家畜胚胎超低温冷冻保存的研究进展

家畜胚胎超低温冷冻保存的研究进展蔡元1、2，张凤鸣1、2，潘红梅1、2、，陈四清1、2(1.重庆市畜牧科学院重庆荣昌402460 .2.重庆市养猪工程技术研究中心重庆荣昌402460)摘要：本文对家畜胚胎冷冻保护液的成分、冷冻方法、胚胎解冻方法与冷冻保护剂的脱除及最新研究进展进行了综述。

关键词：家畜；胚胎；冷冻保存Present Research Advance in Cryopreservation of Livestock EmbryosCai yuan1、2, Zhang fengming1 2 ,Pan hongmei1、2 ,Chengsiqing1 2(1.Chongqing Institute of Animal Science ,Chongqing Rongchang 4024602.Chongqing Swine engineering Research，Chongqing Rongchang 402460)Abstract： Advances on cryoprotextive solution, freezing way, thaw way and the elimination of cryoprotective solution and recent situation in livestock embryos were reviewed in this paper. Key words：Livestock；Embryo；Cryopreservation家畜胚胎的超低温冷冻保存技术不仅为动物种质资源的保存和良种家畜的国际交流提供了简单有效的手段,而且还是胚胎移植、体外受精、转基因和克隆等胚胎生物技术不可分割的组成部分。

自从1972年,英国学者Whittingham等人首次冷冻保存小鼠胚胎获得成功后[1]，到目前已经在20多种哺乳动物上获得成功，奶牛、黄牛、山羊、绵羊、马、兔和小鼠等的冷冻胚胎已得到较广泛的使用[2-3]，特别是牛和羊的胚胎冷冻保存研究进展很快，其冷冻胚胎已经走向商品化应用。

目前人们对冷冻保存原理、冷冻保存的因素和冷冻方法进行了广泛的研究并取得了巨大进步。

1、抗冻保护剂和冷冻溶液在哺乳动物的胚胎冷冻过程中，加入抗冻保护剂的目的是为了防止冰晶的形成。

抗冻保护剂常可分为三类：(1)细胞内液抗冻保护剂。

常用低分子量可渗性物质，例如甲醇、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)等；(2)细胞外液抗冻保护剂。

常用低分子量不可渗性物质，例如半乳糖(Galactose)、蔗糖(Sucrose)、海藻糖(Trchaose)、聚蔗糖(Ficoll)等。

（3）大分子量不可渗性物质，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)，羟乙基淀粉及其它一些聚合物。

在实际应用中，缓慢冷冻法经常只使用一种抗冻保护剂，如甘油或乙二醇等，而快速冷冻和玻璃化冷冻常应用多种抗冻保护剂，如甘油和丙二醇、甘油和乙二醇或者乙二醇和丙二醇，再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖。

甘油可调节细胞脱水并保护蛋白结构，而糖类，例如海藻糖可以保持膜结构，甘油本身并不能保持细胞膜结构，而且在高浓度和高温下可以诱发膜融合，因此解冻后需尽快除去甘油。

这些不同低温保护液的特性表明，他们是以不同方法来保持胚胎细胞免受冷冻损伤，有效的低温保护液应将各种低温保护剂有机结合起来。

2、冷冻方法自从哺乳动物胚胎冷冻保存成功以来，研究者从冷冻速度、解冻速度和操作程序等方面进行了改进，目前主要由常规冷冻法、直接冷冻法和玻璃化冷冻法。

2.1常规冷冻法该方法是Whittingham首次成功应用在小鼠卵母细胞低温保存时建立起来的方法。

随后研究者不断完善该方法，目前已被广泛采用。

一般G、DMSO 和EG 等作为冷冻保护剂。

在冷冻的初始阶段, 分三或四步将胚胎浸入浓度由低到高的冷冻保护剂中, 每步间隔10min, 使保护剂充分渗入胚胎细胞。

有的研究者把保护剂的添加由三步或四步减为一步, 即直接将胚胎放入含最终浓度的保护剂中, 经比较这两种方法差异不显著。

其冷冻程序一般为: 胚胎先以1℃/min 的速度由室温降至- 7℃, 植冰, 然后以0.1- 0.5℃/min 降温至-35℃, 平衡10min 后, 投入液氮保存。

植冰使细胞外保护剂冻结, 胚胎慢慢冷却并开始脱水收缩。

当温度降至-15℃时, 胚胎细胞体积收缩50% , 降至- 20℃时收缩60%。

慢速冷冻使胚胎过度脱水, 必须采用缓慢解冻法使胚胎复原, 提高其存活率[4]。

2.2直接冷冻法直接冷冻法也叫一步细管法，就是冷冻胚胎解冻后,将细管内的溶液混合静置,然后可直接移植的冷冻胚胎保存方法。

1982年Niemonn 等用蔗糖二步清除防冻剂的方法,法国的Renard 等对此进行了改进,采用0.125mol/L 蔗糖液一步清除法。

此后不久,Leibo 等提出了在胚胎解冻后,不需分几步洗脱防冻剂,可直接移植的一步吸管法,该法特别在现场给受体母牛移植时,操作十分简便。

阳年生等对胚胎一步脱除防冻剂的冷冻方法也进行了深入的研究[5]。

贺文杰等1998年应用一步解冻法对奶牛胚胎解冻取得了33.13%的移植受胎率[6]。

2.3玻璃化冷冻法玻璃化冷冻法是将胚胎在适当的冷冻保护剂混合液中做短暂处理后,直接投入液氮。

它是根据物理学原理,将高浓度的低温保护剂在超低温环境下凝固,形成无规则的玻璃化固体,这种固态物质能保持液态时的正常分子与离子分布,因而在细胞内发生玻璃化起到保护作用。

Rall 和Fathy[7]首次报道了用玻璃化方法来冷冻保存小鼠胚胎。

这种方法不仅大大简化了冷冻过程,而且减少了由于细胞冰晶形成所引起的一系列物理及化学损伤。

此外,这种方法采用迅速通过临界温度区,从而减轻了一些动物胚胎冷冻中常见的冻伤现象。

玻璃化冷冻过程中必须有至少一种渗透性冷冻保护剂(如DMS0、PG、EG、PROH等)，而且浓度要在5～8mol/L，还需要非渗透性冷冻保护剂如蔗糖等。

降温速度越快越好，操作一定要迅速。

目前，玻璃化冷冻方法已有好多种。

如按照冷冻过程中使用工具的不同可分为细管法、微滴法、电子显微镜铜网法（electron microscopic grid,EMG)[8]、开放式拉长塑料细管法(0pen pulled straw,0PS)[9]、低温环法（Cryoloop）[10]、玻璃微细管法(glass micropipette,GMP)、微型冷冻瓶法(cryovial)[11]。

Kasai等以乙二醇为主体抗冻保护剂配制EFS40玻璃化溶液,在20℃室温下,对小鼠桑椹胚平衡2～5 min后投入液氮中冷冻保存,解冻后获得了很高的体外发育率(96%)[12]。

以后用相同的方法对ICR小鼠各阶段胚胎冷冻保存,其中囊胚的保存效果欠佳(发育率为57%)[13],继而Zhu等改室温为25℃,经预处理即二步法冷冻保存的囊胚发育率高达95% ,移植产仔率也达到58%[14]。

朱士恩等1999年采用液氮气熏蒸法玻璃化冷冻小鼠扩张囊胚,胚胎解冻后透明带损伤率为0% ,胚胎发育率近100%,囊胚孵化率80%,从而解决了玻璃化冷冻解冻过程中因急速降温和升温使胚胎遭受物理性损伤,导致透明带破裂而死亡这一关键性问题[15]。

和常规冷冻方法相比，玻璃化法具有快速、经济的特点，而且不需要仪器和电源，可以在野外操作，但操作过程必须快速、熟练，否则玻璃化液会对卵母细胞产生巨大毒性和渗透性损伤。

另外，除细管法以外的其它方法都使冷冻液和液氮直接接触，可能会造成对胚胎的污染。

3、胚胎解冻及脱除保护剂3.1解冻胚胎解冻方法有快速解冻和缓慢解冻。

快速解冻时,预先准备30～35℃温水, 将冷冻胚胎投入其中,轻摇1min后取出, 即完成解冻。

实验证明,冷冻胚胎的快速解冻优于缓慢解冻。

余文莉等报道将牛胚胎经常规冷冻后移入1mol/L 蔗糖PBS解冻液,较15%蔗糖PBS 溶液和12%蔗糖+5%甘油PBS溶液解冻效果好[16]。

Dall.WF指出,胚胎从液氮中取出后在空气中稍作停留,待温度缓慢回升到一定程度再进入温水可降低热应激效应[17]。

3.2脱除保护剂胚胎在解冻过程中脱除保护剂是必要的。

一方面是因为保护剂对胚胎有一定的毒性；另一方面,把含有较高浓度保护剂的胚胎移植到受体的生殖道或移入等渗培养液中,由于细胞内外存在较高的渗透压差,大量水分子进入细胞而使其膨胀或崩解。

目前多采用蔗糖液法脱除保护剂使胚胎复水。

即在胚胎解冻后, 室温(25～26℃)下放入用血清PBS 配制成的0.2～0.5M蔗糖液中,保持5～10min,于显微镜下观察, 当胚胎扩张至接近冻前状态时, 即认为保护剂已脱除。

4、家畜胚胎超低温保存研究现状家畜胚胎冷冻以牛胚胎最为成功，牛的胚胎冷冻保存已是一种较成熟的常规技术，采用常规冷冻法、直接冷冻法和玻璃化冷冻法，均可成功。

牛胚胎冷冻已广泛应用于商业性胚胎移植工作。

山羊用常规冷冻法、直接冷冻法和玻璃化冷冻法也已成功，其中以OPS玻璃化冷冻法效果最好，国内OPS法冷冻保存的波尔山羊胚胎解冻后的妊娠率达61.5%，移植后产羔率为40.0%[18]。

然而，上述方法对猪的胚胎冷冻保存一直未能得到理想的效果。

猪胚胎常规慢速冷冻的研究主要集中在20世纪80年代末，90年代初，在这一时期冷冻保存成功的都是扩张囊胚到孵化囊胚期间的胚胎，因为其脂质含量较少，而早期胚胎由于脂质含量较高，冷冻后均不能成活[19]。

1994年，Dobrinsky等[20]首次玻璃化冷冻第6、7天的猪胚胎成功，胚胎解冻后在体外的发育率分别为27%和39%。

Vajta等[21]首次报道了用OPS法冷冻体内生成的猪胚胎，获得了91%的胚胎冻后存活率和67%的孵化囊胚率。

但是他没有进行冻后胚胎的移植产仔试验。

2000年，Berthelot第一次进行了将猪胚胎经OPS法冷冻后生下后代的报道[22]。

猪胚胎玻璃化冷冻后的存活率与胚胎发育阶段有关，孵化囊胚冻后存活率较高，而桑椹胚和早期囊胚较低，这和胚胎中的脂质含量有关。

Nagashima等[23]将猪桑椹胚和早期囊胚去除脂肪滴后用常规冷冻和玻璃化冷冻方法冷冻保存，解冻后培养48h ，胚胎发育率分别是89%和83%。

经胚胎移植后，11头受体共产下27头小猪。

近期美国学者采用胚胎细胞“骨架结构松弛法”+玻璃化方法，获得孵化囊胚冷冻保存成功的结果；丹麦学者采用“开口细管”法，取得早期胚胎低温冷冻并能存活的诱人结果。

目前玻璃化冷冻保存技术在家畜胚胎冷冻保存上取得了巨大成功，在不久的将来改善的玻璃化冷冻保存技术将会代替传统的慢速冷冻法，并且会给商业化胚胎生物技术提供新的途径。

这对解决我国动物遗传资源急速衰减，挽救濒危品种，建立胚胎库和配子库，提供了一个广阔的前景。