胚胎冷冻保存技术

胚胎冷冻保存技术摘要; 胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。

研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。

关键词：胚胎冷冻保存为便于长途运输和随时供移植使用，将那些６～７日龄已有２０～３０个细胞的新鲜活胚胎（或分割后的半胚胎、１／４胎）在－１９６℃的超低温下冷冻贮存就是胚胎冷冻保存技术。

这是在冷冻精子的技术基础上进一步发展起来的一项新技术。

目前用冷冻胚胎移植的成功率约为鲜胚胎的７０％～８０％，胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。

现有的胚胎冷冻保存方法有四种：一、常规冷冻法常规冷冻法：也叫慢速冷冻法、逐步降温法。

将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂(甘油或二甲亚枫(DMSO)等)浓度的三种冷冻液中(冷冻液浓度由低到高，最终浓度1．4M)，每种冷冻液中平衡5分钟，然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行冷冻。

冷冻速率先以1～3~C／分下降至-6～-7℃，在此温度诱发结晶，平衡10分钟，然后，以0．3℃／分的速率降温至-35～_38℃，之后投入液氮中保存。

胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每步5分钟，最后置入含20％血清的PBS保护液中洗涤3次，彻底脱除冷冻保护剂。

或者将解冻后的胚胎放入0．5M(或1．0M)的蔗糖溶液中平衡10分钟，再用上述PBS液洗涤3次。

二、一步冷冻法一步冷冻法：也叫一步细管法。

该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。

三、程序冷冻法程序冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水,经程序冷冻仪缓慢降温。

主要操作步骤包括:将细胞顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水,置入程序冷冻仪快速降温至-6℃植冰(人工诱导冰晶形成),然后程序冷冻仪缓慢降温至-30℃~-80℃后液氮贮存。

程序冷冻法主要使用渗透较慢的低温保护剂，如乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)，使冷冻保护剂充分渗透人胚胎细胞内，平衡后，利用程序降温仪缓慢降温，最后投入液氮保存。

程序冷冻法采用较低浓度的冷冻保护剂，对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高。

但因其操作繁琐，降温速度慢，致使所需时间长，需要特殊的降温装置，在不具备实验条件的场所不能使用此法进行胚胎冷冻。

目前国内外均较少使用。

通常在程序化慢冷的液体中，各含有一种细胞渗透性冷冻保护剂和一种非细胞渗透性保护剂，于室温下，在低浓度的冷冻保护剂溶液中预平衡，然后放置在终浓度的冷冻液中。

在冷冻仪内于预设的程序下降温标本，经过冷冻保护剂的处理后，胞内渗透压增高，意味着细胞内液冰点下降。

由于细胞自身的特性，它在细胞内外电解质平衡时，胞内液冰点比胞外低。

在室温到植冰点之间降温，往往冰晶还未来得及形成，但此期可以发生温度休克。

温度休克al shock)是指某些细胞在降温过快时受到损伤，甚至在冷冻过程中被破坏的一种表现。

其特点是与温度变化速率有关，常发生在15℃一一5℃降温过程之间。

这可能是由于细胞膜脂类的相变，膜受损后渗透率改变；或在不同的热收缩应激反应时，细胞膜结构的断裂引起的。

卵磷脂被认为有保护作用。

冷冻液通常在达到诸如一15℃的温度而冰晶尚未形成，即处于超冷状态。

为了避免过冷状态的发展，使每一个溶液在一个特定的温度时开始冻结，使细胞脱水逐步顺利地进行，及为了控制过冷生物样品中过度大冰晶的形成作用，可通过两种方法来诱发结晶：一是向液体中加入微量冰晶，较少采。

二是较常用的植冰(seeding)：用预冷至一70℃，或更低温度的金属棒在标本溶液冰点以下2–3℃时，瞬间地接触样品容器，可以带走大量水在液相转化为固相的潜伏热，这样可以激发和协助溶液中许多小冰晶的形成。

辅助生殖中常采用的植冰温度是一6℃一– 8℃。

目前，人工植冰比冷冻仪自动植冰可靠，用冷冻过的金属镊接触的部位应避免标本刚好所在位置，以免将样品迅速降温至细胞内冰晶形成而致死，一旦看到细胞外溶液中有一个白点样的小冰晶出现，提示溶液中已有大量冰核形成，即应立刻移开金属镊，将冷冻管放回冷冻仪，数秒钟后如再次拿出冷冻管观察，则标本溶液呈白色云雾状，提示溶液中已有大量小冰品形成，提示植冰成功。

植冰在超冷状态极容易成功，否则不易进行。

当麦管离开冷冻仪时，温度迅速上升。

因此在诱导冰晶形成时，麦管离开冷冻仪的距离宜短，操作动作必须快，以避免温度波动过大。

其次，冷冻仪的温度必须准确而且稳定。

在诱导结晶后，冷冻植冰后大量冰晶形成导致大量潜热的释放，所以诱导结晶后在植冰温度保留5–10分钟以达到平衡状态。

植冰使溶液浓度进一步增高，细胞进一步脱水。

植冰后的冷冻速率非常重要。

因为如果降温过快，则细胞内的水分来不及脱出，造成在胞内液渗透压还来不及增高，冰点还来不及降低的情况下，由于外界温度明显降至胞内液冰点之下，细胞内形成冰晶。

如果降温过慢，由于胞外溶液中的水逐渐结冰，剩余溶液的溶质浓度越来越高，细胞长时间地处于剧烈变化的外界pH和高渗透压中，将导致脂蛋白的变性而引起细胞的质膜的僵硬、收缩和受损，这称为溶液效应(solutioneffect)。

最佳的冷冻速率应当慢到足以防止细胞内产生冰晶；快到使细胞置于高电解质溶液中的时间缩短到最低限度，以减少溶液效应。

植冰后，在适宜冷冻速率下，随着冷冻过程中温度的下降，围绕胞外小冰晶将有更多的水结冰，细胞脱水则随着溶液中的水逐渐转变为冰晶而顺利进行。

随着细胞内外水分越来越少，溶质的浓度越来越高，细胞内、外液渐渐变为极其粘稠的状态，此时可以将其快速投入液氮。

这时，粘稠的胞内外液体立即转化为玻璃样的固体，与先前溶液中形成的冰晶凝固为一体。

胚胎投入液氮前的温度对复温后的活力影响极大。

在采用PROH方案时，在一25℃时将胚胎投入到液氮中保存，复温后极少胚胎存活；＿ 25℃一一30℃吋将胚胎投入液氮，复温后的存活率明显低于在一80℃一100℃时投入液态者；这说明在使用目前的冷冻器材的情况下，只有在较低温度下，细胞内的高浓度液体才能玻璃样固化而不至于形成大的冰晶。

虽然在低于一30℃时投液氮都是可行的，但许多IVF中心选择更低的温度，显然是考虑到投液氮过程中标本复温，以及标本稳定性等问题。

不论是细胞渗透性还是细胞非渗透性的保护剂都主要是为了给细胞造成脱水状态，但脱水的同时不能影响到细胞的生存；减少细胞外大冰晶的形成对细胞造成的损害也是冷冻应注意的方面之一。

业已证实，单纯就低温保存而言，影响细胞冷冻保存的关键因素，是细胞冷冻和复温过程中，必须两次经过冰晶形成和重结晶的中间损伤温度区。

在冷冻过程中，如果含水量过多，细胞可能毁于过度冰晶形成。

但脱水过度，细胞也可能死亡。

理想的冷冻方案是：①找到细胞含水过多和脱水过度之间的平衡点；②合适剂量的冷冻保护剂，既可以取代细胞质膜周围的水分子，又避免“溶质效应”；③合适的冷冻速率。

四、玻璃化冷冻法玻璃化冷冻法是将胚胎在适当的冷冻保护剂混合液中作短暂处理后，直接投入液氮。

冷冻保护剂在急剧降温到很低温度时能被浓缩而不结晶，而且液体的粘性增强，由液态变为透明的固态，形成玻璃化（“玻璃化”的概念是指水或溶液快速降温达到或低于-100℃~-110℃的温度范围时,形成一种高黏度的介于液态和固态之间、非晶体的、透明的玻璃态）。

用这种方法冷冻，无需冻前分步添加抗冻剂和冻后分步脱除抗冻剂的繁琐步骤，简化了冷冻过程，是一种简便、快速、有效的冷冻方法，不需要冷冻仪器。

玻璃化超快速冷冻技术它是最简洁、最快速的胚胎冷冻保存技术，冷冻过程不超过 1 min，不需要昂贵的程控冷冻仪器，是促进胚胎移植产业化的关键技术之一。

下面介绍几种常用的玻璃化冷冻法。

①超快速冷冻法l985年，Rail等首次应用DMSO、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇组成的玻璃化溶液超快速冷冻小鼠胚胎获得成功。

1986年，Scheffen等以25%甘油和25% 1，2一丙二醇玻璃化超快速冷冻牛胚胎，降低了玻璃化溶液的毒性；同年，Kasai等以40 %乙二醇、0．5 mol／L蔗糖和30 Ficoll的混合溶液超快速冷冻小鼠胚胎。

获得了较高存活率(98 %)，进一步降低了玻璃化溶液的毒性；2002年，朱士恩等应用以EG和DMSO 为主体的抗冻保护剂玻璃化冷冻小鼠原核胚，移植后妊娠率和产仔率与鲜胚的效果相近。

2003年，Fujio 等以DAP213(2．0 mol／LDMSO+1．0 mol／l 乙酰胺+3．0 mol／L丙二醇)为冷冻保护剂冷冻小鼠获得成功；2005年，Baranyai等分别用SSV(Solid surface vitrification)法和麦管法冷冻小鼠8一细胞期胚胎，证明了SSV法对于桑椹胚和胚泡阶段的胚胎是一种较好的冷冻方法。

②开放式拉长塑料细管法(open pulled straws，OPS)OPS法是丹麦人Vajta于1997年发明的，他使用薄壁细管，利用毛细现象将微量冷冻液滴和胚胎一起吸人管内后，投入液氮。

这种方法克服了传统玻璃化的缺点，加快了冷冻速度和复苏速度，其降温速率可达 2 500℃／min，且对细胞的毒性和损伤作用较小。

1998年，Vajta等应用OPS法冷冻牛不同阶段的胚胎，结果表明，受精后3～7 d的胚胎复苏后囊胚形成率为60 ～95 %，和新鲜胚胎无显著差别，且牛卵母细胞复苏后囊胚形成率高达25%，移植后产生3个仔牛。

Lazar等应用OPS玻璃化法冷冻了117个牛囊胎，复苏后孵化率为39．5%，移植率和妊娠率分别为16．7% 和50%，均显著高于普通麦管玻璃化冷冻。

朱亮等应用OPS法和传统麦管法对小鼠扩张囊胚进行玻璃化冷冻，结果表明，应用OPS法冷冻小鼠囊胚存活率(82．3 %)显著高于应用传统麦管者(68．6％)，且前者的冷冻囊胚孵出率(70．3 %)也明显高于后者(57．1 %)，因此认为OPS法是一种行之有效的冷冻方法。

但是OPS法也存在一些不足，由于冷冻液与液氮直接接触，液氮里的一些潜在的污染源会增加污染的机会。

③封闭式拉长塑料细管法(closed pulled straws，CPS)CPS法与OPS法相似，两者的区别在于CPS方法采用封闭式系统，即将含有胚胎的冷冻液通过两端的空气段和溶液段与外界隔开，从而能够避免胚胎和液氮直接接触而导致的损伤，有效降低了胚胎污染的危险性。

Chen等Lj 应用CPS方法冷冻小鼠卵母细胞并与OPS法进行比较，结果发现冷冻后2组之间受精率、囊胚形成率均无显著性差异，但CPS的存活率较0PS组明显提高(79% VS 63%)。

Ramezani等¨副对2一细胞期小鼠胚胎采用3种玻璃化冷冻方法(CS法、OPS法和CPS法)进行冷冻。