重组质粒的构建经验 [技巧]
同源重组构建质粒原理及方法
同源重组构建质粒原理及方法一、引言同源重组构建质粒是基因工程领域的关键技术，它通过将外源基因片段与适当的质粒DNA相连接，实现外源基因的表达和遗传转移。
本文将详细介绍同源重组构建质粒的原理和方法，以及常用的实验步骤和注意事项。
二、原理同源重组构建质粒的原理是通过内切酶在两个同源DNA片段上切割，然后连接起来形成一个新的质粒DNA。
同源DNA片段通常由外源基因和质粒DNA提供，通过互补的粘性末端序列将它们连接起来。
三、方法以下是同源重组构建质粒常用的方法和步骤：1. 选择合适的质粒和酶切位点首先，需要选择一个适合的质粒，根据实验需要选择带有合适酶切位点的质粒。
同时，还需要选择适合的内切酶用于切割质粒和外源基因片段。
2. 切割质粒和外源基因片段将选择好的质粒和外源基因片段与相应的内切酶一起反应，将其切割为互补的粘性末端序列。
切割后的质粒和外源基因片段会留下粘性末端。
3. 进行连接反应将切割好的质粒和外源基因片段加入连接反应中，可以使用DNA连接酶来催化连接。
4. 转化宿主细胞将连接好的质粒转化到宿主细胞中，常用的方法有热擦法、电穿孔法和化学法等。
宿主细胞可以是大肠杆菌等常用的实验宿主细胞。
5. 筛选转化子将转化到宿主细胞中的质粒进行筛选，可以通过选择性培养基或进行基因标记（如荧光蛋白等）来筛选转化子。
四、注意事项在同源重组构建质粒过程中，需要注意以下事项：1. 同源重组效率同源重组的效率是影响质粒构建成功率的关键因素。
需要合理选择酶切位点，确保质粒和外源基因片段有足够的同源性。
2. DNA连接酶的选择DNA连接酶的选择也是非常重要的。
不同的DNA连接酶在连接效率和酶切位点的要求上有所区别，选择适合的连接酶能提高连接效率。
3. 转化宿主细胞选择转化宿主细胞的选择也会影响质粒构建的成功率。
不同的宿主细胞对质粒的转化效率和表达能力有所不同，需要根据实验要求选择合适的宿主细胞。
4. 合理设计实验对照组为确保实验结果的可靠性和准确性，需要设计适当的对照组，验证质粒构建的成功性和外源基因的表达情况。
重组质粒的构建
重组质粒的构建重组质粒的构建是基因工程的核心步骤之一，其目的是将目的基因插入到质粒载体中，以实现目的基因的稳定表达和克隆化。
以下是重组质粒构建的主要步骤：1.目的基因获取首先需要获取目的基因。
目的基因可以从基因文库、PCR、基因组测序等方法中获取。
根据需要选择合适的方法，将目的基因克隆到质粒载体中。
2.载体质粒选择选择适合的质粒载体是重组质粒构建的关键步骤之一。
根据目的基因的特点和表达要求，选择适合的质粒载体。
常见的质粒载体有pET、pUC、pBluescript等。
3.限制性酶切限制性酶切是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过限制性酶切，将目的基因和质粒载体分别切开，露出粘性末端，以便于连接反应。
4.连接反应将切好的目的基因和质粒载体的粘性末端连接在一起，形成重组质粒。
连接反应需要使用T4DNA连接酶或其它连接酶进行催化。
连接反应需要在适宜的温度和pH 条件下进行一定时间，以确保重组质粒的正确构建。
5.转化宿主细胞将连接反应得到的重组质粒转化到宿主细胞中。
常见的宿主细胞有细菌、酵母、昆虫等。
转化方法有多种，如电穿孔法、化学转化法等。
转化后需要在适宜的培养条件下进行培养，以获得大量的重组质粒。
6.克隆筛选克隆筛选是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过克隆筛选，可以确定重组质粒是否正确构建。
常见的克隆筛选方法有蓝白斑筛选、酶切法等。
7.序列验证最后需要对重组质粒进行序列验证，以确保目的基因的正确插入和序列的准确性。
序列验证可以通过Sanger测序等方法进行。
构建重组质粒基本方法
构建重组质粒基本方法1.cDNA编码区片段的PCR扩增50ul ×2模版 15‘引物 13‘引物 1dNTP 110×buffer 5Taq 1Milliq H2O 402．PCR产物纯化1、加5倍体积的PB2、将Spin柱放于2ml收集管上3、加样液，14Krpm，离心1min4、弃去排出液5、加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min6、弃去排出液,14Krpm,离心1min7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中O),静置2min, 14Krpm，8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2离心1min3．双酶切载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n4．双酶切后的载体用试剂盒割胶回收1.割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）2.50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解3.将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中4.加样液，14Krpm，离心1min5.弃去排出液6.加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min7.弃去排出液,14Krpm,离心1min8.将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中9.往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq HO),静置2min, 14Krpm，2离心1min5．连接上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜。
连接体系如下：载体 2ulPCR 片段 6ul10xT4 buffer 1ulT4 DNA ligase 1ul6．转化取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul）。
重组质粒构建注意事项
重组质粒构建注意事项重组质粒构建是现代生物学中常用的技术手段，其能够利用DNA重组技术将感兴趣的基因片段插入到质粒中，从而探究基因的功能、调控及其在生物体中的作用。
下面是重组质粒构建中需要注意的一些关键问题。
1.选择合适的质粒载体：质粒是一种能够自主复制的小型DNA分子，其可以含有多个对基因表达有重要影响的元件，如启动子、终止子、选择性标记基因等。
因此，选择合适的质粒载体对于重组质粒构建至关重要。
一般而言，常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pBluescript等，根据实验需要选择适合的质粒载体。
2.选择合适的限制性内切酶：限制性内切酶是能够识别特定的DNA序列并具有切割作用的酶。
在重组质粒构建中，常需要利用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因片段的DNA，从而产生互补的粘性末端，便于二者连接。
因此，选择适合的限制性内切酶对于重组质粒的构建是非常重要的。
3.设计合适的引物：引物是在PCR扩增反应中用于识别目标DNA序列的短小DNA片段。
在重组质粒构建中，利用引物扩增目标基因片段是必不可少的步骤。
因此，设计合适的引物非常重要。
引物应具有良好的特异性，能够特异性地扩增目标基因片段，并且不会与质粒载体序列发生非特异性扩增。
此外，引物还可以设计一些限制性内切酶切割位点，以便于后续的连接工作。
4.进行寡核苷酸连接反应：连接反应是指将质粒载体和目标基因片段进行连接的步骤。
常用的方法有T4 DNA连接酶的连接反应和PCR引物连接法。
在连接反应中，需要注意合适的反应条件，例如连接反应的时间、反应体系的pH值、温度等，对连接效果有重要影响。
5.转化宿主细胞：转化是指将重组质粒导入宿主细胞中。
在进行转化实验时，需要注意选择合适的宿主细胞，例如大肠杆菌（E. coli）等，以及适当的培养基、适宜的温度和容器。
此外，还需要注意进行适当的筛选压力，如在含有选择性抗生素的培养基中进行培养，筛选能够稳定带有重组质粒的转化子。
重组质粒的构建
连接酶催化DNA连接的最佳反应温度是37℃
▪ DNA重组技术中的核心是DNA片段之间的体外连接方案
DNA连接酶及连接机制
1 ） ATP 通 过 磷 酸 基 团 与 T4 DNA连接酶中的亮氨酸形成 磷酸-氨基键，从而形成酶ATP复合物；
限制性内切酶
具备多个限制酶的 识别位点（多克隆位 点） ，以便外源DNA的 插入与截取。
多种酶切口 单一酶切口 多克隆位点
或具备特异的重组 位点
11
载体的选择与改造应具备的条件
3.具有合适的筛选标记
具有遗传表型或筛选 标记，以区别阳性重组分子 和阴性重组分子，主要有抗 药性基因、酶基因、营养缺 陷型及形成噬菌斑的能力等。
二、基础知识
2. 重组DNA技术的基本过程
（1）目的基因的获得 （2）载体的选择与制备 （3）目的基因与载体的结合（DNA分子的体外连接） （4）重组DNA导入受体 （5）重组体筛选和鉴定 （6）目的基因表达 （7）基因产物的分离纯化
DNA重组操作过程
ab
剪切
载体
重组
B
引入宿 主细胞
Ab
抗性筛选
T载体
▪ 一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平 头，再在70℃或72℃下在只加入dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效 率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T 反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。
▪ 如果使用ddTTP，效果会更好。
实验二 重组质粒的构建
一、实验目的
▪通过本实验学会琼脂糖凝胶DNA回收和重组 DNA连接的方法。
两大方法帮你搞定质粒构建
两大方法帮你搞定质粒构建质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。
原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA 连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体 DNA 进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
质粒构建方式多样，常规的 T4 连接酶，以及最近更受欢迎的重组酶方式。
下面小编就总结一下 T4 连接酶与重组酶构建质粒方法，通过比较，其最大的不同点可能在于目的基因的设计以及连接体系。
壹一. T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 连接酶，可以催化粘端或平端双链 DNA 或 RNA 的5’-P 末端和3’-OH 末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需 ATP 作为辅助因子。
1. 质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。
其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。
[可选酶切体系]VECTOR 3 ugCutSmart Buffer 5 ul限制性内切酶 1 1 ul限制性内切酶 2 1 ul酶切体系一般选择 50ul，试剂加好之后37°C 孵育 6~8 小时，或适当延长时间，保证质粒酶切完全。
每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切后载体通过切胶回收线性化载体。
2.根据目的序列构建引物后，引物设计原则简单总结一下:（1）前向引物：5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 1 酶切位点序列+基因正向引物序列 -3’ 端（2）反向引物：5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 2 酶切位点序列+基因反向引物序列 -3 ’端如果目的基因片段较长的话，可以选择 PCR 方式扩增目的基因片段[可选 PCR 扩增体系]ddH2O：14ul10xTaq buffer：2ul10um DNTP：1ul10um primer F：0.5ul10um primer R：0.5ul模板 DNA：1ulTaq 酶：1ul[可选 PCR 扩增条件](1)95℃：5min(2) 35cycle95℃：30s55℃：30s（退火温度可以根据目的引物TM值决定，一般退火温度根据引物TM值降低5度）72℃：40s(3)72℃：10min(4)16℃：hold引物扩增之后，首先要进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，然后通过胶回收，获得纯化目的片段产物.由于加入保护碱基，回收产物需要进行双酶切，双酶切方法与质粒酶切方法相同。
构建重组质粒基本方法
构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。
构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。
一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。
质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。
质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。
二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。
引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。
引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。
引物可以使用商业引物合成公司合成。
三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。
PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。
根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。
四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。
连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。
限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。
连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。
五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。
质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。
原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN的构建及鉴定
原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN的构建及鉴定
质粒是一种常见的DNA分子，在分子生物学研究中被广泛应用。
本文旨在介绍如何构建和鉴定一种基于原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN。
1. 构建方法
该质粒的构建主要包含四个步骤：
1）设计引物。
设计包含目标肽段的引物用于PCR扩增。
2）PCR扩增。
使用目标肽段的DNA模板，利用引物进行PCR扩增，生成包含目标肽段的DNA片段。
3）连接。
将PCR扩增产物与pUC57-CTP质粒进行连接，得到重组质粒pUC57-CTP-PTEN。
4）转化。
使用化学方法将重组质粒转化到大肠杆菌中。
2. 鉴定方法
接下来需要对重组质粒进行鉴定，主要包括以下几个方面：
1）限制性内切酶切割。
使用限制性内切酶对重组质粒进行酶切，验证重组质粒的存在。
2）PCR鉴定。
利用引物对重组质粒进行PCR扩增，验证重组质粒中是否包含目标肽段。
3）测序验证。
将重组质粒进行测序，验证其序列与设计的目标序列是否一致。
4）原核表达验证。
利用质粒进行原核表达，检验目标肽段是否得到表达。
以上鉴定结果均符合预期，表明成功构建了基于原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN。
该质粒在分子生物学以及其他领域中具有较广泛的应用前景。
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重组质粒的构建经验 [技巧]
重组质粒的构建经验~~~
昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6
SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4
XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4 案例分析一:本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
后查文献得知症结所在，在NdeI序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。
大家引以为戒啊。
现在普通酶我都引入三个保护碱基。
现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重复实验花费时间
与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。
呵呵。
二、载体酶切的问题 1、质粒的单酶切鉴定。
这个问题似乎很简单，但我认为很有着重强调之必要。
现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，这些问题都是要核实的。
因此，在实验开始之前必须对质粒载体进行单酶切鉴定。
现在我每次构建之前，对所选择的克隆位点都要作一一鉴定，例如选择NdeI和
HindIII作为克隆位点，就先分别对质粒上这两个酶的酶切位点进行单酶切鉴定。
单酶切鉴定能有效地切开后，再发出引物合成定单，进行引物合成;若不能，就按“一”中原则进行调换。
2、连接反应的对照。
在实验中，这步骤属于质粒载体与外源DNA片段的连接反应。
成功与否，很大程度上取决于与质粒和DNA片段的酶切效果。
一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但这两种酶在通用缓冲液中酶切效率不一样，这可能导致部分的单缺口的质粒片段存在，这样，在连接反应中，即使在外源DNA片段存在下，这种单缺口的质粒片段能够进行更快速有效自我连接。
最终结果是大量假阳性的菌斑生长。
对照连接反应中，在不加入外源片段情况下，实验结果如果有菌斑生长，说明双酶切不充分，质粒DNA必须重新进行双酶切。
实验案例分析2:本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。
但就是没有阳性。
后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。
又是一个月没有进展，浪费精力和药品。
血的教训啊。
因为当时没有注意到:单切质粒是一条
带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。
如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。
实验案例分析3:本实验室一个号称实验严谨的大博士，用KpnI和HindIII构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑KpnI酶失效。
迁怒KpnI，在我不知情下扔掉实验室所有KpnI酶。
我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，后经鉴定HindIII位点失效。
最后他责备本人暗中保留一手，没有倾攮相授。
呵呵，他不自责自己不思考，只是木着脑袋做实验，反倒咬一口解铃人，再说我在那以前也不知道他遇到什么难题。
呵呵，你说冤不冤,这世道啊!也可看出，实验室人员之间相互交流相当重要。
两星
期前写了前两问题后，终于能抽时间写第三个问题，在做好前述两个方面工作后，这个问题相对简单。
三、连接时两片段浓度比问题一般实验指导手册上都说质粒:片段,1:3(摩尔比)，在实际操作中我以为在1:5甚至1:10为宜。
做好“一、二”，16? 10小时后，每次都能有效地连接上。
当然还有大肠杆菌感受觉态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，都用“天为时代公司”的产品，感觉还不错(特别声明我不是天为公司内线，呵呵)。
这里介绍一个估测处DNA浓度的方
法:DNA可以用紫外法检测，也可以电泳对比marker估测，在要求不是很精确情况下，大家不妨试试下面方法: 1( 取一平皿。
2( 薄薄倒一层含有EB的琼脂糖胶，凝固 (4 ?可以存一个星期)。
3( 平皿背面可以画成小方格。
4( 一小格中点1 ul样品。
5( 另一小格格点1 ul DNA标准品(我一般用Takara 2000 DNA lander，1 ul相当60 ng) 6( 凉干后，紫外灯下根据亮度就可以估测了。
OK，我连接时这么估测浓度，5分钟就要可以知道两片段浓度。
其实连接片段浓度比可以充许在一个范围内，1:5至1:10都可以，所以上述估测方法在这种情况下是行得通的。