DNA扩增试剂盒 恒温扩增法
食品中常规致病菌快速检测(恒温扩增芯片法)
取本品1包，撕开包装袋，将培养基粉末倒入1000ml三角瓶中，加入蒸馏水或去离子水180ml，搅拌 至完全溶解，定容到450ml，获得母液。母液121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，冷却至室温即可使用或4 ℃ 储存，并在1个月内使用完。每次使用时，量取37.5ml母液于500ml三角瓶，添加187.5ml灭菌的蒸馏水 或去离子水，混合均匀，即可使用。
6.5 恒温扩增
5
T/CSPSTC X-2018 将离心后的芯片固定在恒温扩增微流控核酸分析仪上，根据软件提示步骤进行操作，按照表3的核 酸扩增反应程序进行检测。
步骤
1
温度（℃） 37
时间（分钟） 3
表 2 核酸扩增反应程序
2 65 47
7 结果判读
检测完成后软件将自动进行数据处理和分析，自动生成检测报告。 7.1 结果判读标准
食品中常规致病菌的快速检测程序，见图2。 样本
样本前处理
25 g（mL）样品+225 mL 食源性共増菌培养基 36 ℃±1 ℃，16 h～20 h
取 100ul 共増菌培养液收集菌体，提取核酸 浓度范围 50pg/ul~50ng/ul
配置反应体系，上芯片 芯片离心
上机
4
T/CSPSTC X-2018
a) 信号值>背景信号平均值，且 Tp 值≤Tp 阈值，且扩增倍数值≥扩增倍数阈值，该种情况下判 定为阳性；
b) 信号值>背景信号平均值，且 Tp 值>Tp 阈值，且扩增倍数值<扩增倍数阈值，该种情况下判定 为阴性；
c) 信号值<背景信号平均值，该种情况下判定为异常。
注：Tp值（Time Positive）：扩增曲线开始起峰的位置（扩增开始位置）； 扩增倍数值：扩增曲线最高点与基线区平均值的比值。
恒温扩增技术综述
恒温扩增技术综述(总6页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--摘要：恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。
目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。
它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。
本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在动物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。
关键词：恒温扩增；PCR引言：近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于动物疾病的实验室检测中，恒温扩增技术就是在此背景下出现的。
与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。
所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR 媲美的检测方法，目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增（rolling circle amolification，RCA）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）、依赖核酸序列扩增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA）和解链酶扩增（helix dependent amplification，HAD），这些技术各有特点，这也决定了它们在动物疾病检测中的应用情况，下面就它们的原理、特点及其在动物疫病检测中的应用情况进行综述。
1滚环核酸扩增1. 1 滚环核酸扩增的原理滚环核酸扩增（rolling circleamolification, RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA 的方式而提出的[1]，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。
线性RCA 是引物结合到环状DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA 完全互补）的线状单链。
交叉引物恒温扩增法诊断结核病的价值
交叉引物恒温扩增法诊断结核病的价值作者：高严来源：《现代养生·上半月》2022年第09期【摘要】目的评价交叉引物恒温扩增法（crossing-primeramplification，CPA）检测技术诊断结核病的价值。
方法分析泾县医院2019年1月- 2021年6月进行CPA检测的207例疑似结核病住院患者的临床资料，并与罗氏培养检测、涂片改良抗酸染色镜检、结核抗体（tuberculosis antibody，TB-Ab）检测的实验结果相对比，评价各检测方法的诊断效能。
结果以罗氏培养为金标准，CPA检测的灵敏度和特异度分别为63.1%、95.1%，且和罗氏培养结果具有中高等程度的一致性（Kappa=0.626），诊断效能优于涂片改良抗酸染色镜检和结核抗体诊断技术。
结论 CPA检测技术与罗氏培养的检测结果相似，但方法简便、快速，可用于疑似结核患者的快速诊断。
【关键词】结核分枝杆菌;交叉引物恒温扩增;回顾性分析中图分类号 R521 文献标识码 A 文章编号 1671-0223（2022）17--02结核病是一种慢性传染病，由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起。
2020年我國估计的结核病新患病人数为84.2万，估算的结核病发病率为59/10万，在结核病高负担国家中结核病新患病人数仅低于印度[1]，结核病的防治依然严峻。
为了能有效防治结核病，需要在疾病早期能够有一种检测技术可以快速地检测并诊断出MTB。
传统的检测方法是从临床标本中（主要是痰液）经过抗酸染色或者培养来鉴定MTB，但它们各自都有优缺点。
随着检测技术不断发展，MTB的分子学检测技术得到广泛的应用。
交叉引物恒温扩增法（crossing-primeramplification，CPA）检测技术是其中一种快速分子诊断方法，它检测的是结核杆菌复合群特异性的IS16110序列。
在恒温条件下，可以一次性进行基因片段的特异性扩增和杂交，然后在密闭的一次性核酸检测装置中使用免疫层析技术，定性检测特异性扩增产物，是中国自主创新的技术[2]。
技术丨搞定恒温扩增分子诊断（RPARAA）
技术丨搞定恒温扩增分子诊断（RPARAA）展开全文2020-9-14|编辑: 归去来兮|查看: 114|评论: 0|来源: IVD学习笔记 | 作者：iAnny摘要: 分子诊断技术今日不同以往，着实借力突飞猛进，恒温扩增技术由于其扩增期间不需要特殊的仪器设备而更受瞩目。
恒温扩增方法有多种，今天就回顾RPA/RAA，让大家一文通俗搞定~~嗯啊, 如果有疑问，决定开小灶，包会！哈 ...分子诊断技术今日不同以往，着实借力突飞猛进，恒温扩增技术由于其扩增期间不需要特殊的仪器设备而更受瞩目。
恒温扩增方法有多种，今天就回顾RPA/RAA，让大家一文通俗搞定~~嗯啊, 如果有疑问，决定开小灶，包会！哈哈~~为了确保大家所认知的基本概念是一致的，请先了解以下名词解释•重组酶聚合酶扩增技术，RPA, recombinase polymerase amplification•重组酶介导的扩增技术，RAA, recombinase-aidamplification •重组酶，recombinase，同引物形成蛋白-核酸复合物，指导引物与模板结合，起到定位作用；帮助DNA 模板的解链和促使模板与引物之间发生链替换。
•单链DNA结合蛋白，SSB, single stranded DNA binding。
同置换出来的单链DNA结合，防止DAN配对两条链再次结合。
•DNA聚合酶，DNA polymerase，以DNA为模板，利用dNTP 合成子代DNA。
•核酸内切酶，endonuclease，可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸。
•Nfo，来源于细菌的核酸内切酶，且更倾向于作用于3′凹末端的双链DNA，参与DNA损伤修复。
RPA和RAA的工作原理相同点：•3种关键酶或蛋白：重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶；•在37℃恒温下进行核酸快速扩增；唯一不同点：酶的来源不同，推测主要时因为专利限制问题。
•RPA的重组酶来源于T4噬菌体；•RAA的重组酶来源于细菌或者真菌。
PCR基因扩增原理
PCR 基因扩增实验原理﹑仪器试剂和操作步骤实验原理：PCR(Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列。
其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。
这种延伸—变性—退火—延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。
1.变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。
2.退火：使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.3.延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA 聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向复制出互补DNA上述3 步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。
影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。
引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。
现将几种主要影响因素介绍如下。
一、温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。
如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。
交叉引物恒温扩增技术在结核分枝杆菌检测中的应用
交叉引物恒温扩增技术在结核分枝杆菌检测中的应用毛秀军;李世明;葛晓励;张国强;孙绍秋;王惠良【摘要】目的：探讨交叉引物扩增技术（CPA）快速检测系统在结核病诊断中的价值。
方法收集唐山市第四医院2015年3～5月206例结核病就诊患者的痰液标本，其中肺结核患者95例（其中痰涂片阳性26例，阴性69例），非结核患者111例，分别采用RT‐PCR法实时荧光定量聚合酶链反应法（RT‐PCR）检测标本中的结核分枝杆菌，对结果进行统计分析。
结果涂片法、罗氏培养法、EasyNAT ® TB‐CPA 法检测初诊疑似肺结核患者痰液的灵敏度分别为：27．37％（26／95）、50．53％（48／95）、56．84％（54／95）、51．58％（49／95）。
以罗氏培养结果为诊断金标准，EasyNAT ® TB‐CPA 法灵敏度为89．58％（43／48），特异度94．94％（150／158）；RT‐PCR法的灵敏度为83．33％（40／48），特异度94．30％（149／158）；EasyNAT ® TB‐CPA与RT‐PCR法相比，总体一致性为98．54％（203／206）， Kappa指数值为0．92。
结论TB‐CPA法在检测痰液标本中具有较高的临床应用价值，且方法简便、快速。
【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2016(013)008【总页数】3页(P1107-1109)【关键词】结核分枝杆菌;恒温扩增;培养法;交叉引物扩增技术【作者】毛秀军;李世明;葛晓励;张国强;孙绍秋;王惠良【作者单位】河北省唐山市第四医院 063001;河北省唐山市第四医院 063001;华北理工大学附属医院，河北唐山 063009;河北省唐山市中心血站 063000;河北省唐山市中心血站 063000;河北省唐山市滦南县医院 063500【正文语种】中文结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，是全球最具威胁的传染病之一。
实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价
.158-微F物与感染Journal of Microbes and Infctons#June25,2020,15(3)：158-165http：/i .cddoi：10.3969/j.issn.1673-6184.2020.03.004•论著・实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价黄晨璐1,许伟1,胡乾坤1,张小楠1,李强1,黄玉仙12,陈良11.复旦大学附属公共卫生临床中心，上海201508；2.复旦大学附属华山医院感染科，上海200040摘要:为评价实时荧光核酸恒温扩增试验(simultaneous amplification testing,SAT)与定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测血清样本中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)RNA的相关性与一致性，本研究收集了在复旦大学附属公共卫生临床中心就诊的212例患者的血清样本，其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者HBV DNA(100IU/mL81例、HBV DNA V100IU/mL76例，以及作为对照的非HBV感染患者55例。
采用SAT和qRT-PCR方法分别检测所有血清样本中的HBV RNA,对检测结果进行统计学分析。
在HBV DNA(100IU/mL的CHB患者中，SAT和qRT-PCR的HBV RNA阳性检出率均为95.06%(77/81)*2种方法具有较好的相关性与一致性(R2=0.803和CCC=0.882)。
Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.1log copies/mL,相对偏倚为0.97%。
配对t检验显示，结果无统计学差异(t=1.617,P=0.110)。
在HBV DNA V100IU/mL的CHB患者血清样本中，HBV RNA阳性检出率不同，SAT为98.68%(75/76),qRT-PCR为8&16%(67/76),2种方法相关性与一致性较差(R2=0.326和CCC=0.438)。
新冠病毒有几种检测方法
新冠病毒有几种检测方法新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19），世界卫生组织命名为“2019冠状病毒病”，简称新冠病毒，其有一定的潜伏期，通常在1-14天左右，大多3-7天出现发热、咳嗽、乏力等明显症状。
还有一些病人伴有腹泻、鼻塞与咽喉痛，如果病人症状严重，患病一周后产生低氧血症，呼吸困难等，极有可能引起急性呼吸窘迫症，那么新冠病毒有哪些检测方法？一、核酸检测核酸检测是新冠病毒检测的金标准，其显著特点是早期诊断准确率、灵敏度和特异性均较高，可证明患者体内是否存在新冠病毒感染。
疫情发生早期，主要采用核酸检测，为疑似患者进行检查诊断，若得到阳性结果，便确诊为新冠病毒感染。
核酸检测是利用一段包含新冠病毒信息的探针对患者样本中的核酸进行搜寻，一旦搜寻到，检测系统就会出现阳性结果以提示检验医生，说明可能存在新冠病毒感染；如果搜寻没有任何异常，说明可能无新冠病毒感染，检测系统也会呈现阴性结果。
核酸检测时结果不是百分百准确，要想提高结果的准确性，多数情况是采取两个探针进行搜寻。
核酸检测的过程包括采样、灭活、核酸提取、上机检测，自采样到出报告约6个多小时。
现今，新冠病毒的核酸检测方法包括PCR法、恒温扩增法、测序法和CRISPR检测法等，主要如下：1）PCR法。
具体指聚合酶链式反应，是扩增待测样本核酸的一种方法。
第二代PCR技术还称为荧光PCR法，主要是将荧光物质加入反应体系，利用专业设备进行荧光检测，通过定量方法计算模板。
这是普遍使用的核酸检测方法，一般在2-3小时后获得检测结果。
2）恒温扩增法。
该方法不需要改变样本温度，具体包括2类技术，一类省略了PCR高温解链环节，能合理应用特殊酶，如在LAMP技术中链置换DNA聚合酶与RPA重组酶、单链结合蛋白与链置换酶；另一类在DNA和RNA间进行转换以实现扩增，如NASBA和TMA均应用逆转录酶与RNA聚合酶。
恒温装置用在基层医疗机构进行扩增与层析检测，不会被场景环境限制。
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本产品可作为恒温荧光扩增反应中的荧光指示剂，可根据颜色变化肉眼判断结果。
24测试/盒
DASR06
RNA扩增试剂盒
（恒温扩增法）
本试剂盒为细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体核酸(RNA)的恒温扩增通用试剂盒，集逆转录与核酸扩增于一体，20-60 min完成整个检测过程，同时有多种检测方式。
24测试/盒
产品编号
产品名称
产品说明
规格
R101S/L
通用名称：DNA扩增试剂盒
（恒温扩增法）
本试剂盒为细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体核酸（DNA）的恒温扩增通用试剂盒，20-60 min完成整个检测过程，同时有多种检测方式。
24/96测试/盒
二、详细信息
技术原理
恒温荧光检测技术
本试剂盒采用恒温荧光检测技术，通过Bst聚合酶及特异性引物在等温条件下对样本中的目的片段进行特异性扩增，结合核酸染料或检测仪器使用，通过反应液颜色的变化或者相关仪器判断结果。
2. 特异性高：利用多条引物扩增目的基因的特异区域，确保扩增的准确性；
3. 灵敏度高：最低可检测出1个拷贝的基因。
相关实验图片展示
其它图片
图1荧光指示剂（钙黄绿素）颜色变化图
图2荧光指示剂（钙黄绿素）检测(ESE Tube Scanner)
三、相关产品
产品编号
产品名称
产品说明
规格
DRSR03
荧光指示剂
检测样品类型
人源性、动植物源性病原体及其他细菌、真菌、病毒、寄生虫等的核酸。
反应条件
反应温度：63℃；
反应时间：20 ~60min；
反应仪器：恒温金属浴/ESE Tube Scanner/荧光PCR仪/Genie II/品特点
1. 方便快捷：将反应液、酶、引物等混合均匀，20~60min便可观察结果；
一、技术原理
1. 产品描述
本公司生产的DNA扩增试剂盒可用于人源性、动植物源性病原体及其他细菌、真菌、病毒、寄生虫等核酸的快速扩增。本试剂盒通过Bst聚合酶、四种核苷酸单体（dNTPs）、引物等成分的作用，在恒温条件下（60～65℃）快速、特异地完成核酸扩增，并可借助显色液或相关仪器直接判断结果。
2. 产品规格