载体构建介绍

5.常见问题

选择标记类型和选择 1、选择性标记类型 药物抗性（如Kan，Amp等） 营养依赖性标记（如SC-Leu 等） 2、如何选择 根据所选载体上所带的标记
5.常见问题

Gateway系统引物设计-需要对读码框
这是因为中间载体和终载体上某些编码氨基酸或者抗性 基因同目的片段共用一个起始密码子。
载体构建
戎浩 2015.12
C
ONTENTS
目录
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载体简介 载体构建
注意事项 常见问题
1.载体简介
目的基因的克隆与鉴定
ห้องสมุดไป่ตู้
生理检测 纯化
载体构建
大肠转化，质粒 提取与鉴定
移栽
分子检测
继代繁殖 农杆菌的转化与活化
外植体制备
筛选
浸
染
共培养
1.1载体
载体（vector） ，能将外源DNA或基因片段携带入 宿主细胞内的一个具有自我复制能力的DNA分子。
退火温度不合适，设置梯度，选择最适退火温度
2、条带不单一
引物不特异，适当增长引物序列长度；
适当提高退火温度
5.常见问题

载体酶切的问题 1、酶切质粒浓度和纯度要好 2、酶切温度和时间
如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在
用另一个酶切，时间最好过夜切。 3、没有切开 可能是酶失活，建议酶切时增加阳性对照，确定酶是 否好用
5.常见问题

克隆基因的酶切位点及引物问题 1、单酶切 单酶切后进行连接，质粒自连、目的片段自连、目的
片段之间连接、目的片段和载体各种错误连接、目的片段
反向连接等等，尽量不选单酶切 2、保护碱基数目的问题。 在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保 护碱基，这会使得酶切效率大大提高。
5.常见问题
5.常见问题

连接过程中的问题 1、连接时间和温度：一般16℃，2个小时就可以了，如果后续 实验检测阳性克隆较少，可采用16℃过夜连接提高连接成功
率；
2、未避免后续菌落PCR的假阳性情况，建议连接转化时做对照 组：酶切后的载体做自连接对照，如果对照组与实验组长出的
克隆数相差不大则很可能存在载体自连或者没完全切开的情况，
中间载体
1.2载体分类
卸甲载体 野生型的Ti质粒不能直接作为基因工程的载体，期 T-DNA区存在一段阻碍细胞分化和植株再生的基因 Onc，将其切除，即“解除”其“武装”，因此称为 卸甲载体。
1.2载体分类
双元表达载体 一般植物表达载体 是成套使用的，一套 中有两个，一个是带 有可以供插入外源表 达基因的MCS和筛选 标签的融合蛋白（通 常是GFP，GUS或抗 性基因蛋白）的普通 表达载体。另一个载 体就是双元表达载体。
1.2载体的功能

运送外源基因高效的转入到受体细胞中 为外源基因提供复制能力或整合能力

为外源基因的扩增或表达提供条件
1.3载体应具备的条件

具有对受体细胞的可转移性 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 具有多种单一的酶切位点

具有合适的选择性标记
2.载体构建（酶切连接）
1.2载体的分类

噬菌体载体 利用噬菌体作载体， 主要是将外来目的DNA 替代或插入中段序列， 使其随左右臂一起包装 成噬菌体，去感染大肠 杆菌，并随噬菌体的溶 菌繁殖而繁殖。
1.2载体的分类

病毒载体 感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于 动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病 毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其 中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁 殖和克隆，然后再引入真核细胞。 现在人们还在不断寻找新的载体，如叶绿体或线粒体 DNA也有可能成为载体。
目的基因获得 酶切 连接
引物设计
质粒提取
大肠杆菌转化
目的片段扩增
大肠杆菌转化
农杆菌转化
PCR产物纯化
TA克隆
依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分
别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一 起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
2.1目的基因的获得
1.2载体的分类

质粒载体 质粒载体是一种相对分子 质量较小、独立于染色体 DNA之外的环状DNA(一般有 1～200 kb左右)，有的一 个细菌中有一个，有的一 个细菌中有多个。质粒能 通过细菌间的接合由一个 细菌向另一个细菌转移， 可以独立复制，也可整合 到细菌染色体DNA中，随着 染色体DNA的复制而复制。
为获得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真 酶进行目的片段的扩增。（加尾）
3.4 PCR产物纯化
目的片段
琼脂糖凝胶电泳
切胶回收（方法参照试剂盒）
1.避免一些非特性条带 2.防止PCR体系中一些成分对转化的影响
3.5 BP反应
3.6 大肠杆菌转化 3.7 质粒提取
3.8 LR反应
3.9 大肠杆菌转化 3.10 农杆菌转化
3、双酶切引物设计 a、所选的酶切位点必须是载体上的，而目的片段中没 有的。
b、酶切位点不能太近，靠的太近的话，一般只能切开
一个。 c、两个酶切位点最好不要是同尾酶（效果相当与单酶 切）。 d、最好使用相同buffer的酶 e、使用实验室已有的酶
5.常见问题

目的片段的扩增失败 1、无条带 引物设计错误；
2.6 大肠杆菌转化 2.7 质粒提取
2.8 酶切
体系：限制性核酸内切酶 2.5 μL 10 × buffer 5.0 μL 质粒 20 μL 37℃，2h ddH2O to 50 μL 对pMD19-目的基因和表达载体（如PSB130）分别 进行酶切
2.9 连接
体系：T4连接酶 T4 buffer 表达载体 目的片段 0.5 μL 1.0 μL 1.0 μL 7.5 μL
M + -
M + -
5.常见问题

表达鉴定 有的克隆前面的步骤都正确，可就是不表达 1、有的载体质粒为单顺反子，且启动子位于多克隆位点
之后，这种情况要求在扩增目的片段时引物要含有起始密
码子，否则是无法表达出相应蛋白的。 2、注意表达细胞系的状态及转染效率，转染效率可以用 带荧光标签的载体进行检测。
16℃，8h
2.10 大肠肝转化
2.11 农杆菌转化
3.载体构建（同源重组）
目的基因获得 LR反应 大肠杆菌转化
引物设计
质粒提取
农杆菌转化
目的片段扩增
大肠杆菌转化
PCR产物纯化
BP反应
3.1目的基因的获得
从NCBI或者相应的数据库，文献等等获得。
3.2引物设计
加attB的接头，对读码框
3.3 PCR
4.注意事项

PCR产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后
续实验；

在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间； 连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要 参数之一就是温度，因此要控制好连接温度。

进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，
导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常 采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制 DNA片段的自身环化。
从NCBI或者相应的数据库，文献等等获得。
2.2引物设计（合适的酶切位点） 2.3 PCR
为获得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真 酶进行目的片段的扩增。（加尾）
2.4 PCR产物纯化
目的片段
琼脂糖凝胶电泳
切胶回收（方法参照试剂盒）
1.避免一些非特性条带 2.防止PCR体系中一些成分对转化的影响
重新酶切，增加酶量及酶切时间、适当减少所切载体的量、改 变连接比等；如果对照组没有克隆形成或鲜有克隆形成，则可 继续进行后续验证。
5.常见问题

M + - 1 2 3 4
菌落PCR 为了方便发现问题，菌落PCR要设置阳性对照 组（原始目的片段做模板）和阴性对照组（以 双蒸水为模板） 1、多次PCR均无阳性克隆存在 假阳性过高，可能是由于抗性失效，建议换 培养皿； 2、 阴性对照组也有条带 可能是因为引物或其他试剂被模板污染了， 建议跟换试剂，酒精擦拭PCR仪； 3、阳性对照也无条带 酶失活或者其它试剂发生问题或忘记添加， 重 新换试剂PCR鉴定 鉴定为阳性的克隆记得保存原菌液，避免后续 转化过程发生突变而丢失连接成功的克隆。
1.2载体的分类
克隆载体 植 物 基 因 工 程 载 体
中间载体
卸甲载体 一元表达载体
双元表达载体
表达载体
1.2载体分类
克隆载体 可携带出入的外源 DNA片段并可转入受 体细胞中大量扩增的 DNA分子。通常含有 筛选标记，在插入外 源的基因的时候不会 破坏载体本身的自我 复制功能。
1.2载体分类
2.5 TA克隆
聚合酶链反应产物的克隆载体，线性化后两侧3′端各多 出一个脱氧胸苷酸(T)。由于PCR产物两侧3′端通常含单 个脱氧腺苷酸(A)，与T载体（pMD19）之间的A-T互补， 因此称为TA克隆。
体系： T载体 目的片段 Solution I 0.5 μL 4.5 μL 5.0 μL
16℃，8h