注射液无菌检查的方法学验证方案
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋
白胨溶液30 ml溶解后，过滤。
7.活菌计数
活菌计数结果见表1。
10－4稀释
10－5稀释
10－7稀释
试验次数
1
2
1
21Βιβλιοθήκη 2金黄色葡萄球菌56
60
枯草芽孢杆菌
77
79
白色念珠菌
86
70
黑曲霉菌
80
76
铜绿假单胞菌
47
50
方法验证
直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。
仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛牛基因有限公司。
01
方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验
02
操作方法 菌液制备： 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35℃培养；真菌培养基桶23-28℃培养。观察结果。
结果 细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。
表1 细菌数计数 表2 真菌数计数结果
*
菌 种
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
铜绿假单胞菌
生孢梭菌
计数(CFU)
22
26
36
39
62
66
58
54
45、 23
128、108
甲硝唑注射液无菌检查方法学验证研究
ｚｌ ｉｊ ｔ ｎａ ｄ ｍ ｋ ｅｔ ｔ ｂｅ ｔ ｇｏ ｔ ｌｙ ａ ｄａ ｆ ｉ ｓ ａ ｓ ｏｉｖ ｏ ｔ ｌ ｕ ｅ ｅｅ ｌ ｈ ｒｗ ｈ ｏ ｍ — ｏ ｎ ｃｉ ｎ ａ ｅ ｔ ｓ ｏ ｊｃ ｒｗ ｉ ｓ ｒ ｉ ， ｎ ｌ ｏ ｘ ｔ ｉ ｓ ｉ ｃｎｒ ｂ ｓｒｖ ａ ｔｅｇｏ ｔ ｆ ｉ ｅ ｅ ｏ ｈ ｅ ｓ ｎ ｅ ｔ ｉ ｌ ｓ ｒ ｎ ｐ ｔｅ ｏｔ
分别取 经 ３ ４±１℃温度条件 培养 ｌ ２ ８～ ４ｈ的金黄 色葡萄
埃 粒 子 数 ≥０ ５ ｍ ４ ３ ． ８Ｏ ７ 沉 降菌 数 Ｏ
２５ ６ ０
２ ３ ６２ ３ ０
ｌ５ ４ ０
洁净级别
１ ０ ０００级
１０ ０ 级
ｌ ０ ０ ０级 ０
１０ ０ 级
【 作者简介 】 （９８ ） 李玲 １６一 ，女 ， 本科 ，现任广西 南宁百会 药业集 团有限公 司质监部部 长。
２２
球菌 、铜绿假单 孢菌 、枯 草芽孢 杆菌 的营养 肉汤培养 物 ，用 Ｏ ％无菌氯化钠溶液稀释成小于 １０ ｆ／ ｌ ． ９ ０ ｕｍ 的菌液备用 。 ｃ 取经 ３ １ｏ温度 条件培养 １ ～２ ４３ Ｃ － ８ ４ｈ的生孢梭菌 硫 乙醇 酸盐流体培养基 培养物 ，用 ０９ ．％氯 化钠溶液 稀释成 小于 １０ ０
应用技术
Ａ ｐ ｅ ｅｈｏ ｇ ｐ ｌ ｄＴｃ ｎｌ ｙ ｉ ｏ
企业 科 技与发 展
Ｅｎ ｅ ｐ ｉｅ Ｓ ｉｎ ｅ Ａｎ ｃ ｎ ｌ ｇ ＆ Ｄｅ ｅｏ ｍ ｅ ｔ ｔｒ ｒｓ ｃｅ ｃ ｄ Ｔｅ ｈ ｏ ｏ ｙ ｖ ｌｐ ｎ
２１ 年第 ３ 总第 ２７ ） ０１ 期（ ９期
的菌 液 备 用 。
注射用头孢匹胺钠无菌检查方法的验证
基 △ 盆 璺
文◎ ｌ 赵海英 ２ 赵海 霞 （ ． １ 哈尔滨誉衡药业股份有 限公司 ； ２ 哈 尔 滨 誉 衡 药 业 股 份 有 限 公 司 黑龙 江 哈 尔滨 ） ．
童
涯射 用头 孢 匹胺钠 无 茵检 查方 法的验 证
摘要 ： 目的 ：建立 注射 用 头孢 匹胺钠 无 斜 面 培 养 物 ，加 入 ３ ｌ ． ％ 氯 化 钠 溶 液 ， ｒ ０ ９ 的 ｎ 菌检 查方法 。方法 ：参照 中 国药典》 ２ ｏ 洗 下 孢 子 转 移 至 另 一 试 管 ， 取 １ 加 入 ９ １ ｏ５ ｍｌ ｍ
赉４ ２ 小时和 ４ 小时观察细菌厦真菌结呆 ４ ８
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查 用） 。
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提供 。 １３ 培 养 基 ．
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＋ 一 ＋ 一 一 十 一
关 键 词 ： 注 射 用 头 孢 匹胺 钠 ； 无 菌 检
厌氧培养箱 中培 养） 。分别取 上述 两种真菌菌 液 ｌ ＬＪ入 培 养 皿 ， 每 种 菌 液 做 平 行 ２］。 注 ｍ） Ｄ １ ］ １
洗液 ，冲洗量 为５ ０ ｌ ０ ｍ ，并 以青霉索 酶为中和 剂 ， 即 可 消 除 样 品对 各菌 株 的抗 菌 活 性 ［］ ２。
参 考 文 献
［］ １ 国家药典委 员会编 １ 中华人 民共 和国 药典 ［ ］１ ０ ５ 年版二部 ， 北京 ：化 学工 ｓ ２ ０
业 出版 社 ， ２ ０ ０５
对注射剂无菌检查及方法学验证共性问题的一些探讨
对注射剂无菌检查及方法学验证共性问题的一些探讨对注射剂无菌检查及方法学验证共性问题的一些探讨审评四部刘宁注射剂作为药品的一种重要剂型被广泛地应用于临床，由于其直接注入人体体内，发挥疗效，因此其安全性显得更为重要。
现在对于注射剂的质量越来越受到高度关注，其中注射剂的灭菌是关系到药品质量、保证用药安全的重要工艺步骤之一，选择合适的灭菌方法，做到既杀灭除去微生物，达到灭菌目的，又保持药物稳定。
无菌检查是体现灭菌效果的主要手段，也是注射剂质量控制的一个重要指标。
在这里，结合审评实践，对注射剂在研发和药学审评中存在的一些无菌检查及方法学验证方面的共性问题进行探讨。
无菌检查是检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料以及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。
符合无菌检查法的规定仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。
2005年版中国药典无菌检查要求更加严格，修订了培养时间，把无菌检查的培养时间增加至14天（而2000年版的培养时间仅为7天），与国外药典完全一致，并新增了无菌检查方法学验证试验，以保证无菌检验结果的准确性和可靠性。
无菌检查法一般分为两种方法：直接接种法和薄膜过滤法。
直接接种法即每支（或瓶）供试品按规定量分别接入含培养细菌及真菌培养基的容器中。
薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可用一般薄膜过滤器。
无菌检查用的滤膜孔径为0.45μm，直径约为50mm。
根据供试品及溶剂的特性选择滤膜的材质。
如抑菌性供试品采用具有疏水性边缘及低吸附性的滤膜。
滤器及滤膜采用适宜的方法灭菌；使用时，要保证滤膜的完整性；水溶性供试品，先用少量冲洗液湿润滤膜。
油类供试品，滤膜和滤器，在使用前应充分干燥，备用。
过滤时，保持供试液及冲洗液覆盖整个滤膜表面；冲洗滤膜时，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗液、冲洗量及冲洗方法与方法验证相同。
2005年版中国药典都较详细地各提供了8种供试品的处理方式，在实际检验中可参考执行。
直接接种无菌检查法验证方案及报告
贵州金玖生物有限责任公司验证方案及报告验证方案名称：直接接种无菌检查方法验证验证方案编号：验证完成日期：有效期：验证方案申请人: 日期: 年月日验证方案审核人: 日期: 年月日验证方案审批人: 日期: 年月日1 概述无菌检查法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的检查法，是作为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。
它是根据用于实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性，液体培养基变浑浊一般表明样品受微生物的污染。
基于微生物污染的不均匀性，使无菌检查法结果的可信度受许多因素制约，如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量、操作环境、无菌技术等。
检验方法的验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组成部分，是保证检验结果的公正、科学、准确的基础。
2 验证目的对本公司所采用的直接接种无菌检查法进行分析验证，以证明所采用的方法适合于本公司产品的无菌检查。
3 实验原理直接接种法是通过加入一定的抑菌中和剂，以方便而快捷地中和抑菌剂，消除抑菌作用，从而消除抑菌作用对无菌检查的影响。
本实验通过设计对照试验对直接接种法所加入的抑菌剂的中和效果进行验证，从而得出直接接种法无菌检验的有效性。
4 验证范围实用于本公司所采用的直接接种法进行的无菌检验过程验证。
56 职责7 验证内容建立样品组、对照组及菌种活性检查组，接种菌株到指定培养基，培养24~72小时，比较观察菌落的生长状况，得出结论。
8 验证指示物本实验所用菌种为购于贵州食品药品监督管理局标准菌株:大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌及生孢梭菌。
9 实验过程（1）培养基的配制用于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的营养琼脂培养基用于白色念球菌的改良马丁培养基用于生孢梭菌的流体硫乙醇酸盐培养基（2）供试品的制备术泰舒TM生物多糖冲洗胶液供试品：直接取成品10ml，加pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试品。
注射用万古霉素无菌检查方法学验证
试验样品处理
试验步骤
按照无菌检查方法学的要求，对试验样品进行处理，包括稀释、加 药、培养等步骤。
操作规范
在处理试验样品的过程中，需要严格遵守无菌操作规范，避免样品 中的微生物污染实验环境。
数据记录
记录每个试验样品的无菌检查结果，包括微生物种类、数量等。
03
方法学验证实验
样品准备
取注射用பைடு நூலகம்古霉素样品，用无菌方法将样品分别装入无菌容器中。
注射用万古霉素无菌检查方 法学验证
汇报人：
日期:
• 引言 • 方法学验证方案 • 方法学验证实验 • 方法学验证结果分析 • 注射用万古霉素无菌检查方法学验
证总结
01
引言
目的和背景
目的
确保注射用万古霉素的无菌检查方法具有可靠性、准确性和可重复性，为产品质量控制提供有力支持 。
背景
注射用万古霉素是一种广泛应用于临床治疗的抗生素药物，其无菌质量对于保障患者安全具有重要意 义。因此，对无菌检查方法进行验证是保证药物安全性的关键环节。
参考标准
《中国药典》2020年版
规定了注射用万古霉素的无菌检查方法和要 求。
《无菌检查法》国家药品标 准
提供了无菌检查方法学的通用指导原则。
《微生物限度检查法》国 家药品标准
提供了微生物限度检查的方法学指导原则。
定义与术语
无菌检查
01
指对药物中是否含有微生物的检查方法，是确保药物
无菌的重要手段。
实验设计
根据无菌检查方法学验证指导原则，设计实验方案，包括实验组和对照组。
实验操作
按照实验设计方案，分别对实验组和对照组进行无菌检查实验。
培养与观察
将实验组和对照组的培养皿放入无菌培养箱中培养 ，每天观察并记录培养结果。
曲克芦丁注射液无菌检查法方法学研究
151BIOTECHWORLD 生物技术世界曲克芦丁系芦丁经羟乙基化制成的半合成黄酮化合物,具有抑制红细胞和血小板凝聚作用, 有防止血栓形成的作用,同时能增加血中氧的含量,改善微循环,促进新血管生成以增进侧支循环。
它对内皮细胞有保护作用,同时能对抗5-羟色胺、缓激肽引起的血管损伤, 增加毛细血管抵抗力, 降低毛细血管通透性, 防止血管通透性升高引起的水肿。
曲克芦丁注射液具有治疗闭塞性综合征血栓性静脉炎毛细血管出血等症 按照中国药典规定注射类制剂需进行无菌检查[1]并要求进行无菌检查法验证, 因此,对曲克芦丁注射液无菌检查方法进行了研究。
1 材料与方法1.1 材料(1)培养基与试药。
曲克芦丁注射液,规格2ml:100mg,批号110101,110102,110103,由江苏康缘药业股份有限公司生产。
硫乙醇酸盐流体培养基,批号20100918;改良马丁培养基,批号20100601,营养肉汤培养基20100708,改良马丁琼脂培养基,批号20100602。
营养琼脂培养基,批号091220(由宜兴市永信生物有限公司生产)。
(2)仪器与设备仪器。
HTY-2000A型集菌仪(由杭州泰林生物技术设备有限公司生产)、一次性使用全封闭集菌培养器(由杭州泰林生物技术设备有限公司生产)。
双人净化工作台(型号:YJT,由靖江市磊鑫机械厂生产);生物安全柜(由苏州市华宇净化设备有限公司生产);脉动真空灭菌器(型号:DMG-0.28,由连云港千樱公司生产)。
(3)菌种。
枯草杆菌CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、大肠埃希菌CMCC(B)44102、生孢梭菌CMCC(B)64941、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003。
以上均来源于江苏省药品检验所。
6株工作用菌种代数均为第五代。
1.2 方法(1)菌液制备方法[2-3]。
①取经33.0℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌肉汤新鲜的液体培养物1ml 加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中,10倍稀释至10-5～10-7,制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液,备用。
盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液无菌检查方法学验证
盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液无菌检查方法学验证作者：吴羽岚嵇海澄来源：《中国医药科学》2013年第13期[摘要] 目的对盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液的无菌检查方法进行探讨，建立其无菌检查方法。
方法按《中国药典》（2010年版）附录ⅪH无菌检查方法进行。
结果在验证条件下，该方法能消除对微生物生长的抑制作用。
结论可以采用此法对本品的无菌进行检查。
[关键词] 盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液；无菌检查方法；薄膜过滤法[中图分类号] R-331 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）13-95-02Study of sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection WU Yulan JI HaichengJiangsu Hansoh Pharmaceutical Co.Ltd.，Lianyungang 222000，China[Abstract] Objective To discuss and establish the sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection. Methods The test were done according to appendix XIH-sterile examination method in"Chinese Pharmacopeia"（2010 edition）. Results The method could eliminate the inhibition of microbe growth under the validation condition. Conclusion This method can be used for the sterile examination of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection.[Key words] Levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection；Sterile examination method；Membrane-filter procedure盐酸左氧氟沙星（Levofloxacin Hydrochloride）化学名称：（S）-9-氟-2，3-二氢-3-甲基-10-（4-甲基-1-哌嗪基）-7-氧代-7H-吡啶并[1，2，3-de]-[1，4]苯并嗪-6-羧酸盐酸盐的水合物，属第三代喹诺酮类抗菌药。
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注射液无菌检查方法（中国药典2010版）验证方案验证方案编号：2010•MEF•041•05•004
起草单位(Composed by)：质检部(QC Department)
起草人(Composer)：日期(Date)：
审核人(Reviewed by QC)：日期(Date)：
审核人(Reviewed by QA)：日期(Date)：
批准人(Approved by)：日期(Date)：
目录
1. 验证目的
2. 验证人员
3. 验证依据及参考文件
4. 仪器与设备
5. 验证过程
5.1 培养基及稀释液5.2 菌液的培养与制备
5.3 方法验证试验
6. 验证总结
1. 验证目的：
本试验是注射液的抑细菌、抑真菌活性及所用的无菌检查方法的可靠性进行验证，以确认该产品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除至可以忽略。
即：保证所用的无菌检验方法能对该产品进行准确、可靠的检验。
2. 验证人员：
验证小组组长：刘长宏
验证小组副组长：宋芳良
验证小组成员：曲晓燕、常西胜
3. 验证依据及参考文件：
验证依据：中华人民共和国药典2010版二部
参考文件：2010年版中国药典无菌检查方法、验证操作学习班讲稿汇编（中国药品检验所）
4. 仪器与设备
XG1.DM-0.36B型机动门脉冲真空灭菌器
细菌培养箱
霉菌培养箱
净化工作台
5. 验证过程：
5.1 培养基及稀释液
5.1.1 培养基及稀释液的配制
按“中国药典2010版二部附录Ⅺ H无菌检查法”中，有关规定配制本验证所需培养基:
5.1.2培养基的适用性检验
5.1.2.1 培养基无菌性检查
从以上培养基及稀释液中，每批随机取5支（瓶），培养14天，应无菌生长。
结果记录：
结论：
5.1.2.2 培养基灵敏度检查
取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天，逐日观察结果。
取每支装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天，逐日观察结果。
空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，则可判该培养基的灵敏度检查符合规定。
较差记为“差”。
记为“差”。
结论：
5.2 菌液的培养与制备
5.2.1 菌种
5.2.2菌液制备
接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时。
用0.9％无菌NaCl溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
取肉汤培养物1ml＋9ml0.9％无菌NaCl溶液，十倍稀释至10－5～10－7稀释级可得约为50～100cfu/ml的菌悬液。
用营养琼脂培养基做活菌计数备用。
接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时。
用0.9％无菌NaCl溶液稀释至10－5～10－7稀释级制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23~28℃培养24~48小时。
用0.9％无菌NaCl溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
取改良马丁培养物1ml＋9ml0.9％无菌NaCl溶液，十倍稀释至10－5～10－7稀释级可得约为50～100cfu/ml的菌悬液。
用改良马丁琼脂培养基做活菌计数备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌NaCl溶液，将孢子洗脱。
然后，吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌NaCl溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
取培养物1ml＋9ml0.9％无菌NaCl溶液（含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80）十倍稀释至10－4稀释级可得约为50～100cfu/ml的孢子悬液。
用改良马丁琼脂培养基做活菌计数备用。
菌液制备后在常温下放置，并在2小时内使用。
若保存在2-8℃，可在24小时使用。
结论：
5.3 方法验证试验
按中国药典2010版二部规定，根据下表中预定检验方案，将规定量的注射液供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中分别加入小于100cfu 的试验菌之一，过滤。
取出滤膜接种至相应培养基中（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌接种于硫乙醇酸盐流体培养基中；白色念珠菌、黑曲霉接种于改良马丁培养基中）。
另取一装有同体积培养基的容器，加入等量的相应试验菌，作为对照。
按规定温度培养3～5天，观察各试验管生长情况。
各试验菌同法操作。
与对照管（只加阳性菌）相比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则该供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，可以照此检查法进行该产品的日常无菌检查。
如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则该供试品的该检验量在该试验条件下有抑菌作用，可逐一采用以下方法消除或减小该供试品的抑菌性并重新进行方法验证：
（1）增加冲洗量
（2）增加培养基的用量
（3）使用中和剂或灭活剂
（4）更换滤膜品种
同法每个注射液产品至少平行测定三次。
结论：6. 验证总结：。