胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术共26页文档
人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识(2023年)版解读 PPT课件
操作步骤详解及注意事项
01
注意事项
02
严格遵循无菌操作规范，确保操作环境清洁。
03
选择合适的冷冻载体和平衡液，以提高冷冻效果。
操作步骤详解及注意事项
控制降温和解冻速率，避免细胞内冰 晶形成和渗透性损伤。
VS
对冷冻后的卵母细胞进行定期检测， 确保其质量和活性。
03
胚胎玻璃化冷冻技术及操作规范
胚胎来源及质量评估标准
考核方式
采用理论考试和实际操作考核相结合的方式 ，全面评估操作人员的技能水平。
持续改进
定期对操作人员进行培训和考核，不断提高 操作技能和水平。
质量监测指标设立及持续改进方案
监测指标
包括冷冻存活率、复苏率、受精 率等关键指标，以及实验室环境 、设备性能等质量相关指标。
数据统计与分析
定期对监测数据进行统计和分析 ，评估冷冻胚胎的质量和实验室 运行状况。
胚胎冷冻
在辅助生殖技术中，对多余胚胎进行玻璃化 冷冻，以备后续移植使用，提高妊娠率。
生育力保存项目中价值体现
要点一
年轻癌症患者生育力保存
要点二
高龄女性生育力保存
通过玻璃化冷冻技术保存卵母细胞或胚胎，为年轻癌症患 者提供生育希望。
针对高龄女性，通过冷冻卵母细胞实现生育力保存，延缓 生育年龄限制。
成功案例分享和经验总结
实验室自动化
03
提高操作效率和准确读
伦理和法规关注
对基因编辑和人工智能等技术的监管政策可能收 紧。
辅助生殖纳入医保
政策推动下，更多患者可能获得治疗机会。
商业化运作规范
政策法规对辅助生殖行业的商业化运作进行规范 。
持续改进方向和目标设定
提高冷冻效率和复苏率
冷冻卵子技术
冷冻卵子技术戴致远12307130175简介冷冻卵子，又称雪藏卵子，即取母体健康时的卵子冷冻，阻止卵子随人体衰老，待想生育时取出冷冻的卵子使用即可。
冷冻卵子的技术本身并不成熟，即使可以冷冻、复苏、形成受精卵，胚胎。
主要方式保存卵子有两种方式。
慢速冷冻法，即把卵子储存在脱水的溶液中，然后用电脑系统让它慢慢冷冻起来，最后封存在超冷的液化氮中。
[3]另一种是玻璃化冷冻法，即把卵子放进高浓度渗透液中，然后立即储存到液氮中。
冷冻卵子保存后，待想生育时取出冷冻的卵子，解冻后即可进行体外受精最终获得胚胎。
流程(原理)01试管婴儿登记、体检：我们国家的生殖中心只允许为做试管婴儿的妇女冷冻卵子，如果有多余的卵子，且夫妻双方都同意，也可以进行捐赠。
冷冻卵子之前需要进行相关的身体检查。
02打排卵针、取卵：如果要想取卵，首先要在促性腺激素促卵发育后，给女性打促卵泡成熟的针。
大约36小时后，医生会在B超引导下，经过阴道穿到卵巢内，把卵泡的卵泡液吸出来。
通过B超可以看到，一团透明的像水晶球一样的物质就是卵泡，卵泡中孕育着成熟的卵子。
取卵手术通常不超过10分钟。
03卵泡液送至实验室：医生把卵泡液吸出来至试管中，迅速通过窗口传递到实验室中的显微镜下。
冻卵的过程全部在实验室里进行操作。
卵子很娇气，怕光、怕冷、怕热，所以整个取卵过程，必须在暗环境下迅速完成。
04提取出卵母细胞：卵子细胞悬浮在卵泡液中，实验室的技术人员首先会在显微镜下，把卵泡液中的卵子细胞分离出来。
05卵子脱水：实验室的工作人员把卵子放进高度浓缩的脱水冷冻保护溶液中进行脱水。
06迅速放入有液氮的专用容器中：脱水后的卵子立即投入液氮中，此种方式称之为玻璃化冷冻。
07转移：此时的液氮容器无法永久保存，还需转移至液氮罐中。
08放入液氮罐中：卵子被转移至零下198℃的液氮罐中长期保存，每一份卵子都有相应的编号，便于日后使用。
09使用时进行复温：若干时间后，当妇女需要使用卵子时，专业技术人员从液化氮中取出卵子，复温，用溶液清除掉卵子所用的化学物质。
胚胎冷冻保存技术
胚胎冷冻保存技术摘要; 胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。
研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。
关键词：胚胎冷冻保存为便于长途运输和随时供移植使用，将那些６～７日龄已有２０～３０个细胞的新鲜活胚胎（或分割后的半胚胎、１／４胎）在－１９６℃的超低温下冷冻贮存就是胚胎冷冻保存技术。
这是在冷冻精子的技术基础上进一步发展起来的一项新技术。
目前用冷冻胚胎移植的成功率约为鲜胚胎的７０％～８０％，胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。
现有的胚胎冷冻保存方法有四种：一、常规冷冻法常规冷冻法：也叫慢速冷冻法、逐步降温法。
将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂(甘油或二甲亚枫(DMSO)等)浓度的三种冷冻液中(冷冻液浓度由低到高，最终浓度1．4M)，每种冷冻液中平衡5分钟，然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行冷冻。
冷冻速率先以1～3~C／分下降至-6～-7℃，在此温度诱发结晶，平衡10分钟，然后，以0．3℃／分的速率降温至-35～_38℃，之后投入液氮中保存。
胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每步5分钟，最后置入含20％血清的PBS保护液中洗涤3次，彻底脱除冷冻保护剂。
或者将解冻后的胚胎放入0．5M(或1．0M)的蔗糖溶液中平衡10分钟，再用上述PBS液洗涤3次。
二、一步冷冻法一步冷冻法：也叫一步细管法。
该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。
三、程序冷冻法程序冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水,经程序冷冻仪缓慢降温。
主要操作步骤包括:将细胞顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水,置入程序冷冻仪快速降温至-6℃植冰(人工诱导冰晶形成),然后程序冷冻仪缓慢降温至-30℃~-80℃后液氮贮存。
胚胎冷冻技术
人类胚胎冷冻的应用现状
到目前为止,超低温冷冻人的体外受精(IVF)胚 胎,在国内外均获得成功。 2004年,意大利学者应用ICSI对慢速冷冻卵母 细胞与冻融睾丸精子受精后再次冻存多余胚胎,解 冻胚胎移植后分娩一健康女婴,为世界首例。 北京大学第三医院生殖医学中心应用冷冻精 液中精子、冷冻卵母细胞、冷冻胚胎即“三冻” 技术,成功获得世界第2例、我国第1例“三冻”婴 儿。并在卵母细胞冷冻技术方而,采用了与世界首 例不同的简捷的玻璃化冷冻卵母细胞的方法。
另外,从理论上讲,冷冻胚胎可长期 保存,但对于保存过程中胚胎细胞是否 发生老化的问题还缺乏直接的实践证 据;对于冷冻效果鉴定,主要采用形态学 方法鉴定冻胚质量,对其移植后的发育 潜力无法判断。
• 在多种冷冻方法中,现较多采用慢速冷 冻、快速溶解方法,但是其他方法也有 其自身优点。因此,在实验中应综合考 虑多方面因素,根据具体的胚胎情况选 择恰当的方法。
胚胎冷冻技术
发展历史
• 胚胎冷冻保存的研究起始于20世纪50年代， 当时Smith用甘油坐防冻剂，保存兔胚胎获 得成功。
• 1971年Whittingham用慢速冷冻方法获得小 鼠胚胎的成功保存。 • 1978年willadsen建立了快速冷冻方法。 1984年Takeda等采用一步冷冻方法首次冷 冻小鼠胚胎获得成功。
临床应用
应充分重视高浓度玻璃化冷冻溶液对胚 胎的毒性作用,合理选择玻璃化冷冻溶液,严 格控制胚胎和玻璃化冷冻溶液接触的总时间。 目前较简单的玻璃化溶液的组成是25%甘油、 25%PROH或25%乙二醇。 玻璃化冷冻技术正处于实验研究到临 床应用的过渡阶段,随着玻璃化冷冻方法的 逐渐成熟,有望成为程序冷冻方法外的另一 种选择。
医疗应用
• 若有剩余的质量较好的胚胎，可以冷冻保存，待 以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内， 将增加受孕的机会。 • 可用于一个超排卵周期得到的胚胎数量多，质量 好，不能一次全部移植，可将多余的胚胎冷冻保 存。 • 以及发生严重卵巢过度刺激综合征的患者，不宜 在治疗周期移植胚胎者，可将胚胎冷冻，待以后 的自然周期或人工周期进行胚胎复苏移植。
卵母细胞的冷冻技术
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。 渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻 后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细 胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成 熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去 除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
动物繁殖基础课程教学大纲
动物繁殖基础课程教学大纲第一部分大纲说明一、本课程的性质和任务本课程是中央广播电视大学“一村一名大学生计划”高等专科养殖类各专业的专业基础课。
其主要任务是使学生通过对本课程的学习，掌握畜禽生殖生理的基础理论知识、主要繁殖技术及其繁殖管理方法，为专业课的学习打下基础。
二、本课程的教学基本要求繁殖是动物生产过程中的关键环节。
现代繁殖技术是提高畜禽繁殖力的主要手段，也是改进畜禽品质、提高其生产性能的必要措施，是增加畜牧业生产经济效益的重要途径。
此外，繁殖控制技术的进展和应用也为现代集约化畜牧业解决了一系列生产组织、计划管理方面的问题。
作为研究畜禽繁殖的学科，动物繁殖基础主要内容包括生殖激素、公母畜的生殖生理、人工授精技术、受精、妊娠与分娩、繁殖控制技术与胚胎工程、繁殖力等内容。
教学基本要求包括掌握畜禽生殖生理的普遍规律及其种属特征，掌握和运用这些规律指导畜禽的繁殖实践；了解现代繁殖技术的理论基础和操作技术及其繁殖管理方法。
三、本课程的教学方法和教学形式由于本课程是一门紧密联系生产实际的学科，理论和实践技能都不能偏废。
学习过程中应以文字教材为基础，掌握动物繁殖学中的基本概念和基本理论；结合观看录像教材（电视课），以进一步了解、掌握现代繁殖技术的操作和要求。
在实验和教学实习中多观察、多了解，并通过实际操作掌握主要的繁殖技术操作。
四、课程教学要求的层次本课程按“了解”、“掌握”、“重点掌握”三个层次对学生的学习进行要求。
考核难度及题量的梯度对应于教学要求的三个层次，未作具体要求的教学内容不作考核要求。
五、学时分配本课程总学时为90学时，5学分，其中录像教材（电视课）17学时，课程学习指导录像课2学时，实验课15学时，另安排一周教学实习，具体学时分配如下：章次教学内容总学时分配录像教材（电视课）学时分配绪论1学时0.5学时第一章家畜的生殖器官3学时0学时第二章生殖激素4学时1学时第三章母畜生殖生理6学时 2.5学时第四章公畜生殖生理6学时 2.5学时第五章人工授精技术6学时2学时第六章受精、妊娠与分娩8学时4学时第七章繁殖控制技术与胚胎工程8学时 3.5学时第八章繁殖力3学时1学时实验与实习45学时课程学习指导2学时合计90学时18学时第二部分教学内容和教学要求绪论(1学时)●教学内容动物繁殖的目的、任务和要求，同其它学科的关系，动物繁殖科学进展概况。
卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻方法
卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法用途：本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。
安全解冻配套：1.1瓶4ml解冻液（TS）2.1瓶1.5ml稀释液(DS)3.1瓶1.5ml 冲洗液(WS)4.1个25mm 的培养皿(用于解冻液)5.1个6孔生殖板使用说明准备：*用载体和生殖板将解冻液放到37℃的培养箱里加温—将所有解冻液倒入生殖板里。
*用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。
注意：用巴斯德管吸取一个大小合适的卵母细胞（直径：140um）或者胚胎(直径：140-180um)解冻：1.迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。
（图一）2.用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入DS底部，浸泡3分钟。
（图二）3.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS1 底部，浸泡5分钟。
（图三）4.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS2 顶部，当卵母细胞（胚胎）自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。
（图四）5.将卵母细胞（胚胎）转移到装有合适培养液的培养皿中。
放进37℃的培养箱中完成恢复。
注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎则要3小时。
质量控制测试：每一批安全解冻配套都得到以下测试：*溶液：UPS不孕不育无菌测试（SAL 10-3）LAL拉尔内毒素测试小老鼠胚胎试验（一个细胞）保存方法：*保存于4-8℃*在标签所示有效日期前，本品性质稳定。
成分：*血清替代补充*基本培养基M-199 内含的HEPES*蔗糖参考文件（此部分请看原件）.玻璃化第一部分：所需材料*玻璃化配套No.0 基础液（BS）：1.5ml x1 (只用于卵母细胞玻璃化冷冻)No.1 稀释液（ES）: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液（VS）: 1.5ml x2*冷冻管x4, 建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎*复制板x2: 6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管（型号：MT-150）*显微镜（关掉加热板）*秒表或计算器（带计算功能）*液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤）*镊子*显微针x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。
第五章动物卵母细胞与胚胎冷冻保存技术
2、细胞外冰晶损伤
慢速冷冻时，冰晶首先在细胞外形成。细胞外 液冰晶形成后，使得溶液中离子浓度的升高， 对细胞产生了离子影响，此损伤又称盐损伤。
随着更多冰晶的产生，使溶液逐渐浓缩，溶液 的浓缩对细胞的影响越来越大，此现象被称为 溶液效应又称为化学损伤。
冷却的速度越慢，则浓度越高，对卵母细胞的 作用时间也越长，对卵母细胞膜蛋白复合体造 成的伤害也越大。这主要是由于细胞内外的电 解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏 和核膜的降解。
单细胞，胚胎为多细胞，受精卵随第二极体 的排出，新陈代谢逐步加强）母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存， 由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因而 冷冻保存的难度较大。
在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤， 主要包括在以下几个方面：
快速冷冻时，由于降温速率快，结晶时的冰晶 核较多，从而形成数目多且体积小的冰晶，对 细胞造成的损害较小。
如果解冻时采取快速复温，则细胞仍能存活 ，但若在解冻过程中，在温度较高的区域（ 如-40℃或更高）经历较长时间或进行慢速复 温，则会产生重结晶现象，即细胞内小冰晶 重结晶成大冰晶，从而机械性的破坏细胞的 超微结构而造成细胞的致命损伤。
目前，欧、美、日、加等国有上百家胚胎移植公 司从事牛羊胚胎移植业务。
在国内，牛的冷冻胚胎生产与移植已开始逐步商 业化。
第二节 胚胎与卵母细胞的冷冻保存原理
胚胎与精子细胞结构差异： 胚胎数量极少 胚胎体积比精子大很多(精子为9um,卵子直径为
120um),细胞质多,外包特殊膜—透明带。 胚胎结构结构和新陈代谢过程更为复杂（精子为
1998年，Vajita等首次采用OPS法冷冻牛卵母 细胞取得了成功，体外受精后囊胚发育率达 11％～25％。