色谱 离子交换色谱 毛细管电色谱 (SEC) (IEC) (CEC)
进样口 高压泵
色谱柱 检测器
流动相溶剂
仪器分析实验
高效液相色谱法测定饮料中的 咖啡因
主要内容
一、实验目的 二、实验原理
三、实验步骤
四、注意事项
五、数据处理
一、实验目的
1、学习高效液相色谱法分离咖啡因的原理。
2、练习高效液相色谱仪的基本操作。
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析
的基本方法。
二、实验原理
咖啡中含咖啡因约1.2～1.8%，茶叶中含2.0～4.7%，可 乐饮料和APC药片中均含有咖啡因。 其分子式为C8H10O2N4，结构式：
废液
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
4．将进样阀放在半截（LOAD）位时，用注射器取25 L 浓度最低的标准样（比进佯阀上定量管多5 L以上)，注入进 样阀中。
5．将进样阀从装载（LOAD）位转向进样（1NJECT0 位，同时按标记钮(MARKER)，使在记录纸上打开进样信 号。
6．当咖啡因的色谱峰出完后，按照步骤4～5连续 操作2次，使最低浓度的标准试液获得3张色谱图。
7．按标准试液浓度增加的顺序，按步骤4～6操作， 使每一种标准样获得3个数据。
8．取2 mL咖啡饮料试液放入25 mL容量瓶中（或取 5 mL茶液放入50 mL容量瓶中），分别用流动相稀释至 刻度。
9．按步骤4～6操作，分析饮料试液（咖啡或茶）。
102.4 注意事项
（1）钢瓶的工作压力，一定要控制在所规定范围内， 不得超压工作。必须切记，保障安全。
（2）实验结束后，检查仪器是否正常，关闭n-C18测定咖啡因的原理。 （2）在色谱分析中为什么常采用相对校正因子fi？
高效液相色谱法测定饮 料中咖啡因的含量
2021年7月22日星期四
102.2 实验原理
咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称为 l,3,7-三甲基黄嘌呤，是由茶叶或咖啡中提取而得的一 种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中 含咖啡因约为l.2%～1.8%，茶叶中约为2.0%～4.7%。可 乐饮料、APC药片均含咖啡因。其分子式为C8H10O2N4,结 构式为：
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光 度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他 组分（如：单丁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配 制的浓度不同的咖啡因标准溶液也注入色谱系统。如流 速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在
饮料中咖啡因的高效液相色谱分析
实验21 高效液相色谱法测定饮料中咖啡因【实验目的】1. 熟悉反相色谱法的工作原理和应用；2. 学习液相色谱仪的基本结构和基本操作；3. 掌握高效液相色谱法定性、定量分析的原理和方法。
【实验原理】1. 基本原理色谱法的实质是一种物理化学分离、分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，经过反复多次的分配实现组分分离。
根据各组分在色谱图上的保留时间（或保留距离），可直接进行组分的定性分析；测量各峰的峰面积或峰高，即可作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定相应组分的含量。
高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱理论，并在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器从而实现分离分析的方法。
根据使用的固定相及分离机理不同，高效液相色谱法分为液-固吸附色谱法、液-液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
（1）正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），被分离组分按极性从小到大的顺序流出色谱柱。
（2）反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
适用于分离非极性和极性较弱的化合物，被分离组分按极性从大到小的顺序流出。
液-液分配色谱能分离多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。
反相色谱法在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
2. 咖啡因咖啡因又称咖啡碱，由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋，被广泛应用于食品、饮料的生产工艺中，成为各种功能性饮品的重要成分之一。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
烷烃）键合到硅胶基质上，分离过程中以极性溶剂为流 动相，实现弱极性化合物的分离。与其他组分（如：单 丁酸、咖啡酸、蔗糖等）相比，咖啡因为弱极性化合物 。
高效液相色谱法测定饮 料中咖啡因的含量
2020年8月1日星期六
102.2 实验原理
• 咖啡又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称 为l,3,7-三甲基黄嘌呤，是由茶叶或咖啡中提取而得的 一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡 中含咖啡因约为l.2%～1.8%，茶叶中约为2.0%～4.7%。 可乐饮料、APC药片均含咖啡因。其分子式为C8H10O2N4, 结构式为：
•102.4 注意事项
• （1）钢瓶的工作压力，一定要控制在所规定范围 内，不得超压工作。必须切记，保障安全。 • （2）实验结束后，检查仪器是否正常，关闭是否 正确。
•102.5 问题讨论
•
（1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。
•
（2）在色谱分析中为什么常采用相对校正因子
fi？
•102.6 参考答案
• 5．将进样阀从装载（LOAD）位转向进样（ 1NJECT0位，同时按标记钮(MARKER)，使在记录纸上打 开进样信号。 • 6．当咖啡因的色谱峰出完后，按照步骤4～5连续 操作2次，使最低浓度的标准试液获得3张色谱图。 • 7．按标准试液浓度增加的顺序，按步骤4～6操作 ，使每一种标准样获得3个数据。 • 8．取2 mL咖啡饮料试液放入25 mL容量瓶中（或 取5 mL茶液放入50 mL容量瓶中），分别用流动相稀释 至刻度。 • 9．按步骤4～6操作，分析饮料试液（咖啡或茶） 。
作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
仪器分析-高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因的含量
反相高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因的含量前言：本次实验报告在前言中简单阐述HPLC 基本原理，介绍HPLC 仪器的结构特点和应用范围；研究对象的化学结构、理化常数和文献报道测定方法。
咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。
可乐、APC 药片中均含有咖啡因。
其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式：N N N NCH 3CH 3CH 3OO一、仪器与试药高效液相色谱仪（日本岛津）。
咖啡因对照品；甲醇为色谱纯；百事可乐（康师傅乌鲁木齐饮品有限责任公司）；红牛（红牛维他命饮料有限公司）；叶尔羌茶（新疆叶尔羌茶有限责任公司）。
二、方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱：C18（4.6x150mm ，5µm ），流动相：甲醇:水=30:70，测定波长280nm ，柱温30℃，流速：1ml/min ，进样量：10μL 。
2.2 系统适用性实验 取供试品20µL 进样，记录色谱图，咖啡因峰的保留时间为 4.253 min ，各峰与相邻峰的分离度为 ，拖尾因子为 ，符合药典规定，理论塔板数按咖啡因峰计算大于2000。
对照品及供试品的色谱图如下：⑴ 对照品的色谱图0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min0510152025303540455055mVDetector A Ch1:280nm1.4981.6104.3005.112⑵ 供试品的色谱图0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min01234567891011121314mVDetector A Ch1:280nm 0.8001.5182.1582.3284.3425.1022.3 溶液制备精密称取咖啡因对照品10mg ，加甲醇定容至10ml 。
实验二 高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量
高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量1. 实验目的和要求1.1 熟悉高效液相色谱仪的结构。
1.2了解反相高效液相色谱的原理与应用。
1.3掌握外标定量法。
2. 实验原理咖啡因属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7-三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神亢奋。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2%~1.8%，在茶叶中约为2.0~4.7%。
可乐饮料、止痛药等含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，其化学结构式如下图：在化学键合相色谱法中，若采用的流动相的极性大于固定相极性，则称为反相化学键合相色谱法。
该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。
本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，即为一种反相色谱法。
通过紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度以最小二乘法进行线性回归，作出标准曲线，在根据试样中的咖啡因峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。
3. 实验仪器与试剂3.1 仪器高效液相色谱仪（带自动进样器，或配置微量进样器）超声波清洗仪分析天平3.2 试剂咖啡因对照品甲醇（色谱纯）纯净水3.3 试样市售可乐。
4. 实验步骤4.1 色谱条件色谱柱：C18，4.6×150mm，5μm流动相：甲醇-水（60：40，v/v）流速：0.8mL·min-1检测波长：254nm柱温：30℃进样量：10μL4.2 操作步骤●精密配制含咖啡因浓度为约1mg·mL-1的咖啡因甲醇溶液。
●将上述溶液用甲醇稀释为含咖啡因浓度分别为20、40、80、160、320 μg·mL-1等5份对照品溶液。
●根据前述色谱条件，将仪器调节至进样状态，待仪器流路与电路条件达到平衡状态后，色谱工作站记录的基线呈平直，即可进样分析。
●依次分别吸取10μL的5份对照品溶液进样分析，记录色谱数据。
●将可乐试样20mL经超声波脱气后，精密吸取10μL可乐试样，进样分析，记录色谱数据。
饮料中咖啡因的高效液相色谱分析
实验21 高效液相色谱法测定饮料中咖啡因【实验目的】1. 熟悉反相色谱法的工作原理和应用；2. 学习液相色谱仪的基本结构和基本操作；3. 掌握高效液相色谱法定性、定量分析的原理和方法。
【实验原理】1. 基本原理色谱法的实质是一种物理化学分离、分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，经过反复多次的分配实现组分分离。
根据各组分在色谱图上的保留时间（或保留距离），可直接进行组分的定性分析；测量各峰的峰面积或峰高，即可作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定相应组分的含量。
高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱理论，并在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器从而实现分离分析的方法。
根据使用的固定相及分离机理不同，高效液相色谱法分为液-固吸附色谱法、液-液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
（1）正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），被分离组分按极性从小到大的顺序流出色谱柱。
（2）反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
适用于分离非极性和极性较弱的化合物，被分离组分按极性从大到小的顺序流出。
液-液分配色谱能分离多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。
反相色谱法在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
2. 咖啡因咖啡因又称咖啡碱，由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋，被广泛应用于食品、饮料的生产工艺中，成为各种功能性饮品的重要成分之一。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量
实验一、高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量一、实验目的：1、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理；2、掌握高效液相色谱仪的操作；3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量的基本方法；4、掌握标准曲线定量法。
二、实验原理：咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。
可乐、APC药片中均含有咖啡因。
其分子式为C8H10O2N4，分子量为结构式：用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统，以紫外检测器进行检测。
在整个实验过程中，流动相流速和泵的压力是恒定的，测定他们在色谱图上的保留时间和峰面积后，可直接用保留时间定性，用峰面积作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
三、仪器和试剂1、仪器Agilent 1200高效液相色谱仪；色谱柱（C18）：4.6mm×150mm、粒径5μm；平头微量进样器：10μl2、试剂：1 咖啡因（A.R.）、甲醇（色谱纯）、超纯水、可口可乐（瓶装）、雀巢咖啡②1000μg/mL咖啡因储备液：将咖啡因在110℃下烘干1小时，准确称取0.1000g咖啡因，用超纯水溶解，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，待用。
四、实验内容：1、色谱条件：柱温：室温；流动相：甲醇／水＝60：40流速：1.0mL/min 检测波长：275nm2、咖啡因标准系列溶液配制：分别用吸量管吸取1000μg/mL咖啡因储备液1.0、2.0、2.0、4.0、5.0mL于5只50mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，浓度分别为20、40、60、80、100 μg/mL3、样品前处理：①将25mL可口可乐置于100mL烧杯中，剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min，以赶净二氧化碳。