电转化大肠杆菌感受态细胞
大肠杆菌感受态细胞的转化方法
一、概述大肠杆菌是一种常见的微生物细菌，广泛存在于自然界中。
而大肠杆菌感受态细胞的转化方法，是一项重要的研究课题。
本文旨在探讨大肠杆菌感受态细胞的转化方法，以期为相关领域的学者和研究人员提供参考。
二、大肠杆菌感受态细胞的定义大肠杆菌感受态细胞是指能够接受外源DNA并进行转化的大肠杆菌细胞。
在细菌转化的过程中，外源DNA能够通过不同的方式导入大肠杆菌感受态细胞内，并且在某种条件下，使其获得新的遗传信息，从而表现出与原有菌株不同的性状。
三、大肠杆菌感受态细胞的转化方法1. 热激转化方法热激转化方法是将需要转化的大肠杆菌细胞与外源DNA在高温条件下共培养，利用高温使大肠杆菌细胞的细胞壁变得松弛，使外源DNA能够顺利进入细胞内。
然后在低温下将其复性，并引起DNA与细胞的内合作用，最终实现外源DNA的转化。
2. 电穿孔法电穿孔法是通过将大肠杆菌感受态细胞暴露在高电场中，在电场作用力下使细胞膜发生孔道破裂，从而使外源DNA顺利进入细胞内，实现转化。
3. 化学法化学法是使用化学物质（如钙离子、聚乙二醇等）处理大肠杆菌感受态细胞，使细胞膜通透性提高，从而使外源DNA得以顺利进入细胞内，实现转化。
4. 冷冻法冷冻法是将需要转化的大肠杆菌感受态细胞与外源DNA共同置于冰冻条件下进行培养，利用冰冻条件下细胞膜通透性增加，使外源DNA能够进入细胞内，最终实现转化。
5. 基因枪法基因枪法是利用基因枪将外源DNA通过高速微粒轰击的方式，直接送入大肠杆菌感受态细胞内，从而实现转化。
6. 瞬时脉冲法瞬时脉冲法是利用高压脉冲将外源DNA导入大肠杆菌感受态细胞内，通过瞬时压力使细胞膜通透性增加，从而使外源DNA能够进入细胞内，实现转化。
四、大肠杆菌感受态细胞的转化效率影响因素1. 外源DNA的浓度外源DNA的浓度对大肠杆菌感受态细胞的转化效率有重要影响。
过高或者过低的外源DNA浓度都会降低转化效率。
2. 细胞状态大肠杆菌感受态细胞的生长状态和健康程度对转化效率有直接影响。
大肠杆菌电转化感受态细胞制备.
大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天:1.将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C 下过夜培养2.高温灭菌大的离心瓶(250-500ml以备第二天摇瓶用3.准备几瓶灭菌水(总量约1.5升,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天:4.转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基的1-2升挡板摇瓶中5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时8.细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天9.用灭菌的冰水重悬浮细胞。
先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升,然后加水稀释至离心管的2/3体积。
10.照上面步骤重复离心,小心弃去上清液11.照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞12.离心,弃上清液13.用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14.照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散15.用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存转化方法:1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟2. 添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡中4. 加载P1000,准备好300μl LB 或2xYT5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏(检查时间常数,应该在3以上6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA 分子的转化。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理和操作步骤
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
大肠杆菌电转化
大肠杆菌电转化感受态细胞制备实验步骤和转化方法实验步骤：1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37℃下过夜培养。
2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。
准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。
3、转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中。
4、37℃下剧烈振荡培养2-6小时。
5、定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次），当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）。
6、细胞在4℃5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存一两天）。
7、用灭菌的冰水重悬浮细胞。
先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。
8、照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。
9、照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。
10、离心，弃上清液。
用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。
11、用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。
12、将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80℃保存。
转化方法:1、在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟。
2、添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟。
3、转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中。
4、加载P1000，准备好300μl LB 或2xYT 。
5、对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上）。
6、立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中。
7、37℃下培养细胞40分钟至1小时以复原。
8、转移细胞至适当的选择培养基上培养。
大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备
3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。
为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。
转化效率为109～1010转化子/µg DNA。
3.1．感受态细胞的制备（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。
（2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000 rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存1～2天）。
（3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000 rpm离心10min。
（4）重复步骤（3）1次。
（5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000 rpm离心10min。
（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。
（7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。
3.2．电转化为了降低离子浓度，待转化的质粒DNA，如质粒或酶连产物，在电转化前应该进行纯化（乙醇沉淀），以下所有步骤都需要保持无菌操作。
（1）从－80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；加入待转化的质粒DNA，冰浴10min；同时将电转化杯进行冰浴。
实际操作中，如果电转化杯浸泡在乙醇中，可提前取出电转化杯，在无菌的超净台上吹干。
（2）打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。
特别注意，不同的电转化杯，所使用的电压不同。
防止电压不够，难以有效转化，以及，电压过高，击爆电转化杯，产生火花，产生危险。
（3）将冰浴后的感受态细胞（含DNA）转移到电转化杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部（注意：其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可，具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明）。
大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备
3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。
为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。
转化效率为109～1010转化子/µg DNA。
3.1．感受态细胞的制备（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。
（2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000 rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存1～2天）。
（3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000 rpm离心10min。
（4）重复步骤（3）1次。
（5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000 rpm离心10min。
（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。
（7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。
3.2．电转化为了降低离子浓度，待转化的质粒DNA，如质粒或酶连产物，在电转化前应该进行纯化（乙醇沉淀），以下所有步骤都需要保持无菌操作。
（1）从－80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；加入待转化的质粒DNA，冰浴10min；同时将电转化杯进行冰浴。
实际操作中，如果电转化杯浸泡在乙醇中，可提前取出电转化杯，在无菌的超净台上吹干。
（2）打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。
特别注意，不同的电转化杯，所使用的电压不同。
防止电压不够，难以有效转化，以及，电压过高，击爆电转化杯，产生火花，产生危险。
（3）将冰浴后的感受态细胞（含DNA）转移到电转化杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部（注意：其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可，具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明）。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理和操作步骤
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)随着基因工程和生物技术的发展，基因克隆和DNA转化技术已经成为生命科学研究的基本技术之一。
大肠杆菌是广泛应用的微生物基因克隆和表达系统，其中电转化是一种常用的DNA转化方法。
在电转化过程中，使用感受态细胞进行DNA 转化可以提高转化效率和获得更多的转化子。
因此，制备感受态细胞及其转化方法研究对开展基因克隆和表达等方面的研究具有非常重要的意义。
感受态细胞制备方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为Luria-Bertani（LB）培养基。
2.细胞质壁分离方法将DH5α菌株经过预培养后，用LB培养基洗涤一次，收集菌落后进行以下步骤。
•在含有1mM EDTA的冷0.5M葡萄糖缓冲液中洗涤细胞三次；•加入60mg/mL的亚胺青钾（IPTG）处理4小时取得感受态细胞。
3.细胞计数及保存使用平板计数器计数，将细胞用LB培养基稀释至约1 x 10^9/mL，添加10% v/v的甘油保存在-80℃。
电转化方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为SOC培养基（Super Optimal broth with Catabolite repression）。
2.DNA处理方法将所需构建质粒经过酶切和纯化等操作处理后，加入所需菌株中进行转化。
3.转化操作•取感受态细胞保存液用LB培养基洗涤3次；•加入所需DNA，静置30分钟使其与感受态细胞充分结合；•以1mm间隔安置两条电极在电转化仪中；•用微管脚吸取约50μL细胞转移到抗电极侧的铝箔上，用蒸馏水润湿铝箔；•将铝箔上细胞转移到电极之间的空间内，使用脉冲电压脉冲电压 1.8 kV, 25 uF, 200Ω电阻取得转化产物。
以上是大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化的实验步骤。
感受态细胞制备方法和电转化方法的优化将提高转化效率和转化获得率，从而为生命科学研究提供更好的服务。
制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究_朱森康
2011 年第 10 期
朱森康等： 制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究
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pUC18 均为本实验室保存。 1. 1. 2 主要试验仪器及培养基 分光光度计 Ultrospec 3300 pro 购自 Amersham Biosciences（ Sweden） 。 0. 2 cm 电击杯和 gene Pulser II 电脉冲基因转移仪 均购自 Bio-Rad 公司。LB 培养基： 1% （ W / V） 蛋白 胨，0. 5% （ W / V ） 酵 母 粉，1% （ W / V ） 氯 化 钠。 SOC 培养基： 2% （ W / V） 蛋白胨，0. 5% （ W / V） 酵 母粉，0. 05% （ W / V） 氯化钠，0. 186 g / L 氯 化 钾， 0. 95 g / L 氯化镁，3. 6 g / L 葡萄糖。甘油为国产分 析 纯，氨 苄 青 霉 素 （ Amp ） 购 自 TaKaRa 宝 生 物 公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 感受态细胞的制备 从新鲜活化 LB 平板 上挑取单菌落，接种于 50 mL LB 培养基中，37℃ ， 220 r / min 振 荡 培 养 过 夜 制 备 种 子 液。种 子 液 按 1% 转 接 到 一 定 装 液 量 的 LB 培 养 基 中，37℃ ， 220 r / min 振荡培养。培养一定时间，测定菌液浓度 OD600 达 到 一 定 值 后，取 出 培 养 三 角 瓶，冰 浴 冷 却 20 min，4℃ ，5 000 r / min 离心 15 min，倾去上清液； 将细胞重悬于预冷的去离子水中，4℃ ，5 000 r / min 离心 10 min，重复清洗 3 次。再将细胞重悬于预冷 的 10% （ V / V） 甘油溶液中，4℃ ，8 000 r / min 离心 10 min，重复清洗 3 次。最后细胞用 1 /1 000 初始菌 液体积的预冷 10% （ V / V） 甘油溶液重悬，100 μL 分 装至 1. 5 mL 离心管中，保存于 － 85℃ 备用。 1. 2. 2 电转化及转化效率的计算 取 100 μL 感受 态细胞，冰上融化后，迅速加入 1 ng pUC18 质粒，转 入预冷的电击杯（ 间隙 0. 2 cm） 中，一定电场强度电 击 后 迅 速 加 入 900 μL 37℃ SOC 培 养 基，37℃ ， 220 r / min 培养一定时间。以一定倍 数 稀 释 后，取 100 μL 菌液涂布于 Amp 抗性平板上，37℃ 恒温培 养过夜，菌落计数后按下式计算转化效率。转化效 率（ CFU / μg DNA） = （ 每皿转化子平均数 × 10 × 菌 悬液稀 释 倍 数） / 质 粒 微 克 数，每 一 样 本 同 时 转 化 3 份。
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电转化大肠杆菌感受态细胞
1．从-80︒C冰箱取出感受态细胞，置于冰上解冻。
2．将无菌的电击杯置于冰上预冷。
3．将解冻的感受态细胞按照100ul/管分装至预冷的1.5ml的离心管中，混匀，冰上放置。
4．向装有感受态细胞的离心管中加入1-2 µl质粒或连接产物，并混匀，冰浴10min。
5．打开电转仪，电压为2.0 kV，电击5ms [这些参数设置可以根据经验略作调整]。
6．将混合物转移至已预冷的电击杯中，轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电极杯的底部。
并用吸水纸吸干电击杯外壁的冰水。
7．将电击杯推入电转仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入2X 500μl 的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。
8．37︒C，220rpm复苏1小时。
9．离心，涂板，置于37︒C，过夜培养，次日观察结果。