胚胎冷冻保存
胚胎冷冻保存
玻璃化溶液（VS）：
• 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内 部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二 甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。
•
细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜， 所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡 咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。
方法：室温下（20～25℃），胚胎于10％丙三醇溶液中平 衡10分钟，然后在PG25中平衡30秒钟，然后投入液氮中 冷冻保存。
胚胎玻璃化冷冻
（3）Kasai等玻璃化冷冻保存法： 抗冻剂：乙二醇（EG）为细胞内液抗冻剂（透过性保护 剂），其具备分子量小、溶液渗透压高、细胞膜透过性 强的特点；聚蔗糖（Ficoll）为细胞外液抗冻剂，有利 于促进玻璃化形成；蔗糖(Sucrose)是为了冷冻前胚胎 细胞的脱水，细胞内部EG的调整及解冻后的EG的脱出。 玻璃化溶液：上述三种抗冻剂经mPBS调整成EFS玻璃化溶 液；
在玻璃化溶液中平衡时，浓度由低到高（25％～50％～
100％VS1）；平衡温度由高到低（22～4～－4℃）三步完 成，计35分钟平衡后投入液氮中冷冻保存。
（2）Scheffen等玻璃化冷冻保存法： 主体抗冻剂：丙三醇（G）和丙二醇(P)； 玻璃化溶液：上述两种抗冻剂各含25％混合而成(PG25)， 两者混合后可降低溶液的化学毒性，无需添加细胞非透 过性抗冻剂。
上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。
胚胎玻璃化冷冻
几种常见的玻璃化冷冻方法： （1）Rall等（1985）玻璃化冷冻保存法：是最初发明的玻 璃化冷冻保存方法，他们采用的VS1玻璃化溶液，是以透
过性抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）为主体溶液，为缓和其化
胚胎冷冻技术
人类胚胎冷冻的应用现状
到目前为止,超低温冷冻人的体外受精(IVF)胚 胎,在国内外均获得成功。 2004年,意大利学者应用ICSI对慢速冷冻卵母 细胞与冻融睾丸精子受精后再次冻存多余胚胎,解 冻胚胎移植后分娩一健康女婴,为世界首例。 北京大学第三医院生殖医学中心应用冷冻精 液中精子、冷冻卵母细胞、冷冻胚胎即“三冻” 技术,成功获得世界第2例、我国第1例“三冻”婴 儿。并在卵母细胞冷冻技术方而,采用了与世界首 例不同的简捷的玻璃化冷冻卵母细胞的方法。
另外,从理论上讲,冷冻胚胎可长期 保存,但对于保存过程中胚胎细胞是否 发生老化的问题还缺乏直接的实践证 据;对于冷冻效果鉴定,主要采用形态学 方法鉴定冻胚质量,对其移植后的发育 潜力无法判断。
• 在多种冷冻方法中,现较多采用慢速冷 冻、快速溶解方法,但是其他方法也有 其自身优点。因此,在实验中应综合考 虑多方面因素,根据具体的胚胎情况选 择恰当的方法。
胚胎冷冻技术
发展历史
• 胚胎冷冻保存的研究起始于20世纪50年代， 当时Smith用甘油坐防冻剂，保存兔胚胎获 得成功。
• 1971年Whittingham用慢速冷冻方法获得小 鼠胚胎的成功保存。 • 1978年willadsen建立了快速冷冻方法。 1984年Takeda等采用一步冷冻方法首次冷 冻小鼠胚胎获得成功。
临床应用
应充分重视高浓度玻璃化冷冻溶液对胚 胎的毒性作用,合理选择玻璃化冷冻溶液,严 格控制胚胎和玻璃化冷冻溶液接触的总时间。 目前较简单的玻璃化溶液的组成是25%甘油、 25%PROH或25%乙二醇。 玻璃化冷冻技术正处于实验研究到临 床应用的过渡阶段,随着玻璃化冷冻方法的 逐渐成熟,有望成为程序冷冻方法外的另一 种选择。
医疗应用
• 若有剩余的质量较好的胚胎，可以冷冻保存，待 以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内， 将增加受孕的机会。 • 可用于一个超排卵周期得到的胚胎数量多，质量 好，不能一次全部移植，可将多余的胚胎冷冻保 存。 • 以及发生严重卵巢过度刺激综合征的患者，不宜 在治疗周期移植胚胎者，可将胚胎冷冻，待以后 的自然周期或人工周期进行胚胎复苏移植。
冷冻胚胎移植流程
冷冻胚胎移植流程一、胚胎冷冻冷冻胚胎移植是一种辅助生殖技术，它可以帮助那些经历不孕问题的夫妇实现生育愿望。
在进行冷冻胚胎移植前，首先需要将胚胎冷冻保存起来。
胚胎冷冻是在体外受精后，将多余的胚胎通过特殊的冷冻方式保存起来。
这样，即使在首次胚胎移植失败后，也可以再次利用冷冻胚胎进行移植，提高成功率。
二、胚胎解冻当夫妇准备进行冷冻胚胎移植时，首先需要将冷冻的胚胎解冻。
这个过程需要非常谨慎，以确保胚胎的存活率。
解冻胚胎的过程中，需要使用特殊的解冻液，逐渐加温使胚胎恢复到正常温度。
解冻的过程需要进行严格的控制，以避免对胚胎造成不可逆的伤害。
三、胚胎移植解冻后的胚胎即可进行移植。
胚胎移植是一个微创手术，通常在妇科医生的指导下进行。
胚胎移植通常是通过阴道进行的，医生会使用一根细长的导管将胚胎送入子宫内。
这个过程通常不需要麻醉，但也可以根据个人情况进行麻醉。
四、移植后的护理移植后，需要进行一定的护理工作，以提高胚胎的着床率。
通常医生会建议患者注意以下几点：1.休息：移植后需要适当休息，避免剧烈运动和劳累，保持良好的心情和放松状态。
2.饮食：合理的饮食对胚胎的着床有一定的影响。
建议患者遵循医生的饮食建议，注意营养均衡。
3.药物治疗：医生会根据个人情况开具相应的药物，如黄体酮等，以促进胚胎的着床和发育。
四、观察和确认移植后，通常需要等待一段时间才能进行检测和确认。
这个过程通常需要进行血液检测或者超声波检查。
血液检测通常是检测孕激素水平，以确定是否受孕。
超声波检查可以观察子宫内是否有胚胎着床。
五、移植成功率冷冻胚胎移植的成功率取决于多个因素，包括胚胎质量、女性年龄、子宫内膜状态等。
通常来说，冷冻胚胎移植的成功率与新鲜胚胎移植的成功率相差不大。
总结冷冻胚胎移植是一项重要的辅助生殖技术，可以帮助不孕夫妇实现生育梦想。
冷冻胚胎移植的流程包括胚胎冷冻、胚胎解冻、胚胎移植、移植后的护理和观察等步骤。
虽然冷冻胚胎移植的成功率受到多个因素的影响，但通过科学的操作和合理的护理，仍然可以获得较高的成功率。
胚胎冷冻保存技术
胚胎冷冻保存技术嘿，朋友们！今天咱来聊聊胚胎冷冻保存技术。
这玩意儿可神奇啦，就好像给胚胎找了个超级“冰库”，让它们能在合适的时候再出来“闪亮登场”。
你想啊，这胚胎就像是一颗小小的种子，蕴含着无限的可能。
而胚胎冷冻保存技术呢，就是给这颗种子提供了一个特殊的保护罩。
把胚胎冷冻起来，等需要的时候再解冻，让它继续成长发育，这多厉害呀！很多人可能会问，为啥要搞这个胚胎冷冻保存呀？那用处可大了去啦！比如说，有些夫妻想要孩子的时候，身体条件不太好，这时候就可以先把胚胎冷冻起来，等调理好身体了再让胚胎复苏。
这就好比把好东西先存起来，等自己有能力享受的时候再拿出来，多机智呀！还有啊，有些女性可能因为某些疾病，需要先进行治疗，但又担心以后生育受影响，这时候胚胎冷冻保存就是她们的“大救星”。
这技术操作起来也挺有意思的。
医生们就像魔法师一样，小心翼翼地把胚胎处理好，然后放进专门的冷冻设备里。
这个过程可不能马虎，稍有不慎，这颗“小种子”可能就受委屈啦！不过别担心，咱们的医生那都是专业的，他们肯定能把胚胎照顾得好好的。
冷冻后的胚胎就乖乖地在“冰库”里待着，等着被唤醒的那一天。
等时机一到，医生就会把它们解冻，让它们重新开始生长。
你说神奇不神奇？就好像它们睡了一觉，醒来后还是活力满满。
当然啦，这可不是随随便便就能做的。
在进行胚胎冷冻保存之前，医生会和患者进行详细的沟通，了解各种情况。
毕竟这是关系到一个新生命的事情，可不能马虎呀！而且，冷冻保存也不是一劳永逸的，还需要定期检查和维护，就像我们要经常保养自己的爱车一样。
说真的，胚胎冷冻保存技术给很多人带来了希望。
那些曾经因为各种原因担心不能拥有宝宝的家庭，现在有了新的选择。
这难道不是一件很棒的事情吗？总之呢，胚胎冷冻保存技术就是现代医学的一个奇迹。
它让生命有了更多的可能，让那些渴望孩子的家庭看到了希望的曙光。
咱可得好好感谢那些研究出这项技术的科学家们，是他们让这个世界变得更加美好。
动物配子与胚胎冷冻保存原理及应用
动物配子与胚胎冷冻保存原理及应用动物配子和胚胎冷冻保存是一种通过低温保存方式，将动物种子或胚胎保存在玻璃管或冷冻盒中，以便在未来的时候将其恢复生长和繁殖的技术。
动物配子或胚胎保存可以保证物种的遗传多样性，也可以为动物的保护和培育提供重要的帮助。
近年来，该技术在畜牧业、医学研究以及保存濒危物种等领域得到了广泛的应用。
动物配子和胚胎冷冻保存的原理是通过低温抑制生命体内的活动代谢，达到延缓历程的效果。
在冷冻过程中，配子和胚胎的内部液态会转变成固体所以需要添加抗冻剂来保护细胞和避免冰晶对细胞的伤害。
当冷冻被完成后，这些细胞或组织可以存储在超低温（通常为-196℃）下，以防止它们继续生长或衰老。
当需要将它们恢复到正常生长时，需要将保存的胚胎或配子慢慢加热到它们适合的温度以使其重新开始细胞代谢。
在畜牧业中，动物配子和胚胎的冷冻保存技术被广泛应用。
通过把高质量的家畜的配子和胚胎冷冻保存，可以在未来种群扩增 or 培育需要的时候母猪、牛、马和羊的种群扩增。
生物学家利用高质量的胚胎和配子创建基因改良动物，然后将其冷冻保管。
当需要在生产中培育更多的种群，在需要时就可以于提取原料，并将它们放入深度冷冻中进行保存。
这a对于种群扩增而言是非常重要的工具。
在医学研究领域中，无论是用于治疗不育症，还是利用它来治疗人造生殖植入，动物的配子和胚胎保存技术都是非常重要的技术。
这些技术可以为什么人造受孕程序创建可靠的储备源，这些储备源可以在不必要的情况下补充供体实验。
在保护濒危动物种群和保护野生动物方面，动物配子和胚胎保存技术也有着重要的作用。
通过采集、保存和重新植入野生动物或濒危动物的配子和胚胎，可以创建并保护优良的纯种，有效地保护某些濒危物种。
总之，动物配子和胚胎保存技术为畜牧业、医学研究和濒危物种的保护提供了可靠的参考。
虽然这项技术需要高度技术，但相信经过不断学习和研究，将来它将起到越来越重要的作用。
胚胎冷冻保存知情同意书
【合同标题】胚胎冷冻保存知情同意书
【合同分类】医疗服务合同
【发文字号】
【发布机构】
一、体外受精—胚胎移植一般移植3—4个胚胎，剩余的胚胎经程序冷冻后投入到－196.C液氮中保存，胚胎冷冻保存最长时间为8年。
冷冻胚胎解冻会有一定比例的损伤，而且解冻胚胎的妊娠率低于新鲜胚胎。
每过一年须补交____元保存费，若过期未交费本中心有权自行处理胚胎，恕不另行通知。
二、本人已知晓上述内容，愿遵守关于胚胎冷冻保存的上述协议。
患者（签字）：____ 患者家属（签字）：____
____年####月####日____年####月####日
谈话医生（签字）：____
____年####月####日。
动物胚胎冷冻保存技术研究进展
２３ 抗冻蛋 白（ Ｆ ） ． Ａ Ｐ 和热滞蛋 白（ Ｈ ｓ Ｔ Ｐ）
针对 高浓度 的保 护剂 对 胚 胎 毒性 作 用 较 大这 一 问题 ， 几 近
年来 ， 些 学 者 发 现 了 一 种 新 型 保 护 剂 一Ａ Ｐ 一 Ｆ 。抗 冻 蛋 白
（Ｆ ） 非依 数性 地降 低溶 液 冰点 ， 冷 冻细胞 和胚胎 具有 高效 Ａ Ｐ可 对 的保 护作 用 。 目前 的研 究 表 明 ， 同的 鱼 类抗 冻蛋 白都 具有 降 不 低冰 点 的活性 。Ａ Ｐ还 能 与细胞 膜作 用 ， 闭离 子通 道 ， 止 Ｆ 封 阻 溶质 渗透 ， 护 膜 的 完 整 性 。Ａ Ｐ和 Ｔ Ｐ 可 与 细胞 膜 相 互 作 保 Ｆ Ｈｓ 用 ， 善细 胞膜 的稳 定 性 ， 低 温 下 保 护 胚 胎 不受 损 伤 。Ｔ Ｐ 改 在 Ｈｓ 在高 浓度下 对细 胞 无毒 性作 用 ， 分 子量 大 ， 响 细胞 的渗 透 其 不影 压， 同时还可 以溶 解 在缓 冲 液或 玻 璃 化 液 中。 如果 Ａ Ｐ能成 功 Ｆ 运用 于玻 璃化 冷冻 中 ， 可使 胚胎 冷 冻保 存技术 上一 个新 台阶 。 则
的卵子 （ 经体外受精 ） 和胚胎移植到受体输卵管或子宫的过程 中， 受到各种外界因素影响而损 伤。为使影 响因素降低到最低 程 度 ， 就细胞 损伤 因素 来 探 讨超 低 温 冷 冻 保 存 的 原理 。温 下面 度变化因素， 一些动物的卵子或胚胎 ， １－２＂ 在 ０ ０ Ｃ情况下则可受 到损伤 。这与细胞质内的脂肪颗粒的含量有 关， 这种损伤称为 低温损 伤 （ ｉｉ ｊ ｙ 。特 别是 猪 的 胚 胎 在孵 化 囊 胚 以 前 的 ｃ ｌ ｇｎｕ ） ｈｌ ｉ ｒ ｎ 发育 阶段更为 明显 ， 以猪 的卵 子 和 胚 胎 的 冷 冻保 存 迄 今 没有 所 更大 的进展 。在通 常情 况 下 ， 内或 体 外 的 胚 胎 超 过上 述 发 育 体 阶段 时 ， 几乎不 受低温 损伤 的影 响 。细 胞 内冰 晶形 成 ， 性 溶 生理 液 中的胚胎 ／ 卵子 ， 当温度 降低 到冰 点 以下 时 ， 在 细胞 外 液 ， 不仅 而且细胞内液也有 冰晶产生 ， 使细胞产生致命性的损伤 （ 物理 性损伤） 。为使细胞内部不产生冰晶， 冷冻保存液中必须添加抗 冻保护 剂。常 采 用 的 抗 冻 保 护 剂 有 丙 三 醇 、 二 醇 、 二 醇 、 乙 丙 Ｄ Ｏ 和乙酰胺 等 。这些 物 质 的 分 子量 小 ， 以 自 由地 通 过细 ＭＳ 可 胞膜 ， 以被称 作 渗 透 性 抗 冻 保 护 剂 或 细 胞 内 液 抗 冻保 护 剂 。 所 细胞内、 外液的抗冻保护剂的摩尔浓度 较高的情况下 ， 使溶液的 冰点下 降 ， 抑制 冰晶生 成 的作用 。 在超 低 温冷 冻 过程 中 ， 具有 过 冷现 象 的产 生是细 胞死 亡 的重要原 因 。溶 液在 冰点 下 任一 温度 都可 能 回升 到冰点 ， 细胞 产 生 损 伤 作 用 。如 果 溶 液在 结 冰 的 对 温度离 冰点很 远（ 一１℃ 以下 ）则 由于 潜 热 的 释 放 使 溶 液 温 如 ５ ，
人类胚胎冷冻保存技术的研究进展与应用前景_孙志宏
人类胚胎冷冻保存技术的研究进展与应用前景延安大学生命科学学院(延安716000) 孙志宏 马 莉 周茂林 综述 李延清 审校 1983年Tr ounso n等首先将胚胎的冷冻-解冻技术用于人胚,并成功妊娠[1]。
目前,世界上已普遍开展了胚胎的冷冻和复融技术。
本文就胚胎冷冻技术基本原理、研究进展与应用前景做一综述。
1 胚胎冷冻保存原理及其损伤机制1.1 胚胎冷冻保存原理 冷冻保存(cr yo peserv ation),是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中,以一定的冷冻速度降至零下某一温度,对其长期保存的过程[2]。
此时细胞的代谢活动被完全抑制,使细胞的生命在静止状态下保存下来,从而达到长期保存的目的。
胚胎冷冻技术是在精子冷冻保存的基础上发展起来的。
冷冻胚胎存活率是渗透压和低温损害积累结果的反映。
冷冻保护液的浓度和植冰温度之间确定最适宜的关系是保证冷冻胚胎存活的关键因素[1]。
1.2 胚胎冻存的损伤机制 胚胎的冷冻实际上是一个脱水过程,冷冻保存的关键是设法减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤。
正常胚胎细胞内水分含量达80%以上,在冷冻过程中,胚胎细胞中的水分将从细胞中游离出来冷冻成冰晶,一方面对胚胎细胞造成机械性损伤即冰晶损伤(ice damag e),另一方面导致未结冰的细胞内溶液渗透压急剧增高,造成蛋白质变性即溶液损伤(solutio n damag e),二者最后都导致胚胎不可逆性变化而死亡。
但是,如果在胚胎冷冻保存液中加入一定浓度的冷冻保护剂如甘油、DM SO、乙二醇等,则可大幅度减小冷冻对胚胎的损伤[3-4]。
冷冻保护剂的成分通过细胞膜进入细胞内,细胞内外冷冻保护剂和其它溶质达到平衡,同时细胞脱水形成玻璃化的凝固状态,该过程是胚胎冷冻最重要的保护机制。
解冻时,冷冻保护剂渗出细胞外,同时细胞膜必须防止水过多过快渗人细胞内,以免发生渗透性膨胀。
2 冷冻保护剂的种类极其作用机制 在胚胎冷冻和解冻过程中的适当阶段添加适当浓度的冷冻保护剂能有效地降低对细胞的损伤,科学选用冷冻保护剂在胚胎冷冻保存过程中非常重要[5]。
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胚胎冷冻保存方法
⑴ 常规冷冻法： “植冰”后控制降温速度，避免过
快以免胚胎内部形成大块冰晶；避免过慢，以免胚胎 过分脱水而产生溶质效应。
⑵ 超速冷冻法： 非渗透性防冻剂对胚胎进行冻前脱
水处理，将胚胎平衡一段时间，而后投入液氮保存。
⑶ 玻璃化冷冻法： 应用高浓度防冻剂，使胚胎内外
液的同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近， 控制防冻剂与胚胎的平衡时间和温度，使防冻剂对胚 胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成 玻璃体，直接投入液氮保存。
植冰的概念：在液氮中冷却后的镊子或棉签夹住塑料细管上 端（棉栓端），使抗冻液迅速通过－6℃左右冰点，强制 性地使细胞外液形成冰晶，称之为植冰。 目的：当温度降到抗冻液冰点附近时，经植冰迅速冻结，以 防胚胎细胞内部产生冰晶，给胚胎造成物理性的损伤，致 使胚胎死亡。 将胚胎移入事先配置好抗冻液的0.25毫升塑料细管内 封口后进行冷却。当温度降至－6℃左右时，用上述方法 诱发结冰。
• 替代种畜引种。
抗冻剂的种类及作用
⑴ 渗透性：甘油、乙二醇（ EG ）、丙二醇（ PG ）和 DMSO
等，防止溶质效应。 特点：分子量小于100，易于渗透
⑵ 非渗透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP和聚蔗糖等， 降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，并能促使 胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形 成。
常规冷冻法
（3）自动降温仪中缓慢降温：植冰后的细管按一定速度缓
慢降温。
• 以0.33℃／分钟降至－30～－35℃时投入液氮； • 以1.0℃／分钟的速度降至－80℃时投入液氮； • 以0.5℃／分钟降至－30～－35℃时投入液氮。 原理：植冰后使细胞外液浓度相对增高，促使细胞内部水分
充分脱出，因此缓慢降温是非常必要的。由于脱水使细胞
特点：分子量大，不进入细胞
基础液： mPBS （改良）、 TCM-199 、 PBS 、
HEPES等，最常用mPBS。
抗冻剂的种类及作用
玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段， 不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固 体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。 即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能 形成，由液态变为透明半固态的现象。
胚胎解冻
脱除保护剂：
目的：防止保护剂对胚胎的毒性；
防止因细胞内保护剂浓度过高，导致胞内外渗 透压差过大，而使胞外水分内流，最终使胚胎过度膨 胀受损。 • 经典方法：浓度递减的保护液逐步稀释脱除，繁琐 费时，但有效； • 蔗糖等非渗透性保护液逐步脱除，使用较多；
玻璃化溶液（VS）：
• 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内 部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二 甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。
•
细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜， 所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡 咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。
胚胎细管编号 胚 胎细管编号
胚胎公司冷冻编号 配种编号 供体母牛登记 公牛登记 Betsy
直接移植胚 胎号
E546 - SM 4567891
DT 1 %
M1
2223333
98 Mar, 27
冷冻日期 胚胎发育阶段 胚胎质量
胚胎装管
冷冻保存的要点
保护细胞膜免受损害； 保护胚胎细胞，免受晶体损害； 具有“渗透活性”； 解冻后保护剂必须从细胞内去掉； 甘油（丙三醇）：普通的冷冻和解冻剂，通过细胞膜慢 慢扩散，为避免渗透休克，必须缓慢去掉； 乙二醇 ：直接胚胎移植方法, 通过细胞膜快速扩散， 因而不需要慢慢去掉。
方法：室温下（20～25℃），胚胎于10％丙三醇溶液中平 衡10分钟，然后在PG25中平衡30秒钟，然后投入液氮中 冷冻保存。
胚胎玻璃化冷冻
（3）Kasai等玻璃化冷冻保存法： 抗冻剂：乙二醇（EG）为细胞内液抗冻剂（透过性保护 剂），其具备分子量小、溶液渗透压高、细胞膜透过性 强的特点；聚蔗糖（Ficoll）为细胞外液抗冻剂，有利 于促进玻璃化形成；蔗糖(Sucrose)是为了冷冻前胚胎 细胞的脱水，细胞内部EG的调整及解冻后的EG的脱出。 玻璃化溶液：上述三种抗冻剂经mPBS调整成EFS玻璃化溶 液；
方法：室温胚胎在EFS玻璃化溶液中2～5分钟平衡后，即 投入液氮。
胚胎玻璃化冷冻
（2）Zhu等玻璃化冷冻保存法：
主体抗冻剂：乙二醇、甘油和二甲基亚砜；
玻璃化溶液：EFS、GFS和EDFS； 方法：室温下，将胚胎在10％乙二醇或10％甘油或10％乙 二醇＋10％二甲基亚砜中平衡5分钟，再移入EFS或GFS 或EDFS玻璃化溶液中平衡30秒钟，即两步法冷冻保存。 此方法重复性较高，对实验动物及各种家畜的胚胎皆 可进行冷冻保存。
常规冷冻程序
• • • • • •
从培养液中吸取胚胎，并放置在冷冻液中: 装入细管 (编号预先准备好)
1.5M 乙二醇 + 蔗糖 + PBS + AA + FCS 放入冷冻容器 -6.0℃
Seeding ice 每分钟降低 0.5℃ ，一直到-30℃为止 放入液氮容器
胚胎玻璃化冷冻
玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段， 不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固 体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。 即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能 形成，由液态变为透明半固态的现象。
胚 胎 冷 冻 保 存
胚胎冷冻保存的基本概念
将胚胎贮存在－196℃超低温下长期保存
的方法。这是20世记70年代试验成功的一项新
技术，是胚胎移植技术的重大突破。
胚胎冷冻保存的意义
• 胚胎移植不受时间和地点的限制，提高了胚 胎移植技术的效率；
• 长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施；
• 便于国际间交流；
常规冷冻法
• 历史：1972年首先获小鼠胚胎冷冻成功；
1973年牛的胚胎冷冻后获得成功，并产下后代。 • 操作流程：
（1）抗冻液中平衡：室温下（20～25℃），在含有
1～2摩尔∕升抗冻剂的磷酸缓冲液（PBS）中，胚胎经
10分钟平衡，使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱和。
Hale Waihona Puke 规冷冻法（2）植冰（诱发结冰）：
胚胎解冻
解冻方法：
• 慢速解冻：以4-25℃/min的速率使胚胎由冷冻保 存温度逐渐升至室温，适用于慢速冷冻的胚胎。当 温度由-196 ℃升到-50～-15 ℃埋，细胞内仍可能 形成大冰晶而致死胚胎。
• 快速解冻：温水浴法，以300-360 ℃/min的速率 使胚胎在30-40s内从-196 ℃至室温。
上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。
胚胎冷冻保存过程中的变化和损伤
⑴ 结晶变化： 温度降至冰点时，冰晶首先在胚胎外液 形成。温度、冰晶和外液的溶质浓度，迫使胚胎内部 的水不断外流，胚胎内部溶质浓度增加。 ⑵ 溶质效应： 降温速度太慢，胚胎内水充分外流，溶 质浓度极度增加，细胞膜的脂蛋白复合物和胞质内的 一些其他功能蛋白变性，造成对胚胎的不可逆损害。 ⑶ 机械效应： 降温速度过快，胚胎内部的水来不及溢 出到胚胎外面而直接在胚胎内部形成冰晶，从而对胚 胎造成致命的机械损伤。
上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。
胚胎玻璃化冷冻
几种常见的玻璃化冷冻方法： （1）Rall等（1985）玻璃化冷冻保存法：是最初发明的玻 璃化冷冻保存方法，他们采用的VS1玻璃化溶液，是以透
过性抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）为主体溶液，为缓和其化
学毒性，添加了乙酰胺(AA)、丙二醇(PG)和非透过性抗冻 剂聚乙二醇(PEG)。PEG具有促进玻璃化形成的作用。胚胎
内部充分收缩，同时抗冻剂渗透到细胞内部使内部溶液黏 性增大，这时投入液氮中，由于过冷抑制冰晶形成。
常规冷冻法
（4）解冻：贮存在液氮中的塑料细管取出后，迅速浸入室 温或37℃水浴中解冻。 （5）除去抗冻剂： 原因： 解冻后的胚胎，细胞内部抗冻剂浓度较高，对胚胎 有毒害作用；此外，若直接移入等渗生理溶液中，水分会 伸入细胞内引起膨胀，使细胞受损伤。 抗冻液：蔗糖溶液； 操作：解冻后胚胎由浓度高的抗冻液中移向浓度低的抗冻液， 进行梯度稀释；即将胚胎先移入高渗蔗糖溶液中，再移入 低渗蔗糖溶液中，在脱水的同时脱出抗冻剂，而后移入等 渗生理溶液中洗净，待胚胎基本复原后进行移植或继续培 养。
玻璃化溶液（VS）：
• 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内 部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二 甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。
•
细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜， 所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡 咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。
在玻璃化溶液中平衡时，浓度由低到高（25％～50％～
100％VS1）；平衡温度由高到低（22～4～－4℃）三步完 成，计35分钟平衡后投入液氮中冷冻保存。
（2）Scheffen等玻璃化冷冻保存法： 主体抗冻剂：丙三醇（G）和丙二醇(P)； 玻璃化溶液：上述两种抗冻剂各含25％混合而成(PG25)， 两者混合后可降低溶液的化学毒性，无需添加细胞非透 过性抗冻剂。