蛋白质结构分析中的电子显微技术
冷冻电镜观察蛋白颗粒
冷冻电镜，也称为冷冻电子显微镜或冷冻EM，是一种在低温下观察生物样品的技术。
它可以观察蛋白质颗粒和其他生物大分子，并提供了高分辨率的结构信息。
在冷冻电镜中，样品被迅速冷冻在低温下，以保持其自然状态。
然后，电子束被用来扫描样品，并收集散射的电子来生成图像。
由于电子束的波长比光波短得多，因此冷冻电镜可以提供更高的分辨率图像。
冷冻电镜在生物学研究中非常有用，因为它可以观察不稳定的、易变的或非常小的蛋白质颗粒。
这使得科学家能够更深入地了解蛋白质的结构和功能，进而了解生命的基本过程。
此外，冷冻电镜还可以与其他技术结合使用，例如单颗粒分析、冷冻电子断层扫描和微电子衍射等技术。
这些技术可以提供更多关于蛋白质结构和动力学的信息，有助于科学家更好地理解蛋白质的功能和作用机制。
总之，冷冻电镜是一种强大的技术，可以提供高分辨率的蛋白质结构和动力学信息，为生物学研究和药物设计提供了重要的工具。
实验三 电子显微镜技术的演示
实验三电子显微镜技术的演示背景知识：普通光学显微镜通过提高和改善透镜的性能，使放大率达到1000~1500倍左右，但一直未超过2000倍。
这是由于普通光学显微镜的放大能力受光的波长的限制。
为了从更高的层次上研究物质的结构，必须另辟蹊径，创造出功能更强的显微镜。
20世纪20年代法国科学家德布罗意发现电子流也具有波动性，其波长与能量有确定关系，能量越大波长越短，比如电子学1000伏特的电场加速后其波长是0.388埃，用10万伏电场加速后波长只有0.0387埃，于是科学家们就想到是否可以用电子束来代替光波，这是电子显微镜即将诞生的一个先兆。
用电子束来制造显微镜，关键是找到能使电子束聚焦的透镜，光学透镜是无法会聚电子束的。
1926年，德国科学家蒲许提出了关于电子在磁场中运动的理论。
他指出：“具有轴对称性的磁场对电子束来说起着透镜的作用。
”这样，蒲许就从理论上解决了电子显微镜的透镜问题，因为电子束来说，磁场显示出透镜的作用，所以称为“磁透镜”。
1931年，德国柏林工科大学的Knoll和Ruska制作成功第一台电子显微镜──它是一台经过改进的阴极射线示波器，成功地得到了铜网的放大像──第一次由电子束形成的图像，加速电压为7万，最初放大率仅为17倍。
尽管分辨率还不如光学显微镜高，但它却证实了使用电子束和电子透镜可形成与光学像相同的电子像。
经过不断地改进，1933年Ruska和Bodo Von Borries又制成了第二台两级短焦距的电子显微镜，获得了金属箔和纤维的放大1万倍的电子图像。
虽然放大率得到提高，但分辨率当时还刚刚达到光学显微镜的水平。
1937年应西门子公司的邀请，Ruska建立了超显微镜学实验室。
1939年西门子公司制造出分辨本领达到30埃的世界上最早的实用电子显微镜，并投入批量生产。
随后，透射电镜的商业产品由美国无线电公司于1941年开始制作生产。
电子显微镜的出现使人类的洞察能力提高了好几百倍，不仅看到了病毒，而且看见了一些大分子，即使经过特殊制备的某些类型材料样品里的原子，也能够被看到。
蛋白质的功能和结构研究
蛋白质的功能和结构研究蛋白质是生命的基本组成部分之一，在生物学领域中起着重要的作用。
由于它的广泛应用和大量的应用价值，蛋白质在生物学、医学等领域中一直被大量研究。
本文主要探讨蛋白质的功能和结构及其研究的相关内容。
一、预备知识在开始探讨蛋白质的功能和结构及其研究的相关内容之前，我们需要先了解一些与蛋白质相关的基础知识。
1. 蛋白质的基本结构和组成蛋白质是一种由氨基酸构成的高分子有机化合物，是生命体中许多关键结构和功能的基础组成部分。
其中，氨基酸是蛋白质所构成的基本单元，它们通过肽键进行缩合形成多肽链，然后多肽链进一步折叠成蛋白质分子。
2. 蛋白质的分子量蛋白质的分子量通常较大，常见的蛋白质分子量在10,000至1,000,000之间。
其中，分子量较小的蛋白质称为小型蛋白质，而大型蛋白质则包括了许多复合蛋白质和膜蛋白质。
3. 蛋白质的结构分类蛋白质可以根据其结构分为四类：原生质，二级结构，三级结构和四级结构。
原生态是蛋白质最初折叠的状态，二级结构是多肽链中相邻氨基酸的折叠方式，三级结构是碳水化合物折叠成一个与其他区域相对分离的单独域，四级结构是几个多链组装在一起形成一个多链复合物。
二、蛋白质的功能蛋白质在生命体中扮演着几乎所有生物过程的关键角色。
它们是组成肌肉、调节细胞的信号传递、催化生化反应、免疫应答、运输激素、维护结构等过程中的关键部分。
以下是蛋白质在生物学中扮演的一些关键角色。
1. 催化酶许多化学反应需要催化剂才能发生，而蛋白质酶就是生物体中最常见的催化酶类型。
酶是生命过程中许多重要的生物反应中所需的催化剂，如营养成分消化、免疫反应、信号转导、DNA复制和细胞呼吸等。
2. 组成细胞的结构蛋白质是细胞中许多重要分子的基本组成部分，如细胞质中的细胞骨架蛋白质、细胞核中的染色质蛋白质和核酸转录蛋白质。
细胞的功能和命运都与蛋白质有关，如细胞繁殖、信号传递和氧化还原反应等。
3. 维护组织的形态许多结构性蛋白质都在生命过程中起到关键作用。
蛋白质低温电镜结构分析简介
蛋白质低温电镜结构分析简介张德添生物电子显微学是通过电子显微镜技术和电镜图像处理技术，能够直观地提供生物大分子的形貌和结构信息。
电子显微学技术方法主要由三个部分组成。
它们是电子晶体学技术，单颗粒技术和电子断层成像技术。
由于这些技术的结构解析对象的尺度范围，介于X- 射线晶体学与光学显微镜之间。
因此，特别适合于从蛋白质分子结构到细胞和组织结构的解析分析研究工作中。
以低温电镜技术与三维重构技术为基础的低温电子显微学技术方法，近年来在国际上得到发展迅速和应用。
已经成为继X- 射线晶体学技术和核磁共振波谱学技术后，分析和研究生物大分子结构的三大主要手段之一[1]。
一、结构生物学技术随着人类基因组计划的完成，生物学进入了后基因组时代。
但是生物大分子与这些基因的种种联系，包括如何转录、翻译、加工、组装等，都不十分清楚。
生物大分子在细胞和细胞器中，如何排列和相互作用，也都不十分清楚。
众所周知，生物界中的结构生物学有着不同的层次结构。
从个体、器官、组织、细胞、到生物大分子。
虽然生物大分子处于生物界的最低位置。
但却决定着生物界高层次系统之间的差异。
为什么要研究生物大分子的结构呢？因为结构(主要指三维结构)不仅决定功能，而且结构是研究应用的基础。
其中包括例如，药物设计，基因改造，疫苗研制开发，人工构建蛋白等。
曾经有人预言，结构生物学研究的任何突破，将会给生物学界研究带来一场新的革命。
目前，国际上研究大分子结构的主要方法和手段有：X-射线晶体学，核磁共振波谱学和生物电子显微学。
三种测定方法和手段各有优缺点。
而生物电子显微学适用于从分子到细胞各个结构层次的三维结构研究。
生物电子显微学是研究结构生物学的重要一环。
应该说生物电子显微学与 X-射线晶体学和核磁共振谱学一道，都是结构生物学的重要研究手段和工具。
在以上问题的研究中，能够起到重要的作用和担当重要的角色[2]。
二、生物电子显微学技术电子显微镜在生物医学中的应用经历的几个主要阶段：上个世纪30-50年代，初级阶段；上个世纪50-60年代，第一次高速发展阶段。
冷冻电镜 蛋白质结构
冷冻电镜蛋白质结构1 冷冻电镜冷冻电镜是物理学和生物学研究 processe 的一个重要手段，它可以提供准确的原子水平的结构信息，使我们了解更多的蛋白质的结构和功能。
冷冻电镜是一种利用蛋白质在极端条件下沉积后保持其原始结构的一种技术，可以高分辨率地检测蛋白质的结构，该方法可以解决蛋白质易溶和不可性质，它采用的方法是在极端温度下形成的蛋白质的冷冻电镜模型，其独特的工艺和步骤操作可以为研究基础过程和结构提供重要的细节数据。
2 冷冻电镜的用途和步骤冷冻电镜可以获得蛋白质的原子结构信息，分析其结构和功能机制，协助我们更深入地理解其生物学功能。
这是一种特殊的显微技术，利用超过50keV的电子束来检测蛋白质的结构。
整个处理过程包括：连续扫描技术，密度法来表征氢键簇的分布，形成的蛋白质的三维模型的定量和质量，检测亚细胞结构和蛋白质的连接状态等。
3 冷冻电镜的优势冷冻电镜技术也有一些优点，它可以快速获得细胞内和细胞外环境中稳定性空间结构的信息，可以确定蛋白质的空间结构，为蛋白质结构和功能机制研究提供空间信息。
另外，它可以模拟很多蛋白质极端环境下的结构，例如高压，低温等，这种技术可以提供准确的有序结构的蛋白质的定量数据，学术界对它的重要性也非常看重。
4 结论由于冷冻电镜技术的优势，它被广泛应用于蛋白质的结构和功能机制的研究。
此外，随着技术的发展和进步，它也可以检测更复杂的蛋白质结构和功能。
可以预料，今后冷冻电镜技术在蛋白质研究中还将发挥重要作用，它将推动人们深入到蛋白质结构和功能了解更多深层次的细节信息，有助于更好地理解与治疗许多疾病，也有助于我们认识自然界的奥秘。
蛋白质结构测定的方法
应用：( Ⅰ) 研究生物大分子及其复合物在溶液中的
三维结构和功能; ( Ⅱ) 研究动态的生物大分子之间以及与配基
的相互作用; ( Ⅲ) 研究生物大分子的动态行为; ( Ⅳ) 用固体核磁共振或液体核磁共振技术研
究膜蛋白的结构与功能; ( Ⅴ) 研究蛋白质折叠,折叠动力学; ( Ⅵ) 用于药物筛选与设计; ( Ⅶ) 研究代谢组学; ( Ⅷ) 研究活细胞中的蛋白质蛋白质相互作用; ( Ⅸ) 核磁成像用于认知科学研究.
传播方向看好似做圆周运动——circularly polarized
light
▪ 右圆偏振光：面对光源
E
H
电场矢量顺时针转动
左圆偏振光：面对光源
传播方向
电场矢量逆时针转动
入
圆二色性（ CD， circular dichroism）
旋光物质对左、右圆偏振光吸收不同，导致振幅变 化，从而产生椭圆偏振光的现象。
蛋白质空间结构国内外研究动态
在国际上,美国首先提出大规模测定蛋白质结 构的计划,现在已经进入第二期的产出阶段. 其他发 达国家(欧盟和日本)也相继启动自己的结构基因 组计划. 我国根据美国第一期的试验计划,发现X射线晶 体学仍然是测定结构的主要手段,这与预期的结果相符. 过去和现在情况都是这样,蛋白质结构数据库中的80% 的结构来自X射线衍射. 其他有重要贡献的手段有核磁 共振和低温冷冻电镜( cryo2EM). 由于这三种方法的 重要性,最近几年,它们都有很大的改进.
（五） 扫描隧道显微技术（STM， scanning tunneling microscope）：
STM的工作原理：
▪ 扫描隧道显微镜的工作原理是基于 量子力学中的隧道效应。对于经典 物理学来说，当一个粒子的动能E 低于前方势垒的高度V0时，它不可 能越过此势垒，即透射系数等于零 ，粒子将完全被弹回。而按照量子 力学的计算，在一般情况下，其透 射系数不等于零，也就是说，粒子 可以穿过比它能量更高的势垒，这 个现象称为隧道效应。
蛋白质晶体结构解析
1
1. 蛋白质结构解析技术
X射线晶体衍射 X射线晶体学可以通过测定蛋白质分子在晶体中 电子密度的空间分布，在一定分辨率下解析蛋 白质中所有原子的三维坐标。
核磁共振（NMR）核于磁均共一振稳技定术的不、需分要子获量得在生30物kD大以分下子的的生晶物体大,适分用
子溶液，并且能够提供生物大分子的动力学信息
冷冻电子显微技术是近年来兴起的一种获得低分辨率（低于5 埃）蛋白质结构的方法，该方法最大的优点是适用于大型蛋白质 复合物（如病毒外壳、核糖体和类淀粉蛋白纤维）的结构测定。
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2. X射线晶体衍射法 测定蛋白质结构的基本过程
1.蛋白质结晶 2. 数据收集 3. 相位的测定 4. 相位的优化 5. 电子密度图的解释 6. 修正
电镜技术
近年来电镜尤其是单颗粒冷冻电镜三维重构 技术的发展使得人们能够更方便地研究分子 量在 150 kD 以上的生物大分子，其分辨率 能够到达 3 Å~4 Å。
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专门存储蛋白质和核酸分子结构的蛋白质数据库中，接近90% 的蛋白质结构是用X射线晶体学的方法测定的。
大约9%的已知蛋白结构是通过核磁共振技术来测定的。该技 术还可用于测定蛋白质的二级结构。
考虑到已建立的立体化学资料(如键长，键角等)的限制，根 据X射线衍射数据对初始的蛋白质分子模型进行修正。
一套好的衍射数据是晶体结构分析的基础，衍射数据的好 坏直接涉及结果的精密。而一套好的衍射数据又与晶体的好坏、 X射线源的强度以及收集数据的仪器和方法有关。
目前通常采用的X射线源有两类，一类是阳极靶式包括封 闭管式和旋转阳极靶式，另一类是同步辐射X射线源。
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无论哪种形式，都要求X射线源的辐射密度尽量大，即单位面 积的光强大。对同一晶体来说，只要蛋白质对辐射有一定的耐受力 否则在收数据的过程中需要更换晶体，X射线源的强度越高，晶体 的衍射强度也就越大，数据的误差也就越小。各种X射线源的光强 大小关系是：X射线源封闭管的光强最弱,转靶X射线源的强度约为 封闭管的一倍，同步辐射光强约为封闭管的一倍。
原位电子显微镜技术的研究现状
原位电子显微镜技术的研究现状原位电子显微镜技术是一种非常重要的微观分析工具，在纳米材料研究、纳米器件制造、生物医学等领域都有重要应用。
本文将从以下几个方面来分析原位电子显微镜技术的研究现状：技术原理、应用领域、研究进展以及未来发展方向。
一、技术原理原位电子显微镜技术是指利用电子束对样品进行成像和分析的一种显微技术，其中“原位”表示实时观察材料性质的能力。
原位电子显微镜本质是一种高分辨率电子显微镜，常用的是透射电子显微镜（TEM）或扫描电子显微镜（SEM）。
原位电子显微镜技术的信号来源包括电子束散射、透过和反射。
这些信号不仅提供样品表面的信息，还可以提供材料内部结构的信息。
原位电子显微镜可以通过载气（如氢气、氧气、碳气等）、能量（如电子注入、加热、激光等）等手段，实时观察样品内部的形貌变化、晶体结构的演化、催化反应动力学、电子运输行为等过程。
二、应用领域原位电子显微镜在材料科学、纳米技术、化学、生物医学等领域都有重要应用。
以下是一些实际应用场景：1. 纳米材料研究原位电子显微镜可以帮助研究纳米材料的形貌和结构，例如金属纳米颗粒的成长过程、碳纳米管的形貌和结构变化、核-壳型纳米颗粒的析出和生长机制等。
2. 纳米器件制造原位电子显微镜可以用于研究纳米器件制造中的微观结构和性能，例如扫描探针显微镜（SPM）、纳米压印、纳米光学制造、热电材料、锂离子电池等。
3. 生物医学原位电子显微镜可以用于研究生物材料（如蛋白质、DNA、细胞膜等）的结构和功能，揭示各种生物过程中的分子机制和变化过程。
三、研究进展随着原位电子显微镜技术的发展，人们对它的应用和研究范围也在不断扩大。
以下是原位电子显微镜技术研究的一些重要进展：1. 实时观察催化反应机理原位电子显微镜可以实时观察催化反应的机理和表面变化，研究催化剂的功能和工作原理，例如氢气化反应、金属表面催化反应等。
2. 实时观察沉积和腐蚀原位电子显微镜可以实时观察沉积和腐蚀等化学反应，研究附著部件、化学反应和电子输运的微观结构变化、腐蚀机理及疲劳和断裂性质等。
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蛋白质结构分析中的电子显微技术蛋白质是生命体中最为重要的分子之一，具有极其复杂的结构
和功能。
为了研究和理解蛋白质的结构和功能，科学家们开发了
多种互补的技术手段，其中电子显微技术尤为重要。
本文将探讨
蛋白质结构分析中的电子显微技术，包括物理原理、技术特点以
及应用前景等方面。
一、电子显微技术简介
电子显微技术是以电子束为探针，通过对物质的电子散射、透射、反射等现象进行观察与分析，以获取样品的微观结构信息的
技术手段。
电子显微技术的发展对生命科学领域的研究及探索提
供了强有力的工具，尤其在蛋白质结构分析中，其应用广泛。
二、电子显微技术在蛋白质结构分析中的应用
1.电子衍射
蛋白质的结晶状态是进行X射线晶体衍射结构分析的必要条件，但是，由于部分蛋白质难以结晶或者获得合适的晶体，因此开发
其他衍射分析方法是很有必要的。
电子衍射是一种新兴的衍射技术，能够应用于那些不能结晶的生物大分子的结构分析。
电子束的波长比X射线短，且电子束的相干性高，能够探测到小于10 nm的晶体，因此常用于蛋白质晶体结构分析。
2.电子显微镜观察
电子显微镜技术可以通过电子透射观察样品的形态和结构，具有高分辨率、高灵敏度、非常适合研究生物大分子细节结构的特点。
例如，对于由多个蛋白质组成的蛋白质复合物，电子显微镜技术可以帮助研究者观察到不同蛋白质分子的相对位置、定位及组装方式，进而解析蛋白质复合物的3D结构。
电子显微镜技术在蛋白质复合物、病毒、核酸结构分析中得到了广泛应用。
3.电子能谱
电子能谱根据样品中不同原子的结合状态测定其电子轨道的能级分布情况，可以用于确定分子离子的化学成分及其结合状态。
在蛋白质结构分析中，电子能谱技术可以帮助研究者分析样品中存在的不同蛋白质、蛋白质和其他小分子之间的相互作用及结合模式等问题。
三、电子显微技术的发展趋势
随着电子显微技术的不断发展，其应用越来越多、越来越广泛，而且还存在着不断创新和进步的空间。
未来，电子显微技术的发
展趋势将会越来越迅速，主要有以下几个方向：
1. 设备自动化和智能化
对于一些庞大、复杂的蛋白质复合物，需要现代显微技术的高
通量化和自动化处理才能深入分析。
因此，未来电子显微技术将
趋向于设备自动化和智能化，从而更好地应对不断增长的数据量
和研究需求。
2. 纳米级电子显微技术
纳米级电子显微技术是目前的研究热点。
该技术主要指探测小
于10纳米的微细结构，这一领域的研究将在蛋白质结构研究和生
物分子的制备、分析、测量等领域拓展电子显微技术的应用范围。
3. 多尺度电子显微技术
多尺度电子显微技术能够同时探测纳米、亚微米和微米级别的结构信息，这种技术将极大地推动蛋白质复合物、细胞结构等多尺度结构的研究。
四、结论
电子显微技术在蛋白质分子结构分析中具有非常重要的作用，提供了可靠、准确的高精度分析方法，对于深入理解生命机理和开发相关药物具有十分重要的意义。
未来，随着电子显微技术的不断发展和应用，在蛋白质结构分析等方面将会取得更加深入的研究成果，为生命科学领域的发展提供更加强大的动力和支持。