配子与胚胎冷冻保存、胚胎移植、性别控制
动物繁殖技术教学大纲
动物繁殖技术教学大纲动物繁殖技术是在认识动物生殖生理规律的基础上,研究调控和提高动物繁殖力的学科。
本课程涉及繁殖技术的生理基础、发情控制和鉴定技术、授精技术、性别鉴定与性别控制技术、胚胎工程、妊娠诊断、诱导分娩、双(多)胎技术等内容。
教学基本内容包括掌握畜禽生殖生理的普遍规律及动物繁殖技术在畜牧生产中的应用，要求学生能够掌握和运用这些规律指导畜禽的繁殖实践；掌握现代繁殖技术的理论基础和操作技术及其繁殖管理方法。
一、目的意义要求学生掌握动物繁殖学的基本概念，繁殖规律和生殖理论，掌握和运用这些规律和理论指导畜禽的繁殖实践，如精液采集及精液冷冻保存技术，人工授精技术，同期发情技术，超数排卵技术等，了解动物克隆、胚胎工厂化生产以及转基因动物技术的基本程序，了解动物繁殖技术新进展及其在畜牧业中的应用前景，为今后从事畜禽繁殖改良工作打下理论和技术基础。
二、时间分配教学总学时为60学时，其中理论讲授40学时，实验20学时。
三、组织方法本课程理论部分以课堂讲授为主，实验部分以在教师指导下学生自主动手为主。
四、考核成绩1.理论课考核方式：笔试，闭卷，满分100分，占总评成绩的70%。
2.实验课考试方式：实验操作，实验报告，占总评成绩20%。
3. 平时考核：考勤，作业，课堂提问，占总评成绩的10%。
五、说明教学内容绪论【目的要求】1．了解：动物繁殖技术在畜牧生产中的意义。
2．熟悉：动物繁殖技术进展概况。
3．掌握：动物繁殖学的基本概念；动物繁殖技术研究内容及范围。
【教学内容】1．一般介绍：动物繁殖技术在畜牧生产中的意义。
2．详细讲解：动物繁殖技术发展过程；动物繁殖学与其它课程的关系。
3．重点讲解：动物繁殖学研究的对象；动物繁殖的主要方式；动物繁殖技术研究内容及范围。
1.动物繁殖的概念1.1动物繁殖的概念2. 动物繁殖的主要形式2.1 动物繁殖方式3.动物繁殖学的概念3.1动物繁殖学3.2动物繁殖学研究的主要内容4. 动物繁殖学研究对象，课程性质，研究内容4.1动物繁殖学的研究对象4.2动物繁殖学课程的性质，家畜繁殖学与其它课程的关系。
奶牛性别控制技术概述
１ ． ２ ． ３ 受精 时 间 排 卵 前一 定 时 间输精 多 产 雌犊 ， 控制 受精 时 间 的方 法 较 简 单 ， 但 对 掌握 适 时输 精 的 技术 要求 较 高 ， 并 且准 确 率低 。
生雌 性 后代 ， 父母 双 亲都 是 中年牛 多生 雌性 后代 。
１ ． ２ ． ２ 生殖道 Ｐ Ｈ 值 由于 Ｙ 精 子 对 酸 性 环 境 的
耐受 力 比 Ｘ精 子差 ， 而 碱 性 环 境 则 相 反 。 通 过 控 制 母 牛生 殖道 的 ｐ Ｈ 值 从而 达到 控制 性别 的 目的。
种进 程 。
于养 殖户 和 养殖 场 的实 际生产 过 程 中。
２ 精 子 的分 离 方 法
精 子 的分 离 方法 有 多种 ， 其 中包括 沉 降 法 、 电泳
法 和免 疫学方 法 等 ， 这些 方 法 虽然 在 一 定 程 度上 提 高 母 牛 产 雌 犊 的 比例 ， 但 是 也 都 存 在 着 分 离 效 果 不 理想 或 者是 无 法 大范 围推 广 的缺 陷 ， 目前 实 际 应 用
１ 影 响奶 牛性 控 的 因 素
１ ． １ 胚 胎 移 植 前 的 性 别 鉴 定
胚胎 性别 鉴定 技术 就是 利用 胚 胎 分割 和 冷 冻技
术对 奶 牛的胚 胎 进 行 性 别进 行 鉴 定 ， 用 种 公 牛 冷 冻 精液 对母 牛进 行 体 外 受 精 ， 生 产 大 量 纯 种 胚 胎 。 然 后人 为 采用机 械 或 化 学 方 法 ， 进 行 早 期 胚 胎 性 别 鉴 定 。事实证 明 ， 胚胎 不仅 能 够进行 性 别 鉴定 ， 而 且 分
动物胚胎工程的研究现状及在生产中的应用
动物胚胎工程的研究进展及在畜牧业中的应用摘要：动物胚胎工程是用人工方法对动物卵母细胞或胚胎进行改造的技术。
胚胎工程技术研究的目的，是对哺乳动物的胚胎在体外进行人为控制操作，让其继续发育，进而获得优良或珍稀动物个体，并应用这类技术进行基础研究和应用开发性研究。
近年来动物胚胎程技术发展迅速，并逐步在畜牧业中推广运用，显示出良好的应用前景。
关键词：胚胎工程；进展；胚胎移植；动物克隆；胚胎干细胞动物胚胎工程是用人工方法对动物卵母细胞或胚胎进行改造的技术，包含胚胎移植、排卵控制、胚胎冷冻保存、体外受精与显微受精、胚胎分割、胚胎性别鉴定、胚胎冷冻保存、动物克隆和转基因动物等内容[1]。
目前，胚胎工程已在遗传学、医学、发育生物学、动物育种学上得到广泛应用。
将动物胚胎工程技术应用于畜牧业生产，取得了巨大的经济效益与社会效益。
一、动物胚胎工程技术的研究进展1、胚胎移植胚胎移植是胚胎工程的一项极其重要的基本技术，采用任何新技术所产生的胚胎，都必须通过胚胎移植才能得到后代。
科学家首先成功移植了兔胚胎，随后小鼠、大鼠及多种哺乳动物的胚胎移植试验相继获得了成功。
胚胎移植技术已被证实是奶牛繁育的一次重大变革，极大提高了优秀母牛的利用率，有利于产生更多优秀后备母牛和更多优质种公牛。
在现场条件下，奶牛的鲜胚移植妊娠率已达到60%～85%，冻胚移植妊娠率达50%～70%。
胚胎移植已在我国高技术研究和有关学科的基础研究中得到广泛的应用[2]。
2 、排卵控制排卵控制涉及排卵时间控制和排卵数量控制。
控制排卵时间的目的是得到特定发育阶段的卵母细胞，如做微注射转基因使用的原核胚。
排卵数量的控制又称为超数排卵[3]，是为了获得更多的卵子。
目前在控制排卵中常用的激素有FSH、LH、PMSG、HCG和PGF2a及类似物。
在正常情况下，哺乳动物一次排卵数极其有限。
经超数排卵处理，排卵数则可增加数倍至10余倍。
因此，在生产上或科学试验中，通过超数排卵处理可获得大量胚胎[4]。
女性生殖器的胚胎冷冻与胚胎储存
女性生殖器的胚胎冷冻与胚胎储存近年来，随着科技的进步和社会观念的变化，越来越多的女性在决定推迟生育或面临不孕症的情况下选择进行胚胎冷冻和胚胎储存。
这项技术使得女性可以在适合自己的时间和条件下实现生育愿望，同时也为保护生育力提供了一种新的选择。
胚胎冷冻和胚胎储存，简单地说，就是将女性受精卵受精后发育到一定阶段的胚胎进行冷冻保存。
这种技术的应用范围非常广泛，适用于计划推迟生育的职业女性、有遗传疾病的家庭、面临治疗后不孕的患者等等。
首先，胚胎冷冻和胚胎储存为职业女性提供了一个灵活的生育选择。
在现代社会中，女性通常面临着事业和家庭的选择。
很多女性为了事业的发展可能选择推迟生育，而这往往会对生育能力产生负面影响。
通过胚胎冷冻和胚胎储存技术，女性可以在早期职业生涯中进行胚胎冷冻，等到合适的时机再进行孕育。
这给予了女性更大的自由和选择权，不再需要过早地在事业和生育之间做出艰难的决定。
其次，胚胎冷冻和胚胎储存也对有遗传疾病的家庭提供了一种可行的选择。
某些家庭可能携带有遗传疾病的基因，这使得他们对于自然受孕和妊娠过程感到担忧。
通过胚胎冷冻和胚胎储存技术，这些家庭可以进行试管受精并对胚胎进行遗传学筛查。
如果胚胎没有遗传疾病，那么可以进行冷冻保存以备将来使用；如果胚胎携带有遗传疾病，那么可以选择放弃或者进行有选择性的胚胎移植，以减少遗传疾病的传播风险。
最后，胚胎冷冻和胚胎储存也为治疗后不孕的患者提供了一种希望。
一些疾病的治疗可能会对女性的生育能力产生副作用，比如卵巢发育不全、卵巢早衰等等。
通过胚胎冷冻和胚胎储存技术，患者可以在治疗前将自己的胚胎冷冻保存，以便治疗后使用。
这为患者保留了生育的机会，增加了治疗后的生活质量。
总的来说，女性生殖器的胚胎冷冻与胚胎储存是一项重要的技术和选择。
它赋予了女性更大的权利和自由，让女性能够在适合自己的时间和条件下实现生育愿望。
然而，胚胎冷冻与胚胎储存也存在着一些道德、伦理和技术方面的问题，需要社会各界的共同努力来加以解决和规范。
胚胎移植技术
考向一 以非选择题的形式考查胚胎移植的过程 1.下图为培育“转基因试管牛”的基本过程示意图,请据图回答下列问 题:
(1)A过程一般用 激素处理供体母牛,使其超数排卵,此前需用激 处理。 处理,采集的卵母 素对供体母牛和代孕母牛进行 (2)采集到的精子在进行体外受精前必须进行 细胞也需要培养至 期才能受精。
成熟后,才能与获能精子受精。
(5)体外受精:获能的精子和培养成熟的卵子可以在专用的
受精溶液
中完成受精过程。
2.胚胎移植技术 (1)概念:胚胎移植技术是指将良种母畜配种后,从其生殖道取出
早期胚胎
或通过体外受精及其他方式(如转基因、核移植)得到的胚胎
,再移植到 同种 的、生理状态相同的其他雌性动物体内,使它们进一 步发育为新个体的技术。 (2)应用:提高优良品种家畜的
2.胚胎干细胞的来源:胚胎干细胞是一类未分化细胞,可从早期胚胎 的囊胚期分离获取或从胎儿的原始性腺中分离获取。 3.干细胞的种类:
类别 全能干细胞 来源或举例 胚胎干细胞(囊胚期之前的细胞及内 细胞团细胞) 特点 能发育成完整个体
多能干能,
但无发育成完整个体的能力
(2)该过程中两次检查:第一次对收集的胚胎进行检查;第二次对受
体母牛是否妊娠进行检查。 (3)产下的犊牛性状取决于所用公牛和供体牛,性别取决于公牛提 供何种类型的精子,二者与受体牛没有关系,受体牛提供营养和胚 胎发育的场所。
2.胚胎移植和胚胎分割移植的比较
胚胎移植 概念 将胚胎移植到同种的、生理状态相同 的其他雌性动物的体内,使之继续发 育为新个体的技术 移植前 的处理 生殖方式 用促性腺激素对供体和受体进行同期 发情处理;对供体进行超数排卵处理 通过核移植技术获得胚胎,属于无性 生殖;通过体、内外受精获得胚胎,则 属于有性生殖 操作对象 作用及 意义 早期胚胎 充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力,大大缩短了供体本身的繁殖周期,提高了 繁殖率 胚胎分割移植 采用机械方法将早期胚胎切割成2等 份、4等份或8等份,经移植获得同卵 双胎或多胎的技术 对囊胚阶段的胚胎分割时,要将内细 胞团均等分割 分割后的胚胎具有相同的遗传物质, 可看作是无性生殖
动物配子与胚胎冷冻保存原理及应用
动物配子与胚胎冷冻保存原理及应用动物配子和胚胎冷冻保存是一种通过低温保存方式，将动物种子或胚胎保存在玻璃管或冷冻盒中，以便在未来的时候将其恢复生长和繁殖的技术。
动物配子或胚胎保存可以保证物种的遗传多样性，也可以为动物的保护和培育提供重要的帮助。
近年来，该技术在畜牧业、医学研究以及保存濒危物种等领域得到了广泛的应用。
动物配子和胚胎冷冻保存的原理是通过低温抑制生命体内的活动代谢，达到延缓历程的效果。
在冷冻过程中，配子和胚胎的内部液态会转变成固体所以需要添加抗冻剂来保护细胞和避免冰晶对细胞的伤害。
当冷冻被完成后，这些细胞或组织可以存储在超低温（通常为-196℃）下，以防止它们继续生长或衰老。
当需要将它们恢复到正常生长时，需要将保存的胚胎或配子慢慢加热到它们适合的温度以使其重新开始细胞代谢。
在畜牧业中，动物配子和胚胎的冷冻保存技术被广泛应用。
通过把高质量的家畜的配子和胚胎冷冻保存，可以在未来种群扩增 or 培育需要的时候母猪、牛、马和羊的种群扩增。
生物学家利用高质量的胚胎和配子创建基因改良动物，然后将其冷冻保管。
当需要在生产中培育更多的种群，在需要时就可以于提取原料，并将它们放入深度冷冻中进行保存。
这a对于种群扩增而言是非常重要的工具。
在医学研究领域中，无论是用于治疗不育症，还是利用它来治疗人造生殖植入，动物的配子和胚胎保存技术都是非常重要的技术。
这些技术可以为什么人造受孕程序创建可靠的储备源，这些储备源可以在不必要的情况下补充供体实验。
在保护濒危动物种群和保护野生动物方面，动物配子和胚胎保存技术也有着重要的作用。
通过采集、保存和重新植入野生动物或濒危动物的配子和胚胎，可以创建并保护优良的纯种，有效地保护某些濒危物种。
总之，动物配子和胚胎保存技术为畜牧业、医学研究和濒危物种的保护提供了可靠的参考。
虽然这项技术需要高度技术，但相信经过不断学习和研究，将来它将起到越来越重要的作用。
建立和规范生育力保存和操作流程
建立和规范生育力保存和操作流程一、引言随着社会的发展和人口的增长，生育力保存变得越来越重要。
生育力保存是指将男女生殖细胞（精子和卵子）或胚胎冷冻保存起来，以备将来生育需要。
这一技术已经在医学领域得到广泛应用，不仅可以帮助那些患有不育症的患者实现生育愿望，还可以帮助那些需要延迟生育计划的人群，如职业女性、癌症患者等。
然而，生育力保存并非一项简单的技术，其中涉及到许多复杂的流程和操作，需要进行规范和管理，以确保保存的生育力的质量和安全性。
为了建立和规范生育力保存和操作流程，本文将分为几个部分来探讨这一话题，包括生育力保存的意义和价值、生育力保存的技术原理和方法、生育力保存的管理和规范等内容。
二、生育力保存的意义和价值1. 解决不育问题：越来越多的夫妇在生育上遇到困难，导致不育问题成为一个全球性的社会问题。
通过生育力保存技术，可以帮助那些患有不育症的夫妇实现生育愿望。
2. 延迟生育计划：随着生活节奏的加快和职业竞争的激烈，许多人需要延迟生育计划，以追求事业和个人发展。
生育力保存技术可以帮助这些人在较高年龄时依然具备生育能力。
3. 防止疾病遗传：有些人患有遗传性疾病，通过生育力保存技术，可以选择健康的胚胎进行植入，以减少遗传疾病的传播。
4. 保护生殖系统：许多患有癌症等严重疾病的患者，在接受化疗或放疗的过程中会对生殖系统产生损害。
通过生育力保存技术，可以在治疗前保存自己的生育力，以备将来恢复生育能力。
总之，生育力保存技术具有重要的意义和价值，可以帮助更多的人实现生育愿望，延缓生育计划，预防遗传疾病传播，保护生殖系统健康。
因此，建立和规范生育力保存和操作流程显得尤为重要。
三、生育力保存的技术原理和方法生育力保存技术主要包括精子冷冻、卵子冷冻和胚胎冷冻三种方法。
不同的方法适用于不同的情况和需求，具体如下：1. 精子冷冻：精子冷冻是将男性的精子冷冻保存起来，以备将来生育需要。
精子冷冻技术成熟、简单、费用低廉，并且对男性生育力的影响较小，适用于那些需要延迟生育计划或患有不育症的男性。
动物繁殖技术：性别控制技术
人类：避免患上与性别相关的遗传疾病 畜牧业：提高畜牧业生产的效率
二、性别控制技术的发展概况
1、1906年Stevens和Wilson23年Painter发现人精子中的X染色体,Y染色体。 3、 1959年Welshons和Jacobs等提出Y染色体决定雄
第六节 性别控制技术(Sex control)
一、性别控制技术定义和意义 二、性别控制技术的发展概况 三、哺乳动物的性别控制技术 四、性别控制技术的发展前景
一、性别控制的定义和意义
（一）定义：指通过对动物正常生殖过程进行 人为干预，使成年雌性动物产出人们期望性 别后代的一种繁殖新技术。
受精之前——通过在体外对精子进行干预，使 在受精之前便决定后代的性别。
性的理论。 4、 1966年Jacobs发现雄性性别决定因素位于Y染色体
的短臂 5、1989年Palmer等找到了Y染色体上的性别决定区
（sex determing region of the Y chromosome, SRY)。 6、1992年英国的剑桥Mastercalf公司利用分离的精子 和体外受精技术得到性控犊牛。
三、哺乳动物的性别控制技术
（一）X、Y精子的分离 1、 X、Y精子的差异DNA含量 DNA含量的差异是由于性染色体的不同所引
起，但因测定方法的不同而引起测定值各异。 1968年，Schilling用沉淀法分离精子，他发现 沉淀于下层精子的DNA含量高于上层的精子，但 DNA含量之差却因测定方法不同而异。用显微光 谱法测定时为3.7％，用福尔根法测定时为0.3％， 用紫外线分光镜测定时为4.9％。
1、核型分析法：细胞遗传学方法又称为核型 分析法。常采用切割胚，一半用于鉴定性别， 一半用于冷冻或移植。其基本原理是取一部 分细胞，先用秋水仙素处理，再固定染色， 检查性染色体，根据人色体中期的谱带差异、 Y染色体的大小及形态判断性别，准确绿达 100%。但过程复杂，且要求操作人员有丰富 的经验。
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细管冻精方法
2、卵子或胚胎冷冻保存
小分子渗透冷冻保护剂+大分子非渗透性冷冻保护剂 程序冷冻
玻璃化冷冻
1、冷冻胚胎的选择： 用于冷冻保存的胚胎必须是形态良好的、发育正
常
的高质量胚胎，可以通过超数排卵及人工授精和体外 受 精获得。
2、程序冷冻：
1、10%甘油或乙二醇+0.25M Sucrose，程序降温1℃/min，形 成冰晶。 2、程序：抗冻保护剂的添加、程序降温、植冰、解冻、 防冻剂 的去除
胚胎装管：
将平衡好的胚胎移入冷冻液中，然后将胚胎装入冷冻管内。
降温程序：
慢速冷冻：室温
-7℃
1℃/分 植冰 0.3 ℃/分
-30 ℃
液氮
冷冻速度 a. 在胚胎冷冻的早期研究中，大多采用慢速冷冻，以保证胚胎 脱水充分，避免形成冰晶。
b.快速冷冻方法的建立使冷冻程序更为简单、方便。
3、玻璃化冷冻OPS(Open Pulled Straw)法：
精液冷冻步骤：
采精
精液品质检查 精液的稀释 精液保存
（一）、采精：
定义：借助特定的器械将雄性的精液采集出来的技术。
（一）假阴道法 Artificial vagina （牛、羊） （二）手握法和筒握法 A gloved hand （猪） （三）按摩法采精 Massage method （犬、鸡） （四）电刺激采精法 Electroejaculation（野生动物和丧失交配能力
抗冻保护剂的种类：
1、小分子渗透性抗冻保护剂
甘油、乙二醇、丙二醇、DMSO等
2、大分子非渗透性抗冻保护剂
蔗糖、聚蔗糖、棉子糖，麦芽糖，海藻糖等
3、卵黄（sperm）
冷冻保存及解冻方法
一、精液 二、卵子或胚胎
一、精液冷冻：
小分子渗透冷冻保护剂（甘油）+卵黄，液氮蒸气熏 蒸或干冰冷• •
•
颗粒 A．12.0％蔗糖液75.0mL，卵黄20.0mL，甘油5.0mL。
B．0.11％乳糖液75mL，卵黄20.0mL，甘油5.0mL。 C．2.9％柠檬酸钠液73.0mL，卵黄20.0mL，甘油7.0mL。 D. Tris 3.44 g，柠檬酸1.83 g，果糖1.26 g，卵黄15%，甘油5%。 所有稀释液每100.0mL中添加青、链霉素各10万单位，现配现用。
解冻：将胚胎从液氮中取出，通过一定程序恢复到室温。 冷冻保护液为含有非渗透性冷冻保护剂的溶液，以避免渗透压 的迅速变化对胚胎造成的损伤。解冻后的胚胎需在此液中停留一段 时间以除去渗透性冷冻保护剂。
6、解冻和去保护剂过程
慢速解冻：20℃/分 快速解冻：360-500℃/分，30-37℃水浴 解冻时，将装有胚胎的冷冻管从液氮罐中取出，在室温下 停留10秒，然后放入30℃水浴40秒，用消毒的干纱布擦净管， 剪断细管两头，将胚胎和冷冻保护剂倒入解冻液中，6-7分钟后 移入培养液，洗涤3次后培养。（程序冷冻的解冻方法） 从液氮中取出已冻存的OPS管，手指堵住OPS管尾，管 尖端插入解冻液中，胚胎和冷冻液被转移到解冻液1中，停留 5min后转入解冻液2，再停留5min，最后移入培养液，洗涤3 次后培养。（OPS的解冻方法）
四、配子与胚胎冷冻保存 五、胚胎移植 六、性别控制
胚胎移植
• 手术法胚胎移植（小鼠、羊） • 非手术法的胚胎移植（牛）
家畜胚胎移植操作步骤
供、受体的选择
供体的超数排卵与人工授精
受体的同期发情
胚胎的收集
胚胎的检查和评定
胚胎的移植
牛 胚 胎 移 植 示 意 图
牛 非 手 术 胚 胎 移 植 示 意 图
第五部分 胚胎生物技术
四、配子与胚胎冷冻保存
五、胚胎移植
六、性别控制
配子与胚胎冷冻保存
概念：配子与胚胎冷冻是指采用抗冻保护剂 对配子或胚胎进行脱水处理，再经过降温程序使 胚胎最终在-196℃条件下停止代谢活动，条件适 宜时解冻并使其恢复活力的技术。
意义：建立配子库、胚胎库；保护生物多样 性和珍惜濒危动物遗传资源；遗传资源及动物模 型的国际范围内运输；避免运输过程中携带细菌 或病毒。
双头和双尾精子
8、精子顶体异常率
顶体与精子受精能力直接有关，牛超过14%，猪超过 4.3%，显著降低受精率。
(三)、精液稀释液
•
细管 A．一液：2.9％柠檬酸钠液100.0mL，卵黄10.0mL。
二液：取一液41.75mL加果糖2.5g，甘油7.0mL。 B．脱脂牛奶83.0mL，卵黄10.0mL，甘油7.0mL。
• 所需器械：移植枪
非手术法胚胎移植操作步骤（牛）
1 、受体牛在发情后6—8天之间均可进行移植（发情之时定为0 小时）。移植前对受体牛进行直肠触摸，检查黄体是否合格。合格 者用于移植。 2、 在移植之前必须先进行尾椎硬膜外麻醉 ，擦拭外阴部。 3、 对照供体牛采胚记录表和合格受体的发情记录，合理地搭配 受体和胚胎。 4、 解冻胚胎。 5、 重新将胚胎装入0.25ml塑料细管（直接解冻移植法不需要重 新装管）。 6、 细管装入移植枪。 7、 把装有细管的移植枪套上硬外套，用塑料环卡紧，再套上软 外套。 8、 将胚胎移植到受体黄体侧的子宫角大弯处。 9、 做好受体移植记录。
所需仪器：细管灌封一体机（NFA-S1，富士平工业株
式会社）
简易方法：用1ml注射器（把200μL取样枪头从中间剪开，
将尖头部插入注射器头部）将精液吸入0.25 mL的细管内， 管尾部留约1cm的空间，以备封口用，然后用PVC粉末封 口，记号标识。
冷冻程序：将装好精液的细管装入金属架式网盒中，放
入冷冻,在距离液氮上方5cm熏蒸15min后浸入液氮里保存.
防冻剂去除过程也有多步法和一步法。 常规冷冻法：PBS+20%FCS+0.25M蔗糖。 OPS法：a. TCM199+20%FCS+0.3M蔗糖（5分钟） b. TCM199+20%FCS+0.15M蔗糖（5分钟） 或直接进入TCM199+20%FCS+0.25蔗糖中进行移植。
第五部分 胚胎生物技术
• 稀释后的精液，采用逐渐降温法。在1～1.5小
时内，使稀释精液的温度降到4～5℃；然后再在
同温的恒温容器内平衡2～4小时。
（四）、精液冷冻保存方法：
1、颗粒精液 2、细管精液
颗粒冻精方法
• 所需器械：采用聚四氟乙烯板（简称氟板）、铜纱网、
尼龙网或铝板均可。
• 程序：在装有液氮的容器上置一铜纱网，距液氮面２厘
•
精液稀释方法
• 1、一次稀释法：
将采出的精液用含有甘油的同温稀释液按比 例一次加入（常用于颗粒精液）。
• 2、二次稀释法：
将采出的精液用不含有甘油的常温稀释液一 按精液品质稀释，放入4 ℃平衡，然后加入等温 的含甘油的第二液，加入量等于第一次稀释的精 液量（常用于细管精液）。
降温和平衡（预冷）
1）、35%-40%的抗冻保护剂（乙二醇、DMSO），迅 速投入液氮，降温速率3000℃/min，形成玻璃化状态， 不形成冰晶 。
2）、程序：抗冻保护剂的添加、快速降温、解冻、防
冻剂的去除
OPS法冷冻程序：
VS1: TCM199+20%FCS+10%EG+10%DMSO (1分钟) VS2: TCM199+20%FCS+20%EG+20%DMSO （25秒） 39℃条件下完成。
精液质量控制（国标）
• • • • • • • • • • • • •
1、剂量： a. 细管：中型0.5毫升；微型0.25毫升。 b. 颗粒：0.1±0.01毫升。 2、精子活力 解冻后活力，指呈直线前进运动的精子百分率（下限）30％（即0.3）；精 子复苏率（下限）50％。 3、 每一剂量解冻后呈直线前进运动的精子数 细管：每支（下限）1000万个。 颗粒：每粒（下限）1200万个。 4、 解冻后的精子畸形率（上限）20％。 5、 解冻后的精子顶体完整率（下限）40％。 6、 解冻后的精液无病原性微生物，每毫升中细菌菌落数（上限）1000个。 7、 解冻后的精子存活时间 在5～8℃贮存时（下限）为12小时；在37℃贮存时（下限）4小时。 牛冷冻精液必须符合上述各项指标。否则，不得使用。
抗冻保护剂：
通常在冷冻液中添加抗冻保护剂形成高渗，细胞内 水分外流的同时，抗冻保护剂内流至配子或胚胎细胞内， 抗冻剂存在使溶液的冰点降低，使胚胎有更多的时间把细 胞内的水分脱出，避免形成冰晶。但抗冻剂具有毒性，尤 其在高浓度和高温情况下毒性更大。
冰晶与抗冻保护剂毒性/渗透压打击之间的平衡：
冷冻过程中除了冰晶、抗冻剂毒性外，还要考虑渗 透压打击。因此冷冻成功与否就在于在冰晶和抗冻剂毒性 和渗透压打击之间的平衡点。抗冻保护剂浓度越高、处理 时间越长脱水越彻底，但毒性和渗透压打击越大。
冷冻保护剂的添加（程序化冷冻)： 可采用多步法或一步法。胚胎移入冷冻保护液需平衡 一段时间，以保证保护剂完全渗入细胞内。平衡时间的长 短视胚胎和冷冻保护剂渗透情况而定。冷冻前胚胎长期接 触保护剂会产生毒害作用，一般平衡时间10-30分钟。 （牛冷冻液：PBS+20%FCS+10%甘油（乙二醇）+0.25M蔗糖）
但种用价值高的公畜）
（二）精液品质鉴定：
1、外观：
颜色： 一般为乳白色或灰白色。正常牛羊精液呈乳白色或乳黄色，猪、马的 精液呈淡乳白色或浅灰白色。
正常精液特征
依从浓到稀：乳黄-乳白-白色-灰白