哺乳动物胚胎冷冻保存综述
哺乳动物胚胎冷冻方法研究进展
３ 胚 胎 冷 冻 方 法
３ Ｉ 常 规 冷 冻 法 ．
究 主要倾 向于玻 璃化法 ， 方面的研 究报 道 比较 多 ， 这
其 目的在于 简化 冷冻程 序 ， 短操 作时 间 ， 于推广 缩 便 应用。 ２ 抗 冻保护 剂和 冷冻 溶液 在 哺 乳动 物 的 胚胎 冷 冻过 程 中， 晶 的形 成对 冰
较 这 两 种 方 法 差 异 不 显 著 。其 冷 冻 程 序 一 般 为 胚 胎
胚 胎 的损 伤 是 致 命 的 。对 于 胚 胎 的 冷 冻 和 解 冻 ，
一
１ ℃～一Ｏ 是 一个致 死温 度 区 ， ５ ５℃ 在这个 温度 区 ， 细
胞 内容 易形成 大 的冰 晶［ 。加入 抗 冻保护 剂能 避免 ２ ］ 冰 晶的形成 。 抗 冻保 护剂 常分 为细胞 内液抗 冻保 护剂 和细胞
先 以 ＩＣ／ ｎ的 速度 由室温 降至一 ℃ ， 冰 ， 后 以 。 ｍｉ ７ 植 然
０ １ ０ ５ ｒｉ 降 温 至 一 ５ ， 衡 １ ｎ后 ， ． ～ ． ℃／ ｎ ａ ３℃ 平 ０ｍｉ 投
外 液抗 冻保 护剂 两种 ， 前者 常用低 分子 量可 渗物质 ，
例如 甲醇 、 乙二醇 （ Ｇ） 丙 二醇 （ Ｇ） 甘 油 （ Ｙ） Ｅ 、 Ｐ 、 ＧＬ 、 二 甲基 亚砜 （ ＤＭＳ 等 ， 者 常用 低 分 子 量 不 可 渗 Ｏ） 后
醇 或者 乙二醇 和丙二 醇 ， 加人 葡 萄糖 、 再 蔗糖或 半 乳
糖。
６ ０枚 一细 胞兔 胚胎 冷冻 ， 冻 后 培养 ， 有 ６枚 发 ０ 解 仅 育 。Ｗｈｔｉｇ ａ 等 （ ９ ２年 ）１用 缓 慢 冷 冻 一 解 ｉ ｎｈｍ ｔ １７ ［
冻 法冷 冻小 鼠胚 胎 获得 成 功 。 目前 ， 胎 冷 冻 的研 胚
大鼠胚胎冷冻保存技术及研究进展
常 规 慢速 冷 冻 由Ｗ ｉ ｔ ｎ ｈ ｍ ｈ ｔ ｉ ｇ ａ 等 首 先 发
植产 下后 代 。 随后 ，牛 （ ｉ ｍ ｔ 和 Ｒ ｗ ｏ ， ｗ ｌｕ ｏ ｓ ｎ ｌ７ ） ９ ３ 、家 兔 （ ｈ ｔ ｉ ｇ ａ 和 Ａ ａ — ， Ｗ ｉ ｔｎ ｈ ｍ ｄｎ ｌ ｓ
黑龙江动物繁殖
第１ ９卷 第 ５ 期
２ １ 年 ０ １
大 鼠胚胎冷冻保存技术及研究进展
张 丽 谭竹钧 刘 ， ， 牧
（＿ 东工 业 大 学 轻 工 化 工 学 院 ，广 东 Ｊ Ｉ ５０ ０ ； ２ 巾 国 医 学科 学 院 医 学 实 验 动 物 研 究 所 ， 北 京 １０ ２ ） １广 州 １０ ６ ． ００１
关键 词 ： 大鼠 ； 胎 ； 冻保 存 胚 冷
中图分类号 ：￥ １ ． ８４ １
文献标识码 ：Ｂ
文章编号 ：１０ ７ ９（ ０ １ ５ ０ ０ — ６ ０ ５ ２ ３ ２ １ ）０— ０ ６ ０
大 鼠是 常用 实验动物之一 ，在生命科学和 医 制缓慢冷冻 ，到利用 电子计算机控制 的胚胎 冷冻 学研 究领域 中均有较 高应 用价值 。随着大 鼠基 因 装置进行简便 、快速 的程序化冷冻 ，以及 玻璃化 序 列测序 的完成和基 因敲除技术 的发展 ，通过转 冷冻 。本文 综述 了大 鼠胚胎冷冻保存技 术的研究 基 因 、基 因敲 除等 生物工程技术 已成功建立 的人 进 展 。 类 大 鼠疾病模型 日渐 增多 ，如高血压大 鼠、心脏 １ 冷冻保护剂 病大 鼠、糖尿病大 鼠等 。以常规 的繁殖方 式维持 冷 冻保 护 剂是 指 可 以保 护 细胞 在 低温 或 超 物 等 这些大 鼠品系 ，不但 需要大量 的饲养空 间和维 持 低温 时产 生损 害 （ 理 性 、化 学 性） 的一类 化
冷冻保存胚胎技术在家畜种质资源保护中的意义
冷冻保存胚胎技术在家畜种质资源保护中的意义绪论：随着现代科学技术的不断进步，冷冻保存胚胎技术逐渐应用于家畜繁殖领域。
该技术的出现为家畜种质资源保护带来了革命性的变革，成为了一种有效的保存和传承家畜遗传优良性状的方法。
本文将从冷冻保存胚胎技术的原理、应用领域、优点和局限性以及对家畜种质资源保护的意义等方面进行探讨。
一、冷冻保存胚胎技术的原理冷冻保存胚胎技术是指将受精卵或早期胚胎经过生物学方式冻结储存，以便随时解冻后进行移植，实现胚胎的存储和利用。
其原理主要包括胚胎的处理和冷冻保护两个方面。
胚胎的处理包括收集、检测和筛选等步骤，以确保胚胎的质量和可行性。
冷冻保护则是通过控制胚胎内外液体的化学组成，减少胚胎的冷冻损伤，使其能够在低温下存活。
二、冷冻保存胚胎技术的应用领域冷冻保存胚胎技术在家畜繁殖领域具有广泛的应用。
首先，在种畜选育领域，该技术可以保存遗传优良的母畜和种公畜的胚胎，为后代遗传优良性状提供有保障的种质资源。
其次，在种畜繁殖和疾病防控方面，该技术可以将对特定疾病高度抗性的种公畜的胚胎保存和传承，以增强目标品种的疾病防控能力。
此外，冷冻保存胚胎技术还可以解决家畜繁殖过程中的时间限制和季节限制等问题，提高繁殖效率和经济效益。
三、冷冻保存胚胎技术的优点和局限性1. 优点冷冻保存胚胎技术具有以下几个方面的优点：（1）胚胎具有更长久的保藏时间：通过冷冻保存，胚胎可以在低温条件下保存多年，提供种质资源的长期储备。
（2）家畜品种的传承更加便捷：冷冻保存胚胎技术可以解决季节因素、疾病限制等问题，使家畜品种的传承更加方便和可行。
（3）提高种质资源的利用效率：冷冻保存可以使优良种质资源更加广泛地利用，避免因传递限制导致资源浪费。
(4)减少地域因素的限制：冷冻保存胚胎技术可以在不同地域进行交流和传递，促进家畜种质资源的交流与合作。
2. 局限性冷冻保存胚胎技术也存在一些局限性：（1）技术难度高：冷冻保存胚胎技术的操作要求严格，需要专业人员进行操作，技术门槛较高。
动物配子与胚胎冷冻保存原理及应用
动物配子与胚胎冷冻保存原理及应用动物配子和胚胎冷冻保存是一种通过低温保存方式，将动物种子或胚胎保存在玻璃管或冷冻盒中，以便在未来的时候将其恢复生长和繁殖的技术。
动物配子或胚胎保存可以保证物种的遗传多样性，也可以为动物的保护和培育提供重要的帮助。
近年来，该技术在畜牧业、医学研究以及保存濒危物种等领域得到了广泛的应用。
动物配子和胚胎冷冻保存的原理是通过低温抑制生命体内的活动代谢，达到延缓历程的效果。
在冷冻过程中，配子和胚胎的内部液态会转变成固体所以需要添加抗冻剂来保护细胞和避免冰晶对细胞的伤害。
当冷冻被完成后，这些细胞或组织可以存储在超低温（通常为-196℃）下，以防止它们继续生长或衰老。
当需要将它们恢复到正常生长时，需要将保存的胚胎或配子慢慢加热到它们适合的温度以使其重新开始细胞代谢。
在畜牧业中，动物配子和胚胎的冷冻保存技术被广泛应用。
通过把高质量的家畜的配子和胚胎冷冻保存，可以在未来种群扩增 or 培育需要的时候母猪、牛、马和羊的种群扩增。
生物学家利用高质量的胚胎和配子创建基因改良动物，然后将其冷冻保管。
当需要在生产中培育更多的种群，在需要时就可以于提取原料，并将它们放入深度冷冻中进行保存。
这a对于种群扩增而言是非常重要的工具。
在医学研究领域中，无论是用于治疗不育症，还是利用它来治疗人造生殖植入，动物的配子和胚胎保存技术都是非常重要的技术。
这些技术可以为什么人造受孕程序创建可靠的储备源，这些储备源可以在不必要的情况下补充供体实验。
在保护濒危动物种群和保护野生动物方面，动物配子和胚胎保存技术也有着重要的作用。
通过采集、保存和重新植入野生动物或濒危动物的配子和胚胎，可以创建并保护优良的纯种，有效地保护某些濒危物种。
总之，动物配子和胚胎保存技术为畜牧业、医学研究和濒危物种的保护提供了可靠的参考。
虽然这项技术需要高度技术，但相信经过不断学习和研究，将来它将起到越来越重要的作用。
哺乳动物胚胎冷冻保存研究进展
胚胎冷冻 保存 是指 通 过 特殊 的保护 措 施 和 降温程 序 ，
细胞 内形 成致死 冰晶。 ２ 防冻剂的种类 ２ １ 低 分子量渗 透性 防冻剂 主要 有 甲醇 、 ． 乙二 醇 、 ，一 ｌ２丙 二醇 、 Ｍ Ｏ、，－ Ｄ Ｓ ２ ３丁二 醇 、 油 、 甘 乙酰 胺 等 。这 类 防冻 剂不 仅
（． １辽宁医学院动物科学技术学院 ， 辽宁锦州 １１０ ；． ２０ ｌ２锦州饲料监测 中心 ， 宁锦州 １１０ ；． 辽 ２００３ 吉林农业大学动物科学技术学院， 吉林 长春 １０１） ３１８
摘要 ［ 目的］ 绍哺乳 动物胚胎 冷冻保存技 术的 最新研 究进展 。 ［ 法］ 冷冻原 理 、 介 方 从 防冻 剂种 类 、 冻方 法、 冷 解冻 方法等 方 面综述 了哺 乳动物胚胎 冷冻保存技 术的 最新研 究进展 。［ 结果 ］ 胎冷 冻保 存的 原理是 阻止 冷 冻、 冻过 程 中细胞 内形 成致 死冰 晶 ； 胚 解 防冻剂 的种 类 大致分 为低 分子量渗 透性防 冻剂 、 子量非渗透性 防冻 剂、 低分 大分子 物质 、 活性 物质 ； 胎冷冻 方法主要 有常规慢 速 冷冻 法、 生物 胚 玻璃 化 冷冻 法和 快速 冷冻 法； 解冻方法 主要介 绍了快速解 冻。［ 结论 ］ 胎冷 冻保存 技术 的应 用愈加 广 泛 ， 胚 将对 胚胎 生物 工程 和其他 生物技 术
维普资讯
安 徽 农业 科 学 ，ｏｒａ ｏ Ａ Ｊｉ ． ｉ２ｏ ，５３ ）１１７ １０ Ｊｕｎｌ ｆ ｎｌ Ａ Ｓ ． ７３ （４ ：１０ —１１９ １ Ｊ ｃ ｏ
责 任 编辑
陈 玉敏
责任 校 对
俞 洁
哺乳动物胚 胎冷 冻保存研 究进展
王军 ， ２吕 发 孙博 ， 文
奶牛胚胎冷冻保存技术研究
奶牛胚胎冷冻保存技术研究桑国俊(甘肃省畜牧兽医研究所,甘肃平凉 744000)摘 要:胚胎冷冻保存是胚胎移植过程中的一个重要技术环节,不仅保存了多余的鲜胚,更有利于随时随地地实施胚胎移植工作。
本试验对超排获得的胚胎用分步法和一步法进行冷冻、贮存和移植。
用分步法生产可用胚胎25枚,冻存24枚;用一步法生产可用胚胎56枚,冻存53枚。
分步法的移植受胎率达到50.00%,略高于一步法的47.17%,但差异不显著(P>0.05)。
一步法在保证移植效果的前提下,具有制作简单、易于标准化生产、应用非常方便的优点。
关键词:胚胎冷冻;一部法;胚胎移植[中图分类号] S814.8 [文献标识码] A [文章编号] 100426704(2009)022*******Reseach of freez i n g m ethods for bov i n e em bryosSang Guo-jun(A ni m al Science and Veterinary Institute of Gansu Province,Pingliang744000,China) Abstract:The paper had reported how t o freeze bovine e mbryos.Bovine embryos was been fr ozen by t w o methods which one was one-way p r ocedure and another was multi-way p r ocedure.There were53bovine embryos was been fr ozen by one-way p r ocedure and the e mbryotransfer p regnancy rate of those e mbryos been trans p lanted was47.17%after tha wing.Mean while24bovine e mbryos was been fr ozen by multi-way p r ocedure and p regnancy rate was50.00%.The p regnancy rate of multi-way p r ocedure was higher than one-way p r ocedure(P>0.05).It was suggested that one-way p r ocedure is available t o freeze and trans p lant bovine e mbryos because it was easy t o operate and de monstrate in p ractice and had the si m ilar effect with multi-way p r ocedure.Key words:Freezing bovine e mbryos;One-way p r ocedure;E mbryotransfer 胚胎冷冻保存是胚胎移植技术步入商业化阶段的关键技术。
《胚胎冷冻保存》课件
准化和规范化。
THANKS
02
胚胎冷冻保存技术
胚胎冷冻保存的方法
玻璃化冷冻
快速降温使胚胎进入玻璃化状态，减少冰晶形成。
程序化冷冻
慢速降温使胚胎逐渐结晶，适用于大多数胚胎类型。
显微操作
对胚胎进行显微操作，如显微切割或显微注射，以提高冷冻存活率。
冷冻保护剂的选择与使用
01
02
03
低温保护剂
选择适当的低温保护剂， 如二甲基亚砜（DMSO） 或乙二醇（EG），以保护 胚胎免受低温损伤。
技术挑战
04
胚胎冷冻保存过程中可能存在细胞损伤的风险 ，需要不断优化冷冻和解冻技术，提高胚胎存
活率。
胚胎科研中的冷冻保存
技术简介
胚胎科研中的冷冻保存 主要用于研究胚胎发育 的机制和过程，通过低 温生物学方法将胚胎在 液氮中长时间保存。
应用场景
主要应用于动物模型和 人类胚胎科研，为科研 人员提供实验材料和研
温度控制
严格控制冷冻和解冻过程 中的温度，以最大程度地 减少对胚胎的损伤。
冷冻保存的效果评估
存活率
遗传稳定性
解冻后评估胚胎的存活率，以确定冷 冻效果。
通过遗传学方法检测解冻后的胚胎是 否保持了正常的遗传物质。
发育能力
观察解冻后的胚胎是否能正常发育， 以评估其发育潜力。
03
胚胎冷冻保存的应用
辅助生殖技术中的胚胎冷冻保存
引入自动化和智能化技术，提高胚胎冷冻保存的效率和安全性。
胚胎冷冻保存技术的潜在应用领域
辅助生殖技术
为不孕不育夫妇提供冷冻保存胚 胎的服务，实现生育愿望。
动物繁殖
保护珍稀动物和濒危物种，通过 冷冻保存其胚胎实现种质资源的
猪胚胎冷冻保存的研究概况
Heilo ng jiang Journal o f Animal Reproductio n Vol.15No .22007收稿日期63作者简介：徐妲(8),女,在读硕士研究生。
我国地方猪品种丰富，这些地方品种对我国养猪业的发展起到了很大的作用，但由于外来猪和地方猪的杂交改良，造成原有品种数量的锐减和质量下降，保护我国珍贵的种质资源，对我国猪种种质资源的可持续性利用意义重大。
因此，有必要建立猪“胚胎库”。
猪的胚胎冷冻保存技术，相对其它动物来说进展一直较为缓慢，直到1989年才获得成功(-35℃)，至1990年常规液氮冷冻保存(-196℃)也相继成功。
1冷冻保护剂种类保护剂可分3类：1.1渗透性保护剂：这是一类能够通过细胞膜的富含羟基的小分子化合物，常用的渗透性保护剂有二甲基亚砜(DM SO)、乙二醇(EG)、甘油(G)、丙二醇(PG)、乙酰胺(AA)等。
1.2非渗透性保护剂：这是一类富含羟基的大分子化合物，可溶于水。
当不能渗入细胞时，其主要防止细胞外冰晶的形成。
常用的有聚蔗糖(F)、海藻糖、棉子糖以及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)[1]，白蛋白等大分子物质。
1.3抗冻蛋白(AFP)和热滞蛋白(THPs)：近几年来，出现了一种新型保护剂———AFP ，它是针对高浓度的保护剂对胚胎毒性作用较大这一问题而发现的。
AFP 能非连续地降低体液冰点，并通过吸附于冰晶的特殊表面有效地阻止和改变冰晶生长。
AFP 还能与细胞膜作用以保护膜的完整性。
AFP 和THPs 可与细胞膜相互作用，改善细胞膜的稳定性，在低温下保护胚胎不受损伤。
如果AFP 能成功地应用于玻璃化冷冻中，则可使胚胎冷冻保存技术更上一个新台阶。
冷冻保护液常用杜氏磷酸盐缓冲液(PBS)来配制，并且保持7.2～7.4的pH 值，也可用简单的生理盐水或T CM -199来配制。
2冷冻的基本操作程序2.1胚胎的采集鉴定猪胚胎冷冻保存过程中一个最主要的问题是猪胚胎的低温敏感性和高脂质性。
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哺乳动物胚胎冷冻保存综述09动物生物技术2班 200930380216 宋骥晨摘要：哺乳动物胚胎冷冻保存效果受冷冻保护剂、冷冻方法、解冻方法等多种因素影响, 其中冷冻方法是一个关键性因素。
目前胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两种。
常规慢速冷冻法是指利用甘油、乙二醇等做冷冻保护剂通过缓慢降温的方式进行胚胎冷冻; 玻璃化冷冻法是指利用高浓度的冷冻保护剂通过快速降温的方式进行胚胎冷冻。
与常规慢速冷冻法相比, 玻璃化冷冻法简化了操作过程, 大大缩短了操作时间, 不需昂贵的程序控制冷冻仪。
关键词：胚胎; 冷冻保存; 冷冻保护剂; 冷冻; 解冻胚胎冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序使胚胎在-196℃温度下停止代谢活动, 而升温后又不失去代谢能力的一种长期保存技术, 是实现动物胚胎生产技术实用化和商业化的重要保证。
1972年, whittingham等首先发明了慢速冷冻法, 成功地保存了小鼠胚胎, 并在解冻后移植产下了后代。
这种方法经过30多年的发展, 冷冻效果已基本稳定, 迄今为止, 已有多种动物胚胎经常规冷冻、解冻后移植至受体得到后代。
1.胚胎冷冻保存原理胚胎细胞是发育中的细胞, 细胞内水分含量达到80%以上, 如果不经保护, 冷冻时细胞内部就会形成冰晶, 破坏蛋白质的结构使其发生不可逆的变化, 从而导致胚胎死亡。
常规慢速冷冻法的原理是通过加入低浓度的防冻剂, 缓慢降温将胚胎内的水分在冻结前脱出, 阻止冷冻过程中形成有害冰晶而造成胚胎损伤。
将胚胎放到含有渗透性防冻剂的溶液中,防冻剂使胚胎细胞内的水分能够在-10℃以上不冻结并且能替换出部分水分。
随着降温的进行, 细胞外液开始形成冰晶, 细胞外液浓度变高, 由于渗透压的原理使细胞内的水分开始脱出。
为了保证细胞外液冰晶形成的时间总是早于细胞内液, 大多数冷冻程序采用植冰的方式来诱发细胞外液冰晶的生长, 植冰通常在-5℃到- 7℃进行。
缓慢降温使细胞内的水分有更多的时间在冻结前脱出。
需要指出的是, 胚胎在冷冻过程中不可避免地要形成冰晶。
关键是冰晶的大小和数量能否造成胚胎的损伤。
玻璃化冷冻保存的原理是在足够低的温度下或采用高浓度的防冻剂使冷冻过程中形成玻璃样物质减少细胞内外冰晶的形成。
总之, 无论采取何种冷冻方法, 胚胎冷冻保存的原理都是阻止冷冻、解冻过程中细胞内形成致死冰晶。
2.抗冻保护剂和冷冻保护液在哺乳动物的胚胎冷冻过程中, 冰晶的形成对胚胎的损伤是致命的。
-15℃~ -50℃是一个致死温度区, 在这个温度区细胞容易形成大的冰晶。
加入抗冻保护剂能避免冰晶的形成。
抗冻保护剂主要分为3类：（1）低分子质量可渗物质, 如甲醇、乙二醇、丙二醇、甘油等一些醇类; （2）低分子质量不可渗物质, 如葡萄糖、半乳糖、蔗糖等糖类; （3）高分子质量不可渗物质, 如聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉以及其他一些聚合物。
冷冻保护液常用杜氏磷酸盐缓冲液来配制, 并且保持ph 值为7.2~7.4也可用简单的生理盐水或TCM-199来配制。
这些低温保护剂以不同的方法来保护胚胎细胞免受冷冻损伤, 有效的低温保护剂可将各种低温保护剂有机结合起来。
3.冷冻方法自从1972年whittingham等首次采用慢速冷冻法成功地冷冻保存小鼠胚胎以来, 许多学者开始了对胚胎冷冻保存方法的研究, 研究的热点主要集中在提高冷冻保存胚胎的活力和简化冷冻程序上。
到目前为止, 胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法、玻璃化冷冻法。
3.1常规慢速冷冻尽管哺乳动物胚胎冷冻保存技术已经出现多年, 冷冻技术的研究也取得了很大的进步, 但是到目前为止, 常规慢速冷冻法仍然是哺乳动物胚胎冷冻保存的主要方法。
此方法选择较低浓度的渗透性冷冻保护剂, 采用缓慢降温和快速解冻的方法来冷冻保存胚胎。
常规慢速冷冻法可分为以下几个步骤（1）室温下胚胎置于冷冻液中5-10min, 使胚胎和冷冻液间达到平衡; （2）在-5℃到-9℃之间植冰; （3）以0.3℃-0.6℃/分的速度缓慢降温;(4)降温到-30℃到-40℃之间, 投入液氮中保存;（5）以250℃/分的速度快速解冻; （6）在培养或移植前, 室温下除去冷冻保护剂。
3.2玻璃化冷冻玻璃化冷冻保存是指通过冷冻过程中形成玻璃样物质来减少细胞内外冰晶的形成, 以保护胚胎的一种冷冻方法。
这种方法采用快速降温和高浓度的冷冻保护剂, 使冷冻过程中溶液变得十分黏稠和坚固, 不形成冰晶。
自从1985 年Rally 和Fahy 首次用玻璃化法冷冻小鼠胚胎获得成功, 玻璃化冷冻技术就成为学者们的研究热点。
目前,玻璃化冷冻技术不仅能成功地冷冻保存多种哺乳动物的胚胎,而且还能冷冻保存对低温敏感性高的卵母细胞。
影响胚胎玻璃化冷冻保存效果的两个关键因素是冷冻保护剂和冷冻速度。
只有最大冷冻速度和最低冷冻保护剂浓度之间达到平衡, 才能获得好的冷冻效果。
要在一定的冷冻速度下形成玻璃化状态,就需要高浓度的冷冻保护剂, 但是浓度过高的冷冻保护剂又会对胚胎产生毒害。
不同种冷冻保护剂形成玻璃化的能力和对胚胎的毒性也不一样。
因此寻找毒性低、形成玻璃化能力强的玻璃化冷冻液成为胚胎玻璃化冷冻研究的热点之一。
大量研究表明把不同种类的冷冻保护剂组合成玻璃化冷冻液, 能达到降低冷冻保护剂对胚胎毒害作用, 提高玻璃化冷冻效果的目的。
冷冻速度是形成玻璃化状态的另一个关键因素, 提高冷冻速度可以使玻璃化溶液中冷冻保护剂的浓度降低, 降低冷冻保护剂对胚胎的毒害作用。
起初, 胚胎的冷冻载体采用0. 25mL 或0. 5mL 的细管, 直接投入液氮中。
为提高胚胎的冷冻速度, 研究人员发明了许多非常具有创意的冷冻载体。
Vajta G 等( 1998 ) 发明了OPS 法,Lane M 等( 1999 ) 采用冷环法, Liebermann J 等( 2002) 发明FDP 法, Vanderzw almen P 等( 2003) 发明半管法, Son W Y 等( 2003) 采用电镜铜网法( electron microscopy copper grids) , Bagis H 等( 2005) 利用金属表面法( metal surface) , Niasar-i Naslaji( 2006) 采用电泳上样吸头法。
这些新型冷冻载体都极大的提高了冷冻速度, 不同程度地提高了玻璃化冷冻效果。
在这些研究中, Vajta 发明的OPS法最受欢迎。
OPS 法是通过将细管加热后拉长拉细, 使得管壁变薄, 细管体积变小来提高冷冻速度的, 其冷冻速度达20 000℃/ min 以上。
采用OPS法冷冻胚胎防止了冷冻损伤, 降低了冷冻保护剂的毒性和渗透性损伤。
目前, 多项研究表明OPS法的冷冻保存结果达到或超过了常规慢速冷冻法。
即使对采用常规慢速冷冻法不易成功冷冻保存的细胞或胚胎, 如卵母细胞、猪胚胎、体外受精胚胎、经过显微操作的胚胎等, OPS 法也取得了较好的效果。
4. 解冻方法解冻方法对胚胎的存活和进一步发育能力有很大的影响, 研究表明慢速解冻能够降低胚胎的存活率。
水浴解冻可以使温度变化速度为4460℃/min, 而在空气中解冻才不到196℃/min, 且这种解冻方法经常导致透明带破裂。
总之, 快速解冻对提高胚胎冷冻效果是非常有益的。
一般解冻时将细管在空气中或10℃到28℃停留10s,然后投入22℃到35℃间的水浴中10s到30s。
解冻后为了避免冷冻保护剂对胚胎产生毒害作用, 应立即将冷冻保护剂除去, 通常用蔗糖溶液将冷冻保护剂脱出。
目前,蔗糖的浓度还没有一致的共识,一般多用0.5mol/mL的蔗糖。
5. 结语随着其它生物技术的发展, 给胚胎冷冻技术的应用提供了新思路和新方法。
这对解决我国动物遗传资源急速衰减, 挽救濒危品种. 建立胚胎库和配子库, 提供了一个广阔的前景。
通过不断改进, 相信超低温冷冻保存技术将不仅仅适用于胚胎的保存.还会适用于其它细胞和组织结构, 特别是OPS 玻璃化冷冻法具有诸多优于其它冷冻方法的特点, 它将很可能成为超低温冷冻保存技术的首选方法之一。
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通过这篇文章，让我在课堂上学习到的相应知识得到了进一步的扩展和延伸，而胚胎冷冻方面的研究必然会在未来动物转基因领域占据更加重要的地位。