蛋白翻译后修饰42页PPT

第六章蛋白质翻译后修饰的鉴定

04
抗体法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应用
抗体法原理及技术流程
原理
抗体法利用特异性抗体与蛋白质翻译后修饰位点结合的原理，通过免疫学方法进行检测和鉴定。
技术流程
包括抗原制备、抗体生产、抗体纯化和特异性验证等步骤。
抗体法鉴定蛋白质翻译后修饰的优势与局限性
优势
高特异性、高灵敏度、可定量分析等。
局限性
化学方法
质谱分析
通过质谱技术检测蛋白质分子的质量和化学性质，从而鉴定蛋白质的翻译后修饰类型和位点。
荧光标记
利用荧光标记技术标记特定的修饰位点，通过荧光信号的强度和分布来鉴定蛋白质的翻译后修饰。
蛋白质芯片技术
将蛋白质固定在芯片表面，利用特定的抗体或配体检测蛋白质的翻译后修饰类型和位点。
实例分析
第六章蛋白质翻译后修饰的鉴定
汇报人：XX
目录
• 蛋白质翻译后修饰概述 • 蛋白质翻译后修饰的鉴定方法 • 质谱法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应用 • 抗体法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应用 • 其他方法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应
用 • 蛋白质翻译后修饰鉴定的挑战与未来发展
01
蛋白质翻译后修饰概述
数据准备
收集已知的蛋白质乙酰化修饰位点数据，包括蛋白质序列、修饰位点的位置和化学性质等。
特征提取
从蛋白质序列中提取与乙酰化修饰相关的特征，如氨基酸组成、序列模体、结构域等。
模型训练
利用机器学习或深度学习算法，如支持向量机、神经网络等，训练预测模型。
预测与验证
将新的蛋白质序列输入到训练好的模型中，预测潜在的乙酰化修饰位点，并通过实验验证预测结果的准确性。
其他方法
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蛋白质翻译后修饰

细胞应激反应
在应激条件下，如氧化应激和DNA损伤，蛋白质翻译后修饰可以调控应激反应相关蛋白的活性和功能，从而影响细胞的生存和凋
亡。
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泛素化作用
泛素化可以影响靶蛋白的稳定性、定位、活性以及与其他蛋白质的相互作用，从而调控细胞内的多种生物学过程，如细胞周期、信号转导和自噬等。
泛素化可以标记受损或不需要的蛋白质，引导其被蛋白酶体降解，从而维持细胞内蛋白质的平衡。
泛素化调控
泛素化过程受到严格的调控，涉及多种酶的协同作用。这些酶包括E1（泛素活化酶）、 E2（泛素结合酶）和E3（泛素连接酶）。
E3酶在泛素化过程中起着关键作用，它能够识别并结合特定的靶蛋白，将泛素分子准确地连接到靶蛋白上。
此外，去泛素化酶能够逆转泛素化过程，去除已经结合在靶蛋白上的泛素分子，从而对泛素化进行动态调控。
05
其他翻译后修饰
乙酰化
总结词
乙酰化是一种常见的蛋白质翻译后修饰，通过将乙酰基团连接到蛋白质的特定氨基酸残基上，可以调节蛋白质的活性和功能。
翻译后修饰可以影响蛋白质的稳定性，通过增加或减少蛋白质的降解速率，从而影响细胞内蛋白质的水平和功能。
蛋白质降解
某些翻译后修饰，如泛素化，可以标记蛋白质进行降解，通过蛋白酶体途径降解蛋白质，维持细胞内蛋白质的动态平衡。
蛋白质功能调控
酶活性调节
亚细胞定位
许多蛋白质在翻译后被修饰以改变其酶活性，例如，磷酸化可以激活或抑制酶的活性，从而调控代谢过程和信号转导。
03
疾病与磷酸化
许多人类疾病与蛋白质磷酸化的异常有关。例如，一些癌症和神经退行
性疾病的发生与特定蛋白质的异常磷酸化有关。因此，对蛋白质磷酸化

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1.3 核糖体（ribosome）与核糖体rRNA
核糖体是rRNA 与几十种蛋白质的复合体，有大、小两个亚基构成。含有合成蛋白质多肽链所必需的酶、起始因子（IF）、延伸因子（EF）、释放因子（RF）等。
原核的核糖体（70S）= 30S小亚基 + 50S大亚基 30S小亚基: 16S rRNA + 21种蛋白质 50S大亚基: 23S，5SrRNA + 34种蛋白质
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tRNA的结构—“四环一臂”
倒L形的三级结构
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tRNA的功能是解读mRNA上的密码子和搬运氨基酸。 tRNA上至少有4 个位点与多肽链合成有关：即3’CCA氨基酸接受位
点、氨基酰-tRNA合成酶识别位点、核糖体识别位点和反密码子位点。每一个氨基酸有其相应的tRNA携带, 氨基酸的羧基与tRNA的 3’
反应如下：
A A t R N A A T P 氨酰基 - t R N A 合成酶 A A - t R N A A M P P P i
氨基酸的羧基与tRNA 的3’端CCA-OH 以酯键相连，因此其氨基是自由的。
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tRNAfmet fMet-tRNA合成酶
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分泌型蛋白质在翻译过程中通过信号肽协助转入内质网的机制
信号肽（signal peptide）是在新生的多肽链中，可被细胞识别系统识别的特征性氨基酸序列，在蛋白质翻译过程中或翻译后的定位发挥引导的作用。
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本章结束
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氨酰基tRNA进入A位
新的氨基酸-tRNA的进位依赖Tu-Ts因子和GTP的协助

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的寡糖链。糖蛋白的空间结构决定了它可
以和那一种糖基转移酶结合，发生特定的糖基化修饰。
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甲基化
蛋白质的甲基化（ methylation）修饰是在甲基转移酶催化下，在赖氨酸或精氨酸侧链氨基上进行的甲基化．另外也有对天冬氨酸或谷氨酸侧链羧基进行甲基化形成甲酯的形式，这里主要关注前一种甲基化形式
核小体发生作用，导致核小体构象紧凑及染色质高度折叠。乙酰化使组蛋白与DNA
间的作用减弱，导致染色质构象松散，这
种构象有利于转录调节因子的接近，从而可以和转录因子结合，促进基因的转录; 去乙酰化则抑制基因转录。
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不同翻译后修饰过程的互相协调与影响
在体内，各种翻译后修饰过程不是孤立存在的．在很多细胞活动中，需要各种翻译后修饰的蛋白共同作用
对于同一个蛋白可以拥有一种以上的后修饰过程．各种翻译后修饰形式相互影响、相互协调
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谢谢观赏
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糖基化修饰的过程
• N-连接的糖链合成起始于内质网，完成于高尔基体。在内质网形成的糖蛋白具有相似的糖链，由Cis面进入高尔基体后，在各膜囊之间的转运过程中，发生了一系列有序
的加工和修饰，原来糖链中的大部分甘露
糖被切除，但又被多种糖基转移酶依次加
上了不同类型的糖分子，形成了结构各异
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组蛋白上的甲基化修饰
组蛋白上的甲基化修饰有赖氨酸的甲基化和精氨酸的甲基化两种，它们同转录调节和异染色体的形成有关。
组蛋白乙酰化水平增加与转录活性增强有关，而组蛋白甲基化修饰的结果则相对复杂，它可以是转录增强或转录抑制

蛋白质翻译后修饰与加工

VS
信号转导
在信号转导过程中，蛋白质的翻译后修饰可以影响蛋白质与其他信号分子或受体的结合，从而调控信号转导通路的激活或抑制。
蛋白质构象变化
构象变化
某些蛋白质在翻译后经过特定的化学修饰，如磷酸化、乙酰化等，这些修饰可以改变蛋白质的构象，从而影响蛋白质的功能。
结构域运动
蛋白质的结构域之间可以发生相对运动，这种运动可以影响蛋白质与其他分子的结合或构象变化，从而调控蛋白质的功能。
糖基化
总结词
糖基化是一种在蛋白质翻译后发生的修饰，通过将糖链连接到蛋白质的特定氨基酸残基上，影响蛋白质的结构和功能。
详细描述
糖基化分为两种类型：N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化发生在新生蛋白的N-端，而O-糖基化发生在丝氨酸或苏氨酸残基上。糖基化可以影响蛋白质的稳定性、分泌和细胞间的相互作用，参与多种生物学过程，如细胞识别、信号转导和免疫应答等。溶酶体途径Fra bibliotek溶酶体
是一种细胞器，内部含有多种水解酶，能够分解各种生物大分子。
溶酶体途径
是指通过溶酶体降解细胞内物质的过程。
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蛋白质定位与转运
核定位信号
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核定位信号（NLS）
是一种特殊的氨基酸序列，能够引导蛋白质进入细胞核。
核输出信号（NES）
存在于某些蛋白质中，能够将蛋白质从细胞核输出到细胞质。
酶的激活
某些蛋白质在翻译后经过特定的化学修饰，如磷酸化、乙酰化或甲基化等，这些修饰可以改变酶的构象或电荷分布，从而激活酶的活性。
酶的失活
某些蛋白质经过特定的化学修饰后，如泛素化或糖基化等，会导致酶的活性降低或完全失活，从而调控蛋白质的降解或功能。

蛋白组学翻译后修饰

差异点分析检测
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抗体免疫印迹法
优点
灵敏直观
克服同位素法的局限
无同位素污染，操作相对方便可检测无磷酸化转换的蛋白能区分不同残基的磷酸化
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磷酸化肽段的分离和富集
使用磷酸化蛋白的抗体 IMAC法磷酸基团亲和取代
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磷酸化蛋白的抗体
蛋白质组学
浙江大学生命科学学院
江辉
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第五章蛋白质翻译后修饰的鉴定
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蛋白质的翻译后修饰
很多前体蛋白是没有活性的，常常要进行一个系列的翻译后加工，才能成为具有功能的成熟蛋白。
加工的类型是多种多样的，一般分为四种：
N-端fMet或Met的切除：原核生物的肽链，其N-端不保留fMet，大约半数蛋白由脱甲酰酶（deformylase）除去甲酰基，留下Met作为第一个氨基酸；在原核及真核细胞中fMet或者Met一般都要被除去
二硫键的形成
化学修饰
剪切：很多的前体蛋白要经过剪切后方可成为成熟的蛋白，如胰岛素
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蛋白质的翻译后化学修饰
蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用，它使蛋白质的结构更为复杂, 功能更为完善，调节更为精细, 作用更为专一。
化学修饰的类型也很多，包括磷酸化（如核糖体蛋白的Ser，Tyr和Trp残基常被磷酸化）；糖基化（如各种糖蛋白）；泛素化（要进入蛋白酶体降解的蛋白）；甲基化（如组蛋白，肌蛋白），乙酰化（如组蛋白），羟基化（如胶原蛋白）等。
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翻译后化学修饰的生物学效应
泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA 修复、免疫应答和应激反应等生理过程起着重要作用;

蛋白质的翻译后修饰

蛋白质的翻译后修饰蛋白质是生物体内最为重要的分子之一，其功能与结构多种多样，而这些功能与结构的多样性与蛋白质的翻译后修饰密切相关。

在蛋白质翻译过程结束后，细胞内往往还需要对蛋白质进行进一步的后修饰，以实现其功能的发挥。

这些后修饰包括糖基化、磷酸化、乙酰化等，它们能够调节蛋白质的结构与功能，从而对细胞的生理过程发挥重要作用。

一、糖基化修饰糖基化修饰是指在蛋白质分子上附加糖基的过程。

这种修饰可以发生在蛋白质的Asn残基上，形成N-糖基化，也可以发生在蛋白质的Ser或Thr残基上，形成O-糖基化。

糖基化修饰能够调节蛋白质的稳定性、可溶性和定位，还可以影响蛋白质与其他分子的相互作用。

例如，MUC1蛋白质的糖基化修饰在肿瘤细胞的侵袭和转移中起到重要的调节作用。

二、磷酸化修饰磷酸化修饰是指在蛋白质分子上附加磷酸基团的过程。

磷酸化修饰通过蛋白激酶的作用来实现，它能够调节蛋白质的活性、稳定性和相互作用，影响蛋白质的信号传导、细胞周期和调控等生理过程。

例如，磷酸化修饰能够激活转录因子NF-κB，参与细胞对炎症和免疫反应的应答。

三、乙酰化修饰乙酰化修饰是指在蛋白质分子上附加乙酰基的过程。

这种修饰通常发生在蛋白质的赖氨酸残基上，通过乙酰转移酶来实现。

乙酰化修饰能够调节蛋白质的稳定性、DNA结合能力和转录调控活性，对细胞发育、增殖和分化等过程具有重要作用。

例如，乙酰化修饰通过调控组蛋白交换和染色质结构的紧凑性，影响基因的表达。

四、其他修饰形式除了糖基化、磷酸化和乙酰化修饰外，蛋白质的翻译后修饰还包括甲基化、泛素化、酰化等多种形式。

这些修饰过程能够进一步改变蛋白质的结构与功能，从而参与调控细胞内的生物学过程。

例如，泛素化修饰能够调节蛋白质的降解和稳定性，参与细胞凋亡和细胞周期控制。

总结蛋白质的翻译后修饰是细胞内多种生物学过程的关键环节，它能够调节蛋白质的结构与功能，从而对细胞的生理过程发挥重要作用。

糖基化、磷酸化、乙酰化以及其他形式的修饰能够改变蛋白质的特性，对细胞信号传导、基因表达和细胞周期等起到调控作用。

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• 细胞膜的许多蛋白质是以糖蛋白形式存在
• 糖低聚物在细胞间信号传递中也起了重要的作用
• 成为免疫系统调控和癌症治疗的最重要的线索之
一
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糖苷键类型 • N连接：天冬酰胺序列子Asn-X-Thr/Ser • O连接:Ser/Thr • 糖基磷脂酰肌醇锚 (glycosyl phophotidylinositol, GPI)：
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PSD－MALDI－TOF－MS
• PSD：源后衰变（post-source decay），母离子在飞行中发生断裂，丢失一个中性分子。磷酸化肽段丢失HPO3或者H3PO4，产生质量数减少80kD或者98kD的子离子。
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磷酸化位点的确定
• 用串联质谱（MS/MS）对磷酸化肽进行分析。 • 将磷酸化肽打碎，产生全部碎片离子，根据离子数量推断
• 至少有30%的蛋白被磷酸化修饰 • 大部分蛋白磷酸化是可逆的 • 磷酸化的作用位点
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蛋白质组学在磷酸化分析中的困难
• 磷酸化蛋白质在细胞内的蛋白质中是相对较低丰度的； • 即使我们找到一种磷酸化蛋白质，也不能排除有该蛋白质的其他磷酸化形式存在； • 细胞内有很多磷酸酯酶，在样品处理时，这些酶很容易将磷酸基团脱掉； • 磷酸化蛋白质酶解后的磷酸化肽段，因为其化学性质的负电性，在质谱技术中面
抗体免疫印迹法
• 优点 • 灵敏 • 直观
• 克服同位素法的局限 • 无同位素污染，操作相对方便 • 可检测无磷酸化转换的蛋白 • 能区分不同残基的磷酸化
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磷酸化肽段的分离和富集
• 使用磷酸化蛋白的抗体 • IMAC法 • 磷酸基团亲和取代
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