下呼吸道分泌物中细菌的分离与鉴定
痰和呼吸道分泌物标本采集规范
痰和呼吸道分泌物标本采集规范一、微生物学【概述】痰标本采集方便，无创伤性，临床应用广泛，对病原学诊断具有重要价值。
痰标本的正确采集、处理是临床细菌检验成功的关键，标本采集与处理的规范化是准确、及时向临床提供重要的感染信息的基础。
目前咳痰标本仍是最常用、最简单的采样方法，必须指导或辅助患者深咳痰，及时送检，并通过镜检筛选合格标本。
损伤性采样技术仅在选择病例(抗生素治疗反应不佳；可疑特殊病原体感染，如寄生虫、痰菌阴性肺结核、混合感染或二重感染等)使用。
【操作方法】1、咳痰标本采集要求患者在清晨用药前留取，因为晨痰量多，且含菌量也多。
留取前刷牙，用清水漱口3次，以除去口腔内大部分杂菌，之后用力咳痰。
咳痰较困难者可用3％～5％氯化钠溶液雾化蒸气吸入进行导痰；对咳嗽乏力或昏迷患者，可用普通吸痰管经鼻腔或口腔吸引下呼吸道分泌物；对不能咳痰的婴幼儿或病重患者，如须采集痰标本做结核杆菌培养，可插胃管抽吸胃液标本送检，也可留取12～24h痰液，经漂浮浓集后检查，以提高结核杆菌检出率。
若做细菌或真菌培养，痰液必须盛于无菌容器内送检。
观察痰量应留取24h痰液，必要时在容器内加入少许防腐剂。
2、咽拭子采样上呼吸道感染可通过咽拭子获取标本。
标本采集前数小时内不得用消毒药物漱口或涂抹病灶局部。
用咽拭子采集标本时应小心、认真、准确，避免触及舌、口腔黏膜和唾液，以防污染。
如咽拭子标本发现致病菌，如肺炎链球菌、流感杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等，且数量较多时，提示有该菌所致感染存在。
3、纤维支气管镜抽吸采样以利多卡因做咽喉部局部麻醉后，插入纤维支气管镜(纤支镜)，达到肺炎病灶引流支气管内，纤支镜吸引口依次连接标本采集瓶或试管及负压吸引装置，用负压将下呼吸道分泌物经纤支镜吸人标本采集瓶内送检。
气管切开或气管插管患者也可用普通无菌吸痰管直接经人工气道插至大约叶支气管水平，接负压装置将痰液经吸痰管吸入标本采集瓶内。
纤支镜直视下可准确采集病灶部位的分泌物，但插入时纤支镜顶端和内孔常受咽喉部正常菌群污染，所以纤支镜吸引物常规培养结果不能完全代表肺部感染的病原体。
临床细菌培养鉴定流程及报告.介绍
3．分离培养 ⑴一般培养: 用定量接种环或无菌微量 加样器取尿液0.001ml或0.01ml(已使用 抗生素患者),接种于血平板和麦康凯/中 国兰平板,不能定量时需用倾碟法记数， 35～37℃培养18～24小时。 (2)特殊培养: 对临床要求真菌、淋病奈 瑟菌及结核菌等培养者，根据细菌所需 条件接种相应特殊培养基，放臵相应条 件下进行培养。
(三 ) 尿 尿路感染是指尿道内有大量微生物繁殖 而引起的尿路炎症。从肾脏排泌出来的 尿液正常情况下是无菌的，如果在尿液 中分离出细菌（排除污染因素）即为菌 尿，同时伴有感染症状者称为尿路感染。 根据感染部位可分为上尿路感染（肾盂 肾炎）及下尿路感染（膀胱炎），男性 还可出现前列腺炎。
1.尿中常见分离菌
⑵采血时间及采血量 采血培养应该尽量在使
用抗菌药之前进行，在24小时内采集2～3份血
培养（一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视
为单份血培养）。对间歇性寒战或发热应在寒 战或体温高峰到来之前0.5～1小时，采集血液， 或于寒战或发热后1小时进行。成人采血量8～ 10ml，儿童1～5ml。血液和肉汤之比1：5 ～1：
(2)标本采集 a.清洁中段尿 最好是晨尿，是临床上 最常留取尿标本的方法 b.耻骨上膀胱穿刺法 是评估膀胱内细 菌感染的“金标准” c.直接导尿法 d.小儿收集包 e.留臵导尿
(3)标本运送 标本采集后应及时送检， 2小时内进行接种，否则应臵4～8℃冰箱 保存，冷藏保存标本时间不得超过8小时。
(2)报告方式 初步报告：在分离出细菌后，进行革兰 氏染色，作出初步报告。 最终报告：有意义的阳性结果报告，应 报告菌落计数、细菌种名及药敏结果。 无意义的阳性结果报告，报告菌落 数、革兰氏染色形态特征，并注明是纯 培养或是混合菌生长。 阴性结果报告:应报告无菌生长和菌落计 数＜1000cfu/ml或 ＜100cfu/ml尿。
痰液及下呼吸道分泌物培养简易操作规程
、痰液及下呼吸道分泌物培养标准操作流程1 观察标本合格后操作。
一般为晨痰，再留取痰之前刷牙、反复漱口，应从气管深部咳出痰，吐进无菌容器内送检。
涂片白细胞小于10，上皮细胞大于25为不合格痰，相反白细胞大于25，上皮细胞小于10-25为合格痰标本。
2 点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。
3 接种环灭菌—待冷却后—取痰液—接种到血平板、中国兰平板（或麦康凯平板上）。
平板划线分离培养：（1）用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线，在第二三区依次用接种环划线。
（2）每划一区域应将接种环烧灼一次，冷却后再划下一区域，每一区域得划线应接触上一区域得接种线2-3次使菌量逐渐减少以形成单个菌落。
（3）划线完毕将平板加盖倒置（琼脂平板得底部向上）于35°C培养18-24小时。
4观察菌落特征涂片染色，确定阳性菌、阴性菌、球菌还就是杆菌后鉴定种属。
5 做药敏试验-------报告结果。
便培养标准操作流程1、收取有粘液或脓血、稀水粪便标本。
2、点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。
3、接种环灭菌—待冷却后—取粪便—接种到血平板、SS平板、中国兰平板（或麦康凯平板上）。
平板划线分离培养：（1）用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线，在第二三区依次用接种环划线。
（2）每划一区域应将接种环烧灼一次，冷却后再划下一区域，每一区域得划线应接触上一区域得接种线2-3次使菌量逐渐减少以形成单个菌落。
（3）划线完毕将平板加盖倒置（琼脂平板得底部向上）于35°C培养。
4培养18-24小时后观察菌落特征涂片染色，确定阳性菌、阴性菌、球菌还就是杆菌后鉴定种属。
5 做药敏试验-------报告结果。
尿培养标准操作流程1 收取晨尿第一泡清洁中段尿。
（把外阴用肥皂清洗一遍，再用清水清洗两遍，待干或用干净布擦干）用导尿管得病号需新换导尿管后取标本2 点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。
3 接种环灭菌—待冷却后将标本混匀，用定量接种环取尿液1ul(大约一接种环）—接种到血平板，接种环灭菌---待冷后取标本接种到中国兰平板（或麦康凯平板上）。
细菌标本采集规范
临床微生物学标本采取和处理的规范化要求正确的采取、处理与运送用于细菌培养的标本是临床细菌检验成功的关键.标本采取与处理的规范化是准确、及时地向临床提供重要的临床感染信息的基础；而标本采取与处理不当将严重影响检验结果,给临床以误导，延误对患者的正确治疗。
为此，我们提出初步的参考意见，并希望在实践中不断完善。
一、血液细菌培养标本的采集和处理临床上疑为败血症、脓毒血症或其他血液感染的患者,需做血液细菌培养以明确病原。
1．采集方法:静脉采血，以无菌操作方法抽取血液后,直接注入血培养瓶中，轻轻颠倒混匀，以防血液凝固.如果同时作需氧和厌氧培养，应先将标本接种到厌氧瓶中,再注入需氧瓶，严格防止将空气注入厌氧瓶中。
2。
采血时间以及血培养份数:在患者发热期间越早越好,最好在抗菌治疗前，用药前24小时内采集2～3次血液标本,可使细菌检出率高达99％.对间歇性寒战或发热的患者,应在寒战或体温高峰到来之前0。
5～1小时采血，亦可在寒战或发热后1小时采集血液标本。
特殊感染患者采血培养时应遵循以下原则：（1）可疑急性发热性菌血症、败血症患者：应在使用抗菌药物之前，在24小时内从不同部位采集2~3份血液标本培养.(2)可疑细菌性心内膜炎患者、感染性心内膜炎患者：在1～2小时内采集3份血标本培养,如果24小时后阴性,再采集两份血标本培养。
(3）不明原因发热患者：先采集2～3份血标本，抽血间隔60 min，24~36小时后体温升高之前，再采集2份血标本进行培养。
因为1次血培养不足以说明问题,可能会遗漏阳性结果。
（4）可疑菌血症但血培养持续阴性时;应改变血培养方法,以获得罕见或苛养的微生物。
（5）在急性发热性疾病如脑膜炎、细菌性肺炎,需马上做抗菌治疗;或急性骨髓炎、化脓性关节炎等要紧急手术的患者,应立即从两臂分别取2份标本.3。
采血部位:采血部位通常为肘静脉。
疑为亚急性心内膜炎的患者，以肘动脉或股动脉采血为宜。
疑为细菌性骨髓炎或伤寒患者，在病灶或髂前（后）上棘处严格消毒后抽取骨髓。
细菌分离鉴定（完整版）
细菌分离鉴定细菌分离鉴定[细菌分离鉴定]细菌分离鉴定目的要求：熟悉临床标本中常见的病原性细菌的分离鉴定方法，细菌分离鉴定。
实验内容：一、脓汁、咽拭子等标本中病原性细菌的分离与鉴定(一)标本采集1.脓拭子：用无菌棉签蘸取患处深部脓液或分泌物少许，置入无菌空试管内，送检。
2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用无菌棉签挑取脓稠痰块，置入无菌空试管内，送检。
3.咽拭子：嘱病人把口张大，用压舌板压住舌根，用无菌棉签迅速蘸取咽部分泌物，置入无菌空试管内，送检。
4.血标本：疑为败血症患者，在严格无菌操作下，静脉采血，床旁直接加入含50ml的肉汤瓶内，立即摇匀后送培养。
5.脑脊液：对疑似流脑患者，作腰椎穿刺取脑脊液，立即行直接床旁接种(送检过程中应注意保温)。
6.尿道、阴-道分泌物：对可疑淋病患者，男性可从尿道取材，取材时导尿管应进入尿道1cm～2cm，如为刚排尿，应等待1h左右;女性则可以从宫颈口取分泌物，当内窥器插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转取出，取材应立即送检，不可放置冰箱。
(二)分离鉴定程序待检标本可直接做涂片染色检查鉴定，必要时可做分离培养、生化反应及致病性鉴定。
常见的致病性球菌检查程序如下。
直接涂片、革兰染色、镜检(形态、排列、染色性)脓、痰、咽拭子分泌物、脑脊液观察菌落性状、溶血性、色素血琼脂平板→涂片、染色、镜检↑挑取可疑菌落生化反应血液、穿刺液→肉汤培养基纯分离致病性测定↓药敏试验如培养液混浊时可涂片、染色、镜检(三)常见临床标本的检查方法1．脓拭子在脓汁中除了球菌外，也有杆菌存在，例如革兰阳性的有炭疽杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、枯草杆菌等，革兰阴性的有大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等，此外尚可有真菌、放线菌、螺旋体等。
材料(1) 标本：脓拭子(2) 培养基：血琼脂平板(3) 兔血浆、白色滤纸片、无菌生理盐水、载玻片方法脓汁→革兰染色→镜检↓↑血琼脂平板→观察菌落形态及溶血情况↓致病力试验(1)将脓拭子作革兰染色，镜检(先作培养再涂片以免污染)，鉴定材料《细菌分离鉴定》()。
2024年高级卫生专业技术资格考试微生物检验技术(094)(正高级)试卷及答案指导
2024年高级卫生专业技术资格考试微生物检验技术(094)(正高级)模拟试卷(答案在后面)一、多项选择题（本大题有30小题，每小题1分，共30分）1、以下哪些属于微生物检验技术的基本步骤？（）A. 样品采集与处理B. 微生物分离纯化C. 微生物鉴定D. 药物敏感试验E. 报告撰写2、在微生物分离纯化的过程中，以下哪种方法常用于分离革兰氏阳性菌？（）A. 霍夫曼平板法B. 沙氏平板法C. 肉汤培养法D. 培养基稀释法E. 稀释涂布平板法3、下列关于细菌培养基的选择与配制的说法正确的是：A. 所有细菌的培养都使用相同的培养基B. 选择培养基时需要考虑目标菌株的营养需求和生长条件C. 培养基配制完成后无需灭菌即可使用D. 鉴定肠道致病菌常用SS琼脂作为选择性培养基E. 血平板常用于初次分离培养细菌4、关于抗生素敏感性试验，以下叙述正确的是：A. 抗生素敏感性试验仅对革兰氏阳性菌有意义B. MIC（最小抑菌浓度）法可以定量测定细菌对抗生素的敏感度C. 纸片扩散法适用于所有临床分离菌株的药敏测试D. 抗生素敏感性试验的结果可以直接指导临床用药E. 在进行药敏试验前，必须确保菌悬液浓度符合标准5、下列关于细菌形态学的描述中，正确的是（）A. 革兰氏染色法可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌B. 细菌的形态学观察主要用于细菌的鉴定C. 细菌的形态学观察包括细菌的大小、形状、排列等D. 细菌的形态学观察可以用于判断细菌的致病性6、以下关于细菌生理学的描述中，错误的是（）A. 细菌的生长繁殖需要营养物质、水分、适宜的温度和pH值B. 细菌的新陈代谢包括同化作用和异化作用C. 细菌的同化作用包括自养和异养D. 细菌的异化作用包括光合作用和化能作用7、关于细菌L型的描述，下列哪些是正确的？A. 细菌L型是指在某些条件下细菌细胞壁缺陷而形成的形态B. L型细菌可以通过常规培养基生长C. 它们通常在高渗透压培养基上生长D. L型细菌对青霉素类抗生素敏感E. 由于细胞壁的缺失，L型细菌可以在不利环境下存活8、关于真菌的基本特征，以下哪几项说法是准确的？A. 真菌属于原核生物界B. 大多数真菌通过产生孢子的方式繁殖C. 酵母菌是一种单细胞形式的真菌D. 所有真菌都是多细胞有机体E. 真菌能够进行光合作用9、以下哪些微生物属于革兰氏阴性菌？A. 肠杆菌属（如大肠杆菌）B. 铜绿假单胞菌C. 链球菌属（如肺炎链球菌）D. 霍乱弧菌 10、以下哪些指标可以用来判断细菌的耐药性？A. 最小抑菌浓度（MIC）B. 敏感性试验结果C. 药物敏感度指数D. 耐药基因检测11、下列关于细菌的细胞壁成分及其功能的说法，哪几项是正确的？A. 肽聚糖是所有细菌细胞壁的主要成分。
呼吸道标本细菌学检验操作规程SOP
呼吸道标本细菌学检验操作规程（一）目的：规范呼吸道标本细菌学检验,确保检验结果准确可靠。
（二）适用范围及操作人员：呼吸道标本培养和涂片检检查；检验科工作人员。
（三）支持性文件：《WST805-2022临床微生物检验基本技术标准》、《下呼吸道感染细菌培养操作指南》、《全国临床检验操作规程》。
（四）标本类型：痰、咽拭、支气管肺泡灌洗吸出液、支气管冲洗液或刷子、肺穿刺液等。
（五）标本采集时间：尽量在抗生素使用前采集。
（六）标本采集方法:1、咳痰：适用于肺部感染患者,特别是重病监护室(ICU)及住院的社区获得性肺炎(CAP)、慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)、肺脓肿(咳痰非最适标本)、可疑细菌性病原体引起的肺部感染患者。
咳痰前,患者用无菌生理盐水漱口;指导患者咳出深部痰,勿留取唾液和鼻咽腔分泌物。
2、气管吸出物：仅当气管插管的患者出现肺炎症状时(如发热或浸润),可采集气管吸出物标本。
从气管中吸痰，用无菌容器留取送检。
3、支气管肺泡灌洗液：利用纤维支气管镜向小支气管和肺泡中注入无菌生理盐水灌洗,在40mL～80mL回收的灌洗液中包含约1mL支气管末梢和肺泡中的分泌物;弃去前段可能污染的部分,收集其余部分后立即送检。
4、保护毛刷标本：将纤维支气管镜插入亚段支气管可疑感染部位,经支气管镜刷检孔推出双层套管中的毛刷(远端填塞聚乙二醇),刷取脓性分泌物,采样后将毛刷回收入双层套管并退出纤维支气管镜,用无菌剪刀剪断毛刷,置于含lmL生理盐水的无菌容器中(仅供需氧培养),快速送检。
5、气管穿刺法在环甲膜下穿刺抽取痰液，收集标本，适用于厌氧菌培养。
6、棉拭采集法用无菌棉拭子轻轻擦拭病人鼻咽部黏膜，留取标本，置无菌试管内送检。
（七）标本拒收标准：1、申请单姓名、科别、床号与标本的标签不符。
2、痰标本呈水样或唾液样。
3、痰涂片白细胞<10／低倍视野，上皮细胞>25／低倍视野。
4、标本容器溢漏，无瓶盖。
5、痰标本留取放置时间太长，超过2小时。
下呼吸道感染细菌培养操作规范
4.5质量控制 4.5.1革兰染色 4.5.2抗酸染色 4.5.3培养基 4.5.4试剂 4.5.4.1每批号、每周需做质控的试剂 4.5.4.2每批号、每次试验需做质控的试剂
3
5.1革兰染色报告 5.1.1痰标本报告原则（见表1） “痰/气管吸出物标本涂片革兰染色结果解释” 5.1.2 BAL细胞离心涂片报告
1
内容
1.口咽部定植菌群变化对肺部感染的重要影响
肺部感染的影响因素 (定植菌变化：健康人G+
免疫、基础病/住院、用抗菌药物 G-b )
2.肺部感染的常见机制
主要机制：吸入定植菌；吸入气溶胶；血播性； 附录A:“下呼吸道感染的主要类型及主要病原菌”
3.痰涂片对下呼吸道感染病原菌诊断的重要作用
痰培养：敏感性低 / 培养+ 涂片：提高特异性和敏感性
4.支气管纤维镜标本定量培养的临床意义
特异性82%～91%，诊断价值远高于痰标本； 附录B :“适合诊断的病原及检验项目”
5.下呼吸道感染细菌培养的局限性
培养结果假阴性、假阳性的原因
汇总表 汇总表
2014/5/9
针对医疗机构微生物实验室 针对痰 (细菌) 培养项目：
常规细菌培养方法检测下呼吸道感染病原菌的检验流程 本规范的特色： （1）明确下呼吸道标本适合诊断的病原和检验项目； （2）要求细菌培养项目需同时做革兰染色涂片； （3）规范痰培养/气管吸出物的定性培养程序、气管镜采集标本的定
3.1 标本采集 3.1.1 咳痰 3.1.2 气管吸出物
注：仅当出现肺炎的临床表现（如发热或浸润）时采集气管吸出物标本， 否则勿培养气管吸出物，因气管在插管24h后即有定植菌，培养结果 可能与疾病不符。
3.1.3 血培养 注：当下呼吸道感染患者伴有高热症状时，送检血培养（具体参考血培养
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ＳＤＡ平板，以直径３ ｌｎｍ的
无菌钻孔器在平板四周打４个孑Ｌ，分别加入１００％ 吐温４０、吐温６０、吐温８０，３５℃培养３ ｄ后观察生 长情况。（２）点种法［Ｉ训：配制０．５麦氏浓度待检菌 液，吸取菌悬液５出分别滴加于含２％吐温２０的 ＳＤＡ培养基上，３５℃培养５ ｄ，记录结果，明显生长 为阳性，不生长为阴性。 ７．七叶苷分解试验：将待检菌接种于七叶苷琼 脂斜面培养基上，并在斜面上滴ｌ滴橄榄油，３５℃ 培养３ ｄ，观察培养基的颜色变化。培养基斜面变黑 者为阳性，不变色为阴性。 ８．过氧化氢试验：滴加ＩＤ－ＡＳＥ触酶试剂ｌ滴 于吐温一科玛嘉平板上的待检菌菌落上，立即观察，
９７９５由上海华山医院抗生素研究所胡付品博
士馈赠。
２．试剂与仪器：科玛嘉念珠菌显色培养基
（ＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｃａｎｄｉｄａ）为法国柯玛嘉产品，沙保弱
琼脂（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ
ｄｅｘｔｒｏｓｅ
ａｇａｒ，ＳＤＡ）购自北京陆桥
技术有限责任公司。糠秕马拉色菌分离培养基（筛 选平板）为加１％吐温６０的科玛嘉念珠菌显色培养 基（吐温．科玛嘉平板）。４％蓖麻油的ＳＤＡ平板，加
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ知咖ｒ ｂｙ
Ｐａｒｋｅｒ ｉｎｋ ｓｔａｉｎｉｎｇ．ｎＩｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ａｎｄ
ｃｕｌｔｍ刮ｏｎ
ＣＨＲＯＭａｇａｒ ｍｅｄｉｕｍｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌ％Ｔｗｅｅｎ ６０（ｗｈｉｃｈ ｗａＥ，ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ
ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｐｕｒｅ ｃｏｌｏｎｉｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｇｒｏｗｔｈ ｏｎ Ｓａｂｏｕｒａｕｄ ａｇａｒ ｐｌａｔｅｓ，Ｔｗｅｅｎ ｔｅｓｔ，ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｎｇ Ｅｓｃａｌｉｎ，Ｃ８ｔａｌ鹤ｅ ｔｅｓｔ，Ｔｗｅｅｎ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｃａｓｔｏｒ Ｔｈｅ ｏｉｌ ｔｅｓｔ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｌ ８ｓ ｒＲＮＡｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ ｆｒｏｍ ｌｏｗｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ ｗａｓ ４７．４％（６３／１３３）ａｎｄ ６３ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍａｔｈｏｄｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ １８ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｃａｎ ｂｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｓｍｅｓＡ＂
马拉色菌为一种嗜脂性酵母，属人体皮肤正常 的菌群，也是一种条件致病真菌。到２０世纪９０年 代中期，有学者基于形态学、超微结构、生理生化特
万方数据
史堡焦熊医堂盘查垫１２生！旦箜翌鲞箜！翅垦竖璺』！些堕鲤，叁坚塾垫！兰：！丛篁：墨垒墨 征以及分子生物学的研究，将马抟色菌分为厚皮马
拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ）、合轴马拉色菌
Ｈｏ鸭－ｔＯＯ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅ日堍Ｈｏｓｐｉｔａｌ
ｏｆ ｔｈｅ
Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｉｊｉｎｇ
ｉ００７３０．Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ｃＨＥＮ Ｄｏｎｇ－ｋｅ．Ｅｍａｉｌ Ｉｖ—ｄ－ｋ＠２６３．ｎｅｔ
Ｆｒｏｍ Ｍａｒｃｈ ２０１０
１３３ ｌｏｗｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅ托ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ｔｈｅ
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１ １， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ
・７ｌｌ・
．论著．
下呼吸道分泌物中糠秕马拉色菌的
分离与鉴定
陈东科许宏涛
【摘要】 目的对痰涂片镜检可疑为马拉色菌的标本进行马拉色菌的分离培养，并对分离菌株
进行系统鉴定。方法收集２０１０年３月至２０１ １年９月卫生部北京医院经派克墨水染色镜检可疑为 马拉色菌的下呼吸道分泌物标本１３３份，接种于含ｌ％吐温６０的科玛嘉琼脂培养基（即改良念珠菌 显色培养基），于３５℃大气环境中培养。挑取疑似菌落在含０．５％吐温４０和０．５％吐温印的沙保弱 平板上进行纯培养。采用传统的表型鉴定方法对分离菌株进行鉴定，包括染色镜检观察菌体形态及 染色性、沙保弱培养基生长试验、吐温试验、七叶苷分解试验、过氧化氢试验、吐温沉淀试验和蓖麻油 试验，可疑菌株采用１８ｓ ｒＲＮＡ基因序列分析方法对分离菌株进行菌种鉴定。结果镜检可疑的下呼 吸道分泌物中马拉色菌分离率为４７．４％（６３／１３３），６３株分离菌经传统的表型鉴定方法结合１８ｓ ｒＲＮＡ基因序列分析方法均鉴定为糠秕马拉色菌。标本直接涂片，用派克墨水染色镜下可明显区分 马拉色菌和念珠菌。结论糠秕马拉色菌在改良念珠菌显色培养基上的菌落呈粉红色，可明显区别 于其他念珠菌菌落，用改良念珠菌显色培养基可提高下呼吸道分泌物中糠秕马拉色菌的分离率。传
品。橄榄油为西班牙亿芭利橄榄油公司产品。
二、方法 １．标本筛选：痰标本经革兰染色、镜检，发现有
７个种…。近年来，随着分子生物学研究的进展尤其 是核糖体ＤＮＡ测序和随机扩增多态性分析在真菌 分型上的应用，又有皮肤马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
ｄｅｒｍａｔｉｓ）江１、马属马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｅｑｕｉ）Ｈ Ｊ、同 本马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、大和马拉色菌 （Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｙａｍａｔｏｅｎｓｉｓ）¨Ｊ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｎａｌ２ｚｚ［ｓｊ及
（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ）、糠秕马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
面培养基均购自杭州天和微生物试剂有限公司。触
酶试剂ＩＤ—ＡＳＥ、革兰染色液购自法国生物梅里埃公 司。派克标准墨水（Ｂｌｕｅ－Ｂｌａｃｋ ｉｎｋ）为上海派克笔 有限公司产品。蓖麻油为湖北科田药业有限公司产
ｆｕｏｒｕｒ）、钝形马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｏｂｔｕｓａ）、球形马拉 色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｇｌｏｂｏｓａ）、限制马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｒｅｓｔｒｉｃｔａ）和斯洛菲马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｌｏｏｆｆｉａｅ）
ｍｅｄｉａ）ｉｎ ｔｈｅ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｔ ３５℃．Ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｎ ｂｅｔｈ ＳＤＡ ｐｌａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．５％Ｔｗｅｅｎ ４０ ａｎｄ ＳＤＡ ｐｌａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．５％Ｔｗｅｅｎ ６０．Ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ
相关，常侵袭皮肤角质层引起浅部真菌病。在已公 认的马拉色菌７个种中，糠秕马拉色菌较为常见，其
最常导致的疾病为花斑糠疹，糠秕马拉色菌还可引
菌株ＡＴＣＣｌ４５２１和球形马拉色菌ＣＢＳ ９７９５做质控 对照。 ４．形态学鉴定：取分离菌株涂片，用５００
ｍｌ／Ｌ
起败血症、腹膜炎、肺炎等【８］。本研究探讨了临床
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
ｓｍｅａｌ鸭．ａｎｄ ｔｈｅｎ
ｔｏ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ
Ｔｏ
ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅ Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
ｆｉｌｌｆｕｒ
ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｉｎ ｓｐｕｔｕｍ
ｔｏ
ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ．ｎｅｔｈｏｄｓ
ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ
ｗｅｒｅ ａｌＳＯ ｉｄａｎｔｉｆｉｅｄ鹪Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
ｆｌｌ咖ｒ
ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｗｉｔｈ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
Ｐａｒｋｅｒ ｊｎｋ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ
ｍｅｄｉａ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ危币‘，Ｗａｓ ｆｏｕｎｄ
ａ８
产生气泡则为阳性，不产生气泡为阴性。 ９．吐温沉淀试验：在加０．５％吐温４０和０．５％
吐温６０的ＳＤＡ培养基上观察马拉色菌的菌落周 围，如果出现白色沉淀圈，即为吐温沉淀试验阳性。 １０．蓖麻油试验：（１）打孔法：配制０．５麦氏浓
２％吐温２０、４０、６０、８０的ＳＤＡ，加０．５％吐温４０和
患者下呼吸道标本中糠秕马拉色菌的分离及鉴定
派克墨水染色后镜下观察形态为卵圆形出芽孢子。 ５．沙保罗培养基生长试验：将分离菌种接种于 ＳＤＡ培养基上，３５℃培养１４ ｄ，记录生长情况。 ６．吐温试验：（１）打孑Ｌ法：配制０．５麦氏浓度待 检菌液，密涂直径９０
ｌｎｍ
情况。
材料与方法 一、材料 １．标本来源：标本采自２０１０年３月至２０１１年 ９月卫生部北京医院呼吸道感染患者的气管吸痰 ４５００份。直接涂片经革兰染色镜检，镜下找到形态 疑似马拉色菌为入选标准，剔除同一患者的重复标 本，共１３３份疑似标本。糠秕马拉色菌ＡＴＣＣｌ４５２１ 由四川省人民医院喻华老师馈赠，球形马拉色菌
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
ｃａｐｒａｅ【６ｊ
可疑为马拉色菌（革兰染色阳性、成群圆形或卵圆 形、单出芽、芽生孢子与母孢子连接处可见颈圈样结
构）的标本，另涂片作派克墨水染色，镜检确认（念 珠菌孢子不着色）后接种马拉色菌筛选平板。 ２．菌株分离培养：挑一环镜检阳性的标本接种 于吐温科玛嘉平板上，用接种环密涂，于３５℃大气 环境，孵育２ ｄ开始观察。挑取小圆。白色至粉红 色，突起，较干燥，有特殊芳香气味的菌落涂片，用派 克墨水染色后镜检，疑似菌株在加０．５％吐温４０和 ０．５％吐温６０的ＳＤＡ平板上进行纯培养。孵育至