医学免疫学实验五 流式细胞术检测免疫细胞表面标记
临床分析利用流式细胞术鉴定免疫系统异常
临床分析利用流式细胞术鉴定免疫系统异常免疫系统是人体重要的防御机制，负责抵御各类病原体的入侵和维护内环境的稳定。
但有时候，免疫系统可能出现异常，导致各类疾病的发生。
为了准确诊断和治疗免疫系统异常，临床医生常常会利用流式细胞术进行分析。
本文将介绍流式细胞术在免疫系统异常鉴定中的应用及其重要性。
一、流式细胞术简介流式细胞术是一种通过分析单个细胞的形态、表面标记物及分子水平的技术。
它基于细胞在流式细胞仪中以单个细胞为单位通过激光束的原理，通过激发荧光染料和细胞表面抗原的结合来鉴定和定量细胞的特定标记物。
流式细胞术具有高通量、高灵敏度和多参数的特点，因此成为了免疫学研究和临床诊断中的重要工具。
二、流式细胞术在免疫系统异常鉴定中的应用1. 免疫细胞亚群分析通过流式细胞术可以对免疫系统中的不同亚群细胞进行鉴定并进行计数。
比如，淋巴细胞亚群中的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞在机体的免疫应答中发挥重要作用。
通过流式细胞术，可以准确计算不同亚群细胞的比例，发现其中的异常情况。
2. 细胞膜受体表达分析流式细胞术可以分析细胞表面的受体表达情况，通过检测特定抗体和荧光染料结合的情况，确定免疫细胞受体的表达水平。
例如，通过检测CD25和CD127的表达，可以辨别调节性T细胞和效应性T细胞的比例，从而判断机体免疫应答的状态。
3. 免疫细胞功能分析除了表面标记物的分析，流式细胞术还可以评估细胞的功能状态。
通过检测细胞的细胞因子分泌和细胞凋亡情况，可以确定免疫细胞的活性和功能。
这对于鉴定免疫系统异常非常重要，因为某些疾病可能导致免疫细胞功能的异常改变。
三、流式细胞术在免疫系统异常鉴定中的重要性流式细胞术作为一种高灵敏度和高特异性的技术，对于免疫系统异常的鉴定至关重要。
它可以帮助医生确定疾病的类型、分期和风险等信息，为定制个体化的治疗方案提供支持。
同时，流式细胞术还可以监测治疗效果、预测预后和评估疫苗免疫应答等方面起到重要的辅助作用。
临床免疫学和免疫检验第十四章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术讲义
临床免疫学和免疫检验第十四章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术讲义第十四章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术第一节免疫细胞的分离一、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间，因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。
分离介质是分离各类细胞的关键，对分离介质的基本要求是：①对细胞无毒；②基本等渗；③不溶于血浆及分离物质；④有特定的比重。
Ficoll分离液为常规的淋巴细胞分离液，其比重为1.077±0.002，主要用于分离外周血中单个核细胞。
其分布由上到下依次为：稀释的血浆层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。
二、淋巴细胞的分离纯淋巴细胞群的采集是利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动黏附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。
主要的方法有：1.黏附贴壁法；2.吸附柱过滤法；3.磁铁吸引法；4.Percoll分离液法。
三、T、B细胞和T细胞亚群的分离（一）磁性微球分离法（二）荧光激活细胞分离仪分离法四、分离细胞的保存及活力测定1.短期保存技术：将分离的细胞用适量含10%～20%灭活小牛血清的Hanks、T c-199、RPMI1640或其他培养液稀释重悬。
短期保存可置于4℃保存。
2.长期保存技术：液氮深低温（-196℃）环境保存细胞，加入二甲亚砜作为保护剂。
活力测定最简便常用的为台盼蓝染色法。
这是一种阴离子型染料，不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。
流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种利用流式细胞仪对细胞或其他生物颗粒进行快速、多参数、定量分析和分选的技术。
在免疫学领域，流式细胞术具有广泛的应用，为免疫学家提供了一种强大的研究工具。
1. 免疫细胞分型和计数：流式细胞术可以通过标记抗体与细胞表面或内部的特定抗原结合，从而对不同类型的免疫细胞进行分类和计数。
这对于监测免疫系统的状态、研究免疫疾病以及评估免疫治疗效果非常重要。
2. 细胞活化和功能分析：流式细胞术可以检测细胞表面标志物的表达水平，从而评估免疫细胞的活化状态和功能。
例如，通过检测 CD69、CD25 等活化标志物的表达，可以研究T 细胞的活化；通过检测细胞因子的表达，可以分析 Th1、Th2、Th17 等不同类型的 T 细胞亚群。
3. 免疫细胞凋亡检测：流式细胞术可以通过 Annexin V/PI 双染色法等技术，检测免疫细胞的凋亡情况。
这对于研究免疫细胞的生存和死亡调节机制、评估药物对免疫细胞的影响以及探讨免疫相关疾病的发病机制具有重要意义。
4. 免疫细胞分选：流式细胞仪可以根据细胞的物理或生物学特性，将目标细胞从混合细胞群体中分离出来。
这一技术在细胞培养、基因转染、单细胞分析等方面具有重要应用。
5. 高通量筛选：流式细胞术可以同时分析大量样本，实现高通量筛选。
这对于药物筛选、抗体发现以及寻找新的免疫治疗靶点等研究具有重要价值。
总之，流式细胞术在免疫学中的应用非常广泛，为深入了解免疫系统的结构和功能、探索免疫相关疾病的发病机制以及开发新型免疫治疗策略提供了重要的技术支持。
流式细胞术鉴定超微量免疫细胞样本
EDTA 4-8度（RT）
更加稳定
结果 3
确定可用于检测的最小血样体积
40,20,10ul: 差异性 <10%
பைடு நூலகம்
8000 6000 3500 2000
5ul:
每次取样，单核细胞分亚 型检测时差异大
单核细胞总量: CD115+ 经典单核细胞: CD115+ Gr-1high 非经典单核细胞: CD115+ Gr-1low
CD11b:
6.5% 降低
结果 2
鉴定单核细胞表面标记CD115的稳定性 --B:不同的激光强度
easyCyte Mini: 20mW
easyCyte 6HT-2L: 40mW
更强的激光强度，更高的 gMFI 但信号的降低程度一致 (33%)
结果 2
鉴定单核细胞表面标记CD115的稳定性 --B:不同的抗凝剂
实验 3: 确定可用于检测的最小血样体积(40ul、20ul、10ul、5ul)
结果 1
比较小鼠单核细胞的表面标记 （CD115 vs CD11b，CD14）
95% CD115阳性细胞: 共表达CD11b+ 85% CD115阳性细胞: 共表达CD14+
如以CD115选取细胞群 CD11b及CD14阳性率 差异小
背景介绍
纵向小鼠模型（非致死）:
重要性：可用于预测疾病风险的增加，纵向评估病情的进展 需求：观察小鼠模型个体在外界刺激或者药物反应中的长期变化 困难：每次可采集的小鼠血液样本体积非常小
小鼠单核细胞标记(占血液中细胞总数<3%)
1. CD11b: 表达在多种细胞表面
常用
（髓样细胞，NK细胞， 活化的T细胞，B细胞 ）
流式细胞术在免疫学研究中的应用
流式细胞术在免疫学研究中的应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对细胞进行自动分析和分选的技术。
它可以快速、准确地测量细胞的物理和化学性质，如大小、形状、表面标志物、核酸含量等。
在免疫学研究中，流式细胞术已经成为了一种重要的研究工具，广泛应用于免疫细胞的分型、功能和活化状态的检测等方面。
1. 免疫细胞分型：流式细胞术可以通过检测细胞表面标志物的表达，对免疫细胞进行分型。
例如，可以通过检测 CD4 和 CD8 分子的表达，将 T 细胞分为辅助性 T 细胞（CD4+）和杀伤性 T 细胞（CD8+）；通过检测 CD19 分子的表达，将 B 细胞分为 B1 和 B2 细胞等。
2. 免疫细胞功能检测：流式细胞术可以通过检测细胞内的分子，如细胞因子、活性氧等，来评估免疫细胞的功能。
例如，可以通过检测细胞内的干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达，来评估 T 细胞的活化状态和功能。
3. 免疫细胞活化状态检测：流式细胞术可以通过检测细胞表面标志物的表达和细胞内的分子，来评估免疫细胞的活化状态。
例如，可以通过检测 CD69 和 HLA-DR 分子的表达，来评估 T 细胞的早期活化状态；通过检测 CD25 和 FoxP3 分子的表达，来评估调节性 T 细胞（Treg）的活化状态。
4. 免疫细胞分选：流式细胞术可以根据细胞的物理和化学性质，对细胞进行分选。
例如，可以通过分选 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞，来进行 T 细胞的功能研究；通过分选调节性 T 细胞（Treg），来进行 Treg 细胞的功能研究等。
总之，流式细胞术在免疫学研究中具有重要的应用价值，可以帮助我们更好地了解免疫细胞的分型、功能和活化状态，为免疫学研究提供了有力的技术支持。
细胞生物学中的细胞表面标记和检测技术
细胞生物学中的细胞表面标记和检测技术细胞表面标记和检测技术在细胞生物学研究中起到了重要的作用。
通过对细胞表面标记的引入或检测，我们可以了解细胞表面的组成、结构和功能，进而深入研究细胞的生理和病理过程。
本文将从细胞表面标记的概念、常用的细胞表面标记技术和细胞表面检测技术三个方面展开探讨，带领读者一窥细胞生物学领域中的前沿技术。
一、细胞表面标记的概念细胞表面标记是指通过特定的荧光探针、抗体或其他化合物，将目标蛋白、细胞器或其他分子与荧光分子或颜色物质结合，从而在细胞表面或内部形成特定的可视化标记。
这种标记使得研究人员可以直观地观察细胞和分子的空间分布以及相互作用关系，为细胞生物学的研究提供了便利。
二、常用的细胞表面标记技术1. 免疫染色技术免疫染色技术是利用抗体与目标蛋白或分子结合的特异性，在细胞表面形成可视化标记。
这种技术主要包括直接免疫荧光染色和间接免疫荧光染色两种方法。
直接免疫荧光染色直接将荧光探针与特异性抗体结合，间接免疫荧光染色通过首先结合一种主抗体，然后与特异性抗体结合形成荧光标记。
这些技术广泛应用于细胞免疫学研究和细胞分析。
2. 荧光探针技术荧光探针技术是利用荧光成像技术直接将特定的荧光分子引入细胞内部或细胞表面，并通过荧光显微镜观察标记物的分布和行为。
主要的荧光探针包括荧光染料、荧光蛋白和量子点。
它们可以标记蛋白、核酸、糖类等细胞内各种分子，通过对不同荧光探针组合和观察条件的选用，可以实现对复杂细胞系统的精确标记。
三、细胞表面检测技术1. 流式细胞术流式细胞术是一种基于细胞表面标记的高通量细胞分析技术。
它通过将细胞悬浮于生理盐液中，利用流式细胞术仪器对细胞进行检测。
细胞在仪器中以单个细胞的形式通过激光束，然后通过细胞表面标记物的荧光信号识别细胞类型、数量和功能状态。
这种技术广泛应用于细胞免疫学、肿瘤学以及干细胞研究等领域。
2. 切片免疫荧光技术切片免疫荧光技术是在组织切片上进行的细胞表面标记和检测技术。
流式细胞术在成熟淋巴细胞肿瘤诊断中的应用
01 引言
03 参考内容
目录
02 实验方法
引言
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在医学领域中广泛应用的技术， 具有高效、快速、敏感等优点。它通过将细胞悬浮在流水中，并利用特定的抗体 对细胞进行标记，从而对细胞进行种类、功能等方面的分析和检测。在淋巴细胞 肿瘤诊断中，流式细胞术能够通过对成熟淋巴细胞的表面标志物进行检测，为临 床提供更准确、更快速的诊断结果。
参考内容三
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测细胞特性的 技术。它已经成为免疫学研究中的重要工具，并被广泛应用于免疫细胞的分型、 功能和活性测量。
1、细胞分型：流式细胞术可以用来对免疫细胞进行精细的分型。通过使用 不同的抗体标记，可以识别和区分各种类型的淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细 胞等。同时，对于细胞亚群的识别和计数，流式细胞术也具有高灵敏度和高精度 性。
4、疾病诊断：流式细胞术在免疫学中的应用也扩展到了临床诊断。例如， 流式细胞术可以用来检测自身免疫疾病、癌症和感染等疾病中的异常免疫反应。
5、疫苗开发：流式细胞术可以帮助科学家们研究免疫反应的机制，从而为 疫苗开发提供重要的信息。例如，通过流式细胞术，科学家们可以跟踪疫苗接种 后免疫细胞的反应，以便优化疫苗设计和接种方案。
1、免疫分型：流式细胞术能够通过对细胞表面抗原的检测，对淋巴细胞、 白血病、骨髓瘤等免疫相关疾病进行分型和诊断。例如，通过检测T细胞亚群的 分布和功能，可以对自身免疫性疾病、感染性疾病等进行诊断和鉴别诊断。
2、感染诊断：流式细胞术能够快速准确地检测病毒、细菌和其他微生物等 感染引起的特异性免疫反应。例如，通过检测抗原特异性抗体水平，可以快速诊 断流感、肺炎等感染性疾病。
流式细胞术的原理与应用
流式细胞术的原理与应用流式细胞术（Flow Cytometry）是一种能够对单个细胞进行分析和计数的技术，利用激光器激发细胞和细胞表面染色的标记物，然后根据细胞的标记物特性和光散射模式对细胞进行分类和计数。
流式细胞术的原理和应用十分广泛，本文将详细介绍。
流式细胞术的原理基于光散射和荧光信号的检测。
通过细胞标记物的选择和荧光染料的使用，可以在流式细胞仪中同时检测多种参数，例如细胞的大小、颜色、表面标记物和内部成分。
一般流式细胞术仪器包括激光器、光散射仪、荧光仪和计算机等。
1.免疫细胞表型分析：流式细胞术可以对免疫细胞进行表面标记物的检测，用于免疫细胞亚群的鉴定和分类。
通过体外标记和免疫荧光染色，可以检测和分析淋巴细胞、单核细胞、粒细胞等免疫细胞的表面标记物，了解细胞的分泌、激活状态和表型特征。
2.微生物学研究：流式细胞术可以用于微生物学研究，例如对细菌、酵母和微藻等微生物进行分选和分析。
通过将细菌或其他微生物染色，可以检测其不同的生长阶段和表型特征，了解微生物的组成和功能。
3.细胞周期和凋亡分析：流式细胞术可以通过核酸染料对DNA含量进行检测，从而分析细胞的周期和凋亡状态。
通过检测细胞的DNA含量，可以判断细胞的增殖能力、凋亡率和细胞周期进程，研究细胞的分裂和生长机制。
4.细胞分选和克隆：流式细胞术可以通过荧光标记物对特定细胞进行分选和克隆。
通过在细胞上标记特定的抗体或其他荧光物质，并结合流式细胞术的细胞分选功能，可以分选和获取特定细胞亚群，用于进一步研究和培养。
5.肿瘤学研究：流式细胞术可以对肿瘤细胞进行分析和分类，了解肿瘤细胞的亚群及不同细胞的表型特征。
通过标记特定的抗体和荧光染料，在流式细胞仪中对肿瘤细胞进行分选和分析，可以研究肿瘤的发生机制、转移机制和治疗反应。
流式细胞术作为一种高通量的单细胞分析方法，在生物医学研究、免疫学、癌症研究等领域有着广泛的应用。
它可以提供大量的细胞分析数据，用于研究生物学过程、细胞功能、免疫响应和疾病发展。
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实验目的
1 了解BD FACS Verse的流式细胞术 2 学习并掌握FCM 的原理 3了解FCM 的运用 4 简单运用FCM检测免疫细胞特性
✓ Introduction FCM Principles FCM Applications
Introduction
BD是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于
BD Introduction FCM Principles ✓ FCM Applications
Flow Cytometry Applications Flow Cytometry Applications
• 细胞结构
• • 细胞大小 • • 细胞颗粒度 量与细 胞周 期
利用优化的缓冲液和抗体借 助 流式细胞仪检测转录因子 表达
用流式细胞仪分选细胞或 检测细胞表面蛋白表达
用 BD Phosflow 抗 体 检测关键蛋白的磷酸化水平
用 ELlSA或 ELISPOT方 法 检 测
分泌的细胞因子
..，.---\1 用 流 式 细 胞 仪 检 测 特 异 细 胞 胞内细胞因子表达
1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。
Maxwell W. Becton
Fairlegh S. Dickinson
经过一百多年的发展，BD已成为世界上最大的医疗技术及医
疗设备公司之一，它以领先的技术、卓越的产品质量和诚实可
信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛赞誉。
BD Introduction ✓ FCM Principles
Flow Cytometry Principles
某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比 照射光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧 光的物质称为荧光素
单参数荧光直方图
双参数荧光散点图
流式细胞术操作流程
样本收集及处理 制备单细胞悬液 免疫荧光染色
上机检测 数据分析
Flow Cytometry Principles
FCM Applications
Flow Cytometry Principles
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种快速、准确、客观
的同时检测直线流动状态中单个细胞多项物理及生物学特性，加以分析定 量的技术。
检测速度快，分析样本量大在极短时间内可分析大量细胞，这
是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速 率进行测量。
了解荧光染料及其工作原理，做出准确的选择。 1）小分子化合物：FITC, Pacific Blue 2）大分子荧光蛋白： PerCP, PE, APC 3）串联染料：PE-Cy5, PerCP-Cy5.5
BD Fluorescence Spectrum Viewer A Multicolor Tool
Flow Cytometry Principles
了解目标抗原 1）细胞表面抗原 2）细胞内或是核内抗原（固定、透膜步骤） 3）以上两者兼备。先标记表面抗原，固定后，破膜 标记胞内抗原。 4）细胞内细胞因子的测定。使用细胞内蛋白分泌抑 制剂，如monensin、BFA，使得细胞因子不能分泌 到细胞外。（活化、固定、透膜）
•• " •
-
、 用BD CBA技 术 同 时 检 测 分泌到胞外的多种细胞因子
Flow Cytometry Applications
细胞周期 & 倍体分析
M G2
G0
G1
s
Journal of Molecular Signaling 2011, 6:13
Flow Cytometry Applications
• RNA含量 • • 蛋白质含量 • • ……
细胞功能
• 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 • 细胞活性 • 细胞内/外的细胞因子 • 激素结合位点、细胞受体 • 蛋白磷酸化 • pH值 • 钙离子浓度 • 细胞膜电位、线粒体膜电位 • ……
用 BrdU. Annexin V 和其他方法检测 增殖和凋亡
Flow Cytometry Principles
Laser
侧向角散射光（SSC）
FALS Sensor
90LS Sensor
与激光束垂直的称为侧向角散射光信号（SSC）。SSC一般表 征细胞粒度及细胞内相对复杂性。
Flow Cytometry Principles
散射光信号，散点图 (Dot Plot)
—PE渗漏到FITC通道的信号 FL1-x%FL2 —FITC渗漏到PE通道的信号 FL2-x%FL1
Flow Cytometry Principles
在双色染色的实验中 （1）先用阴性管调电压 阴性管：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE （2）再用单染管调补偿 单染管：细胞+抗体A FITC or 抗体B PE
100
80
60
40
20
0
300
350
400
4 5口
500
550
600
650
700
750
800
850
900
W avelength(nm)
BD
Flow Cytometry Principles
荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠 正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一 个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号
可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织，
悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。
BD
Flow Cytometry Principles
前向角散射光（FSC）
Laser
FALS Sensor
当激光束通过聚集的细胞颗粒时，激光向各个方向散射。与激 光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。FSC一般表征 细胞相对大小及其表面积。
荧光素的激发和发射光谱
激发光谱（Excitation，Ex） - 是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的 光线，也称为吸收光谱。 - 我们一般标注的是吸收波峰，也就是最大吸收波长： Ex-Max
发射光谱（Emission，Em） - 是指荧光素发射的一定波长范围内的荧光。所有荧光 都是宽谱发射。 - 一般标注的是发射波峰，即最大发射波长：Em-Max