载体构建经验
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体构建是基因工程领域中非常重要的一项技术，它可以用来将特定的基因插入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。
在科学研究、医学诊断和治疗等领域中都有广泛的应用。
下面我们来详细介绍一下重组载体构建的方法和步骤。
一、选择载体首先我们需要选择一个适合的载体作为基础，常见的载体有质粒、病毒、原核生物等。
在选择载体时需要考虑载体的大小和特性，以及目标基因的大小和需要表达的水平。
同时还需要考虑载体的复制原点、抗生素抗性基因等相关元件。
二、线性化载体接下来我们需要将选择的载体进行线性化处理，以便将目标基因插入到载体中。
线性化可以通过受控的限制酶酶切处理来实现，将载体的环状DNA骨架切割成线性DNA片段。
三、插入目标基因将目标基因与线性化的载体进行连接。
目前常用的方法包括：内切酶切割连接法、PCR扩增连接法、接头连接法等。
这些方法可以有效地将目标基因插入到载体中，并确保插入的正确性和稳定性。
四、转化目标宿主将构建好的重组载体导入到目标宿主细胞中，使其稳定地存在和复制。
转化的方法多样，包括热激转化、电穿孔转化、化学法转化等。
转化效率和载体稳定性是评价转化效果的主要因素。
五、筛选重组子对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目标基因的重组子。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、酵素检测等。
筛选过程中需要注意筛选压力和筛选条件的优化，以提高筛选效率。
六、鉴定重组子对筛选出的重组子进行鉴定，确保其构建正确。
常用的鉴定方法包括PCR扩增、酶切鉴定、序列分析等。
通过这些方法可以验证重组子的结构和功能是否正确，确保后续实验的准确性和可靠性。
七、表达目标基因对鉴定合格的重组子进行表达。
通过选用适当的启动子和调控元件，可以实现目标基因的高效表达。
表达的方法有多种选择，包括转染法、感染法、转基因法等。
表达的效果可以通过荧光显微镜观察、酶活性测定、Western blot等方法进行检测和验证。
载体构建注意事项
载体构建注意事项
在构建载体时，需要注意以下事项：
1. 定义明确的目标：在构建载体之前，应该先确定清楚载体的目标和用途。
明确的目标可以帮助对载体的设计和功能进行有针对性的构建。
2. 考虑用户体验：载体的设计应该以用户体验为中心。
要考虑用户的需求和使用习惯，确保载体的使用过程简便、方便，并能提供良好的用户体验。
3. 考虑可持续性：在构建载体时，应考虑其可持续性。
要选择使用环保材料，尽量减少资源的消耗和废弃物的产生，并且设计载体的寿命较长，能够多次使用。
4. 适应不同环境和场景：载体的设计应该能够适应不同的环境和场景。
要考虑不同的使用场景，例如室内、室外、高温、低温等，并根据需要进行相应的设计和改进。
5. 考虑安全性和保护性：载体的设计应该考虑安全性和保护性。
要确保载体的结构稳固，材料耐用，能够保护所携带的物品免受损坏，并能提供必要的保护措施，例如防水、防潮、防尘等。
6. 保持简洁和清晰：载体的设计应该保持简洁和清晰。
要避免过于复杂的结构和装饰，使得载体的功能和使用方法能够一目了然，并且方便使用者进行操作和掌握。
7. 注重创新和差异化：在构建载体时，可以注重创新和差异化的设计。
要寻找新颖的设计理念和方式，使得载体能够与众不同，并具有竞争力。
总之，在构建载体时，需要考虑目标、用户体验、可持续性、适应性、安全性、简洁性以及创新性和差异化。
这些注意事项可以帮助构建出功能强大、实用性高、用户满意度高的载体。
载体构建的原理及方法
载体构建的原理及方法
构建空间载体的原理及方法
一、基本原理
1、空间载体指的是能够携带、分配和转换信息的空间物体，可以将物理性能及计算机性能有效整合，进而实现数字与空间信息的融合，改变传统空间计算的构建方式，提高智能化水平，构建具有计算、存储和传输能力的空间系统。
2、空间载体的建构需要涉及到计算机软件、固体件和结构系统，而且各个领域不同，其构建即需考虑这些各种领域以及它们之间的耦合关系，以及服务体系结构、过程完整性、持续性等要素，实现价格、质量和效率协调综合利益最大化。
二、构建方法
1、软件设计
首先，软件设计是建构空间载体的重要环节，应该根据系统的需求特性，选择合适的架构设计，其中应包含各种功能模块的搭建、服务的封装、调用的接入以及模块之间的精心设计。
2、硬件设计
其次，空间载体的硬件设计也相当重要，通常包括硬件组件的搭建、驱动功能的设计和配置建立以及通信模块的配置，以此实现基于现有硬件设备的实体构建，使之达到最佳的可拓展性、可弹性扩展性以及故障检测和防御能力。
3、系统服务
系统服务是构建空间载体的核心，通常要包含空间服务、计算服务和通信服务，以及可靠性、安全性等服务，在这一环节需要确定各种服务细节，在确定之后可以根据模块分工，完善各种服务细节，从而顺利完成整个系统的建构。
4、联合优化
最后，联合优化应作为构建空间载体的最后重要环节，要在各个领域的计算、存储等资源进行综合优化，从而获得可靠性最高、计算能力最大、实现统一优化目标的服务框架，使得服务能够在满足系统特性要求的同时，达到客户对服务的期望。
载体构建注意事项
载体构建注意事项载体是指承载信息或物质的媒介或工具，在不同领域具有不同的含义。
无论是建筑、电子设备还是传媒，载体的选择和构建都是非常重要的。
本文将从不同领域的角度，总结一些载体构建的注意事项，帮助读者更好地进行相关工作。
一、建筑领域的载体构建注意事项1. 结构稳定性：在建筑设计和施工过程中，要确保载体的结构稳定，能够承受所要承载的重量和力量。
合理选择结构材料和采用适当的支撑结构是关键。
2. 防水防潮：对于建筑物来说，防水防潮是非常重要的。
在载体的构建过程中，要考虑到地下水位、降雨量等因素，采用防水材料和施工工艺，以确保建筑物的持久性和安全性。
3. 绝缘隔热：在一些特定的环境和气候条件下，建筑物需要具备较好的绝缘隔热性能。
选择适当的材料和构建方法，可以提高建筑物的能源利用效率，减少能源浪费。
二、电子设备领域的载体构建注意事项1. PCB设计：在电子设备的制造过程中，印刷电路板（PCB）是重要的载体。
在设计PCB时，要考虑到电路的布局、信号传输、电源供应等因素，保证电子设备的正常运行。
2. 散热设计：电子设备在工作过程中会产生热量，如果不能及时散热，会导致设备损坏。
因此，在载体的构建过程中，要合理设计散热结构和通风系统，保持设备的正常工作温度。
3. 电磁兼容性：电子设备之间会相互干扰，影响设备的正常运行。
在构建电子设备的载体时，要注意减少电磁辐射和提高电磁屏蔽能力，保证设备的稳定性和可靠性。
三、传媒领域的载体构建注意事项1. 媒体选择：在传媒领域，选择合适的载体是非常重要的。
不同的媒体有不同的特点和受众群体，要根据传播的目的和对象选择合适的媒体载体，以达到最好的传播效果。
2. 内容适配：在进行传媒工作时，要注意将内容与载体进行适配。
不同的载体有不同的呈现方式和传播特点，要根据载体的特点进行内容的编排和呈现，提高信息的传递效果。
3. 传播渠道：传媒工作需要选择合适的传播渠道。
要根据受众的特点和传播目的，选择适合的传播渠道，如电视、广播、网络等，以实现信息的最大覆盖和传播效果。
质粒构建中 DNA片段与载体连接的经验
在排除了其他问题后，我做了摩尔比的调整，需要做OD260的测量。
不要怕浪费回收的载体和片段因为实际用量非常少，看了下面我们的实验实例就知道了。
摩尔比是指载体和插入片段，在连接时的摩尔比。
1 比例应该在1:2-6之间（载体：片段；片段要多）。
2 连接体系如果是20微升，载体和片段的总质量（微克）要在0.02微克~0.2微克之间。
如果是10微升，则在0.01~0.1微克之间。
我一般都用到接近上限。
3 EDTA不能太多。
否则可能影响连接酶。
附加：如何计算摩尔数和微克数（用20微升的链接体系，NEB的T4 DNA ligase）公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数实例：片段大小=555bp=0.555kb，浓度=0.19微克/微升载体大小=4.969kb，浓度=0.115微克/微升选取：载体0.04pmol；片段0.12pmol（载体：片段=1:3）代入公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数；载体用0.129微克（1.12微升）；片段用0.043微克（0.23微升）：：：注意20微升体系得出：载体和片段的总质量=0.043+0.129=0.172微克（在20微升体系所要求的0.02~0.2微克之间）连接体系：体积按需调整，我们喜欢用20ul的体系。
你如果要用10ul的，把上述用量减半。
20ul体系：3d水15.65 ul，片段0.23 ul，载体 1.12 ul，将上面三个液体混匀，45摄氏度水浴5min，迅速插入冰中，2min保持在冰浴中，加入10×buffer 2 ulT4 DNA ligase 1 ul混匀，4℃连接过夜另外一种推算结果设x1为DNA片段pmol数，x2为其ug数；设y1为载体pmol数，y2为载体ug数，a为DNA片段的kb数，b为载体的kb数，并且假定摩尔比为DNA片段：载体=3:1，则有x1·a·0.65=x2y1·b·0.65=y2x1：y1=3x2+y2=0.2（总质量）最后提示：不要怕测OD260浪费了回收的载体和片段，因为实际上用的很少（见上述）。
构建真核表达载体和融合载体经验pcr
此方法可能很多师兄师姐们都在用，只是当时的确没有找到相关的详细说明，学弟再次把自己摸索出来的一点心得写出来，高手就多多指正，没做过的就相互学习下，见笑）由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）也难怪老板一口回绝只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen的质粒小提，累死人不偿命后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6 因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5.模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C 或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的条带7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。
载体构建注意事项
载体构建注意事项在进行载体构建时，我们需要注意一些重要的事项，以确保构建的效果和质量。
本文将就这些注意事项进行详细介绍，希望能对大家有所帮助。
一、选择合适的载体材料在进行载体构建时，首先需要选择合适的载体材料。
载体材料应具备以下特点：具有良好的生物相容性，能够与生物体组织良好地结合；具有适当的力学性能，能够承受所需的载荷；具有良好的可加工性，便于进行构建和加工等。
常用的载体材料包括生物陶瓷、生物高分子材料、金属材料等。
二、考虑载体的结构设计在进行载体构建时，其结构设计也是非常重要的。
合理的结构设计可以提高载体的稳定性和功能性。
在设计载体的结构时，应充分考虑载体的应用场景和所需功能，并结合材料的特性进行合理设计。
例如，如果需要构建一个用于骨组织工程的载体，可以设计成多孔结构，以增加载体与细胞的接触面积和生物活性。
三、注意载体的表面处理载体的表面处理对于载体的性能和功能起着重要的影响。
通过合适的表面处理可以改善载体的生物相容性、生物活性和降解性能等。
常用的载体表面处理方法包括化学处理、物理处理和生物处理等。
例如，可以通过表面改性、离子注入等方法改变载体表面的化学性质；通过等离子体处理、激光处理等方法改变载体表面的形貌和结构。
四、选择适当的载体构建技术载体构建技术是实现载体构建的关键。
目前常用的载体构建技术包括三维打印、溶胶-凝胶法、纺丝法、电化学沉积法等。
在选择载体构建技术时，应根据载体的形态和所需功能选择合适的技术。
同时，还应考虑技术的成本、工艺复杂度、构建速度等因素。
五、进行载体的性能测试与评估在完成载体的构建后，还需要对其进行性能测试与评估，以确保其满足设计要求。
常用的性能测试包括载体的力学性能测试、生物相容性测试、生物活性测试等。
通过这些测试可以评估载体的稳定性、生物相容性和功能性等指标。
六、注意载体的保存与运输在完成载体构建后，应注意其保存与运输。
一般来说，载体应存放在干燥、阴凉和无菌的环境中，以防止载体的污染和降解。
质粒载体的构建
四、连接 很多公司都有快速连接试剂盒和普通试剂盒。一般都是 16 度数个小时或者过夜，或者 4 度 过夜，不一而同。曾在园子里看到一个高人的文章，认为是时间越长越好，甚至建议 4 度放 几天，我没有试过。16 度可以用 PCR 仪创造，或者找一个泡沫盒，加上冰，水搞到 15 度 左右，放入 4 度冰箱即可。我用的 TAKARA 的快速连接试剂盒，4 度过夜。 菜鸟体贴提示： 1、 通过电泳，粗略判定质粒和 DNA 的浓度比例。一般加入连接液的 DNA:质粒＝9：1 2、 放入质粒和 DNA 的总量要适当，不可超过说明书，宁少不要多。
质粒载体的构建－菜鸟入门手册
dongkey 制作
本人刚刚完成质粒载体的构建，总结了一下，以方便要做这方面的菜鸟同学借鉴一下，希望 老鸟同学批评指教。 一、确定插入的基因片段。 首先要确定自己要插入载体中的基因片段，比如要做蛋白表达和功能，可以选择 CDS 区进 行插入。然后自然是如何得到这段基因片段的问题了。最常见的是 PCR 解决了。那么就涉 及到引物的设计。插入 CDS 基因片段的例子：找到 CDS，根据 CDS 设计全长引物，然后 加上内切酶的碱基片段（这要根据自己手头上有的质粒的内切酶位点来决定了），注意，前 面要加上保护碱基！然后进行 PCR。 PCR 后要跑电泳确定目的基因的长度是正确的。 用乙醇沉淀法纯化 PCR 产物（具体见分子克隆一书） 菜鸟体贴提示：要在质粒上找到两个最好不是连续在一起的内切酶，然后分别添加在两条引 物的 5‘端，当然内切酶的温度最好是一致的，而且可以能够同时切开的（双酶切）。这可 以在试剂公司的限制性内切酶的列表上找到有没有共同的 BUFFER 及其双酶切时的活性如 何（当然是越大越好了）。内切酶的公司一般可以找 NEB, TAKARA, TOYOBO 等公司，本 人用的是 TAKARA。 二、酶切 将质粒和基因片段分别进行酶切。最省事的是同时双酶切了。一般酶切温度都是 37 度。 菜鸟体贴提示： 1、 确定质粒和基因片段的量！！（宁少不多），根据说明书加样，一般是 DNA＋BUFFER＋
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做酶切要注意的问题
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下：
1) 克隆基因的酶切位点问题
2) 载体酶切的问题
3) 连接片段浓度比的问题
在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题
1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DN 段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI 4
NdeI 6
NheI 3
NotI 8
PmeI 6
SacI 3
SalI 3
SmaI 3
HindIII 3
BstI 8
SphI 4
XhoI 3
XbaI 3
SmaI 4
案例分析一：本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
后查文献得知症结所在，在NdeI序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。
大家引以为戒啊。
现在普通酶我都引入三个保护碱基。
现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重复实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。
呵呵。
二、载体酶切的问题
1、质粒的单酶切鉴定。
这个问题似乎很简单，但我认为很有着重强调之必要。
现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，这些问题都是要核实的。
因此，在实验开始之前必须对质粒载体进行单酶切鉴定。
现在我每次构建之前，对所选择的克隆位点都要作一一鉴定，例如选择NdeI和HindIII作为克隆位点，就先分别对质粒上这两个酶的酶切位点进行单酶切鉴定。
单酶切鉴定能有效地切开后，再发出引物合成定单，进行引物合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。
2、连接反应的对照。
在实验中，这步骤属于质粒载体与外源DN段的连接反应。
成功与否，很大程度上取决于与质粒和DN段的酶切效果。
一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但这两种酶在通用缓冲液中酶切效率不一样，这可能导致部分的单缺口的质粒片段存在，这样，在连接反应中，即使在外源DN段存在下，这种单缺口的质粒片段能够进行更快速有效自我连接。
最终结果是大量假阳性的菌斑生长。
对照连接反应中，在不加入外源片段情况下，实验结果如果有菌斑生长，说明双酶切不充分，质粒DNA必须重新进行双酶切。
实验案例分析2：本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。
但就是没有阳性。
后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。
又是一个月没有进展，浪费精力和药品。
血的教训啊。
因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样
的，分辨不出。
如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。
实验案例分析3：本实验室一个号称实验严谨的大博士，用KpnI和HindIII构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑KpnI酶失效。
迁怒KpnI，在我不知情下扔掉实验室所有KpnI酶。
我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，后经鉴定HindIII位点失效。
最后他责备本人暗中保留一手，没有倾攮相授。
呵呵，他不自责自己不思考，只是木着脑袋做实验，反倒咬一口解铃人，再说我在那以前也不知道他遇到什么难题。
呵呵，你说冤不冤？这世道啊!也可看出，实验室人员之间相互交流相当重要。
两星期前写了前两问题后，终于能抽时间写第三个问题，在做好前述两个方面工作后，这个问题相对简单。
三、连接时两片段浓度比问题
一般实验指导手册上都说质粒：片段＝1：3（摩尔比），在实际操作中我以为在1：5甚至1：10为宜。
做好“一、二”，16℃10小时后，每次都能有效地连接上。
当然还有大肠杆菌感受觉态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，都用“天为时代公司”的产品，感觉还不错（特别声明我不是天为公司内线，呵呵）。
这里介绍一个估测处DNA浓度的方法：DNA可以用紫外法检测，也可以电泳对比marker估测，在要求不是很精确情况下，大家不妨试试下面方法：
1．取一平皿。
2．薄薄倒一层含有EB的琼脂糖胶，凝固(4 ℃可以存一个星期)。
3．平皿背面可以画成小方格。
4．一小格中点1 ul样品。
5．另一小格格点1 ul DNA标准品(我一般用Takara 2000 DNA lander，1 ul相当60 ng) 6．凉干后，紫外灯下根据亮度就可以估测了。
OK，我连接时这么估测浓度，5分钟就要可以知道两片段浓度。
其实连接片段浓度比可以充许在一个范围内，1：5至1：10都可以，所以上述估测方法在这种情况下是行得通的。