构建质粒经验
学会构建质粒这一招，你可以靠卖质粒发家致富啦！
学会构建质粒这一招，你可以靠卖质粒发家致富啦！你是否曾遇到这样的问题，老板让你研究一个新的基因，你需要用到这个基因的质粒，可是实验室没有师兄师姐研究过，所以光靠换载体这点技能已经不足以让你构建出你所需要的质粒了，然而公司的报价特别高，一千两千还是便宜的，甚至还有报价上万的质粒，并且货期很长，老板催促你要结果，或者不愿意花那么多钱给你买质粒，这时候你该怎么办？今天教的这一招，你以后都可以自己动手从零开始构建质粒啦。
构建质粒，最重要的是两样东西，一个是这个基因的CDS片段，另一个是空载，对于常做分子克隆的实验室，空载是肯定有的啦，没有的话去隔壁实验室借一点也是没问题的，所以问题的重心就是CDS 片段怎么来！！RNA大家都提取过吧，做QPCR之前要先从处理过的细胞中提取RNA，然后逆转录成CDNA。
想到了吧，我们的CDS片段就可以从这一堆CDNA里挑出来，我们用来构建质粒的CDNA与用来做QPCR的CDNA唯一的不同在于，我们逆转录用的酶不一样，在这里给大家推荐一款：全式金的AT321TransScriptTM II All-in-One First-Strand cDNASynthesis SuperMix for PCR用你手上有的细胞提取RNA，接着用此酶进行逆转录获得CDNA，之后就可以用这个CDNA作为模板来进行后面的实验了。
有时候可能在某个细胞株中你所需要的基因恰好是有突变的，这时候你可以换个细胞株试试，也可以尝试把突变的地方再突变回来。
接着我们以KLF4基因为例来构建质粒：1、首先在PUBMED中找到KLF4的CDS序列，在GENE中搜索KLF4，选择HOMO，点击进入2、进入下面这个页面之后，一直往下拉，3、拉到这个位置，选择自己需要的转录本，在这里我选择第一个，点击进入4、页面如下，往下拉，看见CDS，点击CDS可以使此基因的CDS序列显示为高亮文本，如图5、为了可以完整的把CDS序列P出来，所以我们的引物应该设计在高亮文本以外的区域，打开Primer-BLAST来设计引物6、将刚才查到的所有的序列复制粘贴入输入框中，输入引物的范围，产物的大小，最小为CDS的长度，最大为贴入这段序列的长度7、点击GET Primers8、挑选一对副产物少的引物就好了9、引物合成后，就可以以CDNA为模板P出你想要的片段了。
同源重组构建质粒原理及方法
同源重组构建质粒原理及方法一、引言同源重组构建质粒是基因工程领域的关键技术，它通过将外源基因片段与适当的质粒DNA相连接，实现外源基因的表达和遗传转移。
本文将详细介绍同源重组构建质粒的原理和方法，以及常用的实验步骤和注意事项。
二、原理同源重组构建质粒的原理是通过内切酶在两个同源DNA片段上切割，然后连接起来形成一个新的质粒DNA。
同源DNA片段通常由外源基因和质粒DNA提供，通过互补的粘性末端序列将它们连接起来。
三、方法以下是同源重组构建质粒常用的方法和步骤：1. 选择合适的质粒和酶切位点首先，需要选择一个适合的质粒，根据实验需要选择带有合适酶切位点的质粒。
同时，还需要选择适合的内切酶用于切割质粒和外源基因片段。
2. 切割质粒和外源基因片段将选择好的质粒和外源基因片段与相应的内切酶一起反应，将其切割为互补的粘性末端序列。
切割后的质粒和外源基因片段会留下粘性末端。
3. 进行连接反应将切割好的质粒和外源基因片段加入连接反应中，可以使用DNA连接酶来催化连接。
4. 转化宿主细胞将连接好的质粒转化到宿主细胞中，常用的方法有热擦法、电穿孔法和化学法等。
宿主细胞可以是大肠杆菌等常用的实验宿主细胞。
5. 筛选转化子将转化到宿主细胞中的质粒进行筛选，可以通过选择性培养基或进行基因标记（如荧光蛋白等）来筛选转化子。
四、注意事项在同源重组构建质粒过程中，需要注意以下事项：1. 同源重组效率同源重组的效率是影响质粒构建成功率的关键因素。
需要合理选择酶切位点，确保质粒和外源基因片段有足够的同源性。
2. DNA连接酶的选择DNA连接酶的选择也是非常重要的。
不同的DNA连接酶在连接效率和酶切位点的要求上有所区别，选择适合的连接酶能提高连接效率。
3. 转化宿主细胞选择转化宿主细胞的选择也会影响质粒构建的成功率。
不同的宿主细胞对质粒的转化效率和表达能力有所不同，需要根据实验要求选择合适的宿主细胞。
4. 合理设计实验对照组为确保实验结果的可靠性和准确性，需要设计适当的对照组，验证质粒构建的成功性和外源基因的表达情况。
两大方法帮你搞定质粒构建
两大方法帮你搞定质粒构建质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。
原理依赖于限制性核酸内切酶，dna连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体dna进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
一.t4dnaligase即t4dna连接酶，可以催化粘端或平端双链dna或rna的5’-p末端和3’-oh末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需atp作为辅助因子。
1.质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。
其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。
[附加酶乌体系]vector3ugcutsmartbuffer5ul限制性内乌酶11ul限制性内乌酶21ul酶切体系一般选择50ul，试剂加好之后37°c孵育6~8小时，或适度延长时间，确保质粒酶乌全然。
内要一段时间震荡一下并Vergt以免液滴冷却至管盖上。
酶乌后载体通过切胶废旧线性化载体。
2.根据目的序列构建引物后，引物设计原则简单总结一下:（1）前向引物：5’端-保护碱基序列+限制性内切酶1酶切位点序列+基因正向引物序列-3’端（2）逆向引物：5’端的-维护碱基序列+限制性内乌酶2酶切位点序列+基因逆向引物序列-3’端的如果目的基因片段较长的话，可以选择pcr方式扩增目的基因片段[附加pcr扩充体系]ddh2o：14ul10xtaqbuffer：2ul10umdntp：1ul10umprimerf：0.5ul10umprimerr：0.5ul模板dna：1ultaq酶：1ul[可选pcr扩增条件](1)95℃：5min(2)35cycle95℃：30s55℃：30s（退火温度可以根据目的引物tm值决定，一般退火温度根据引物tm值降低5度）72℃：40s(3)72℃：10min(4)16℃：hold引物扩充之后，首先必须展开琼脂糖凝胶电泳检验条带大小，然后通过胶废旧，赢得提纯目的片段产物.由于重新加入维护碱基，废旧产物须要展开双酶乌，双酶乌方法与质粒酶乌方法相同。
重组质粒的构建经验 [技巧]
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重组质粒的构建经验 [技巧]重组质粒的构建经验~~~昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4 案例分析一:本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
质粒构建中 DNA片段与载体连接的经验
在排除了其他问题后，我做了摩尔比的调整，需要做OD260的测量。
不要怕浪费回收的载体和片段因为实际用量非常少，看了下面我们的实验实例就知道了。
摩尔比是指载体和插入片段，在连接时的摩尔比。
1 比例应该在1:2-6之间（载体：片段；片段要多）。
2 连接体系如果是20微升，载体和片段的总质量（微克）要在0.02微克~0.2微克之间。
如果是10微升，则在0.01~0.1微克之间。
我一般都用到接近上限。
3 EDTA不能太多。
否则可能影响连接酶。
附加：如何计算摩尔数和微克数（用20微升的链接体系，NEB的T4 DNA ligase）公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数实例：片段大小=555bp=0.555kb，浓度=0.19微克/微升载体大小=4.969kb，浓度=0.115微克/微升选取：载体0.04pmol；片段0.12pmol（载体：片段=1:3）代入公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数；载体用0.129微克（1.12微升）；片段用0.043微克（0.23微升）：：：注意20微升体系得出：载体和片段的总质量=0.043+0.129=0.172微克（在20微升体系所要求的0.02~0.2微克之间）连接体系：体积按需调整，我们喜欢用20ul的体系。
你如果要用10ul的，把上述用量减半。
20ul体系：3d水15.65 ul，片段0.23 ul，载体 1.12 ul，将上面三个液体混匀，45摄氏度水浴5min，迅速插入冰中，2min保持在冰浴中，加入10×buffer 2 ulT4 DNA ligase 1 ul混匀，4℃连接过夜另外一种推算结果设x1为DNA片段pmol数，x2为其ug数；设y1为载体pmol数，y2为载体ug数，a为DNA片段的kb数，b为载体的kb数，并且假定摩尔比为DNA片段：载体=3:1，则有x1·a·0.65=x2y1·b·0.65=y2x1：y1=3x2+y2=0.2（总质量）最后提示：不要怕测OD260浪费了回收的载体和片段，因为实际上用的很少（见上述）。
质粒载体的构建
四、连接 很多公司都有快速连接试剂盒和普通试剂盒。一般都是 16 度数个小时或者过夜，或者 4 度 过夜，不一而同。曾在园子里看到一个高人的文章，认为是时间越长越好，甚至建议 4 度放 几天，我没有试过。16 度可以用 PCR 仪创造，或者找一个泡沫盒，加上冰，水搞到 15 度 左右，放入 4 度冰箱即可。我用的 TAKARA 的快速连接试剂盒，4 度过夜。 菜鸟体贴提示： 1、 通过电泳，粗略判定质粒和 DNA 的浓度比例。一般加入连接液的 DNA:质粒＝9：1 2、 放入质粒和 DNA 的总量要适当，不可超过说明书，宁少不要多。
质粒载体的构建－菜鸟入门手册
dongkey 制作
本人刚刚完成质粒载体的构建，总结了一下，以方便要做这方面的菜鸟同学借鉴一下，希望 老鸟同学批评指教。 一、确定插入的基因片段。 首先要确定自己要插入载体中的基因片段，比如要做蛋白表达和功能，可以选择 CDS 区进 行插入。然后自然是如何得到这段基因片段的问题了。最常见的是 PCR 解决了。那么就涉 及到引物的设计。插入 CDS 基因片段的例子：找到 CDS，根据 CDS 设计全长引物，然后 加上内切酶的碱基片段（这要根据自己手头上有的质粒的内切酶位点来决定了），注意，前 面要加上保护碱基！然后进行 PCR。 PCR 后要跑电泳确定目的基因的长度是正确的。 用乙醇沉淀法纯化 PCR 产物（具体见分子克隆一书） 菜鸟体贴提示：要在质粒上找到两个最好不是连续在一起的内切酶，然后分别添加在两条引 物的 5‘端，当然内切酶的温度最好是一致的，而且可以能够同时切开的（双酶切）。这可 以在试剂公司的限制性内切酶的列表上找到有没有共同的 BUFFER 及其双酶切时的活性如 何（当然是越大越好了）。内切酶的公司一般可以找 NEB, TAKARA, TOYOBO 等公司，本 人用的是 TAKARA。 二、酶切 将质粒和基因片段分别进行酶切。最省事的是同时双酶切了。一般酶切温度都是 37 度。 菜鸟体贴提示： 1、 确定质粒和基因片段的量！！（宁少不多），根据说明书加样，一般是 DNA＋BUFFER＋
如何构建质粒？
如何构建质粒？一、引物设计1.选择合适的载体。
酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。
2.在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。
①. 使用word排除目的片段里含有的酶切位点，最后确定所使用的酶。
②. 设计引物：primer-up：保护碱基4个,上游酶切位点,首位20个碱基;Primer-down：保护碱基4个,下游酶切位点,末尾20个碱基的反向互补碱基;③. 核对----送去合成。
④. 对合成的引物离心，10000rpm、5-10min、4℃，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（2dH2O），再把上游引物和下游引物混在一起，4℃保存。
二、 PCR（P出目的片段）（一）、从菌液里P出目的片段：1，揺菌过夜。
15ml离心管：2ul实验室菌液，Xul相应的抗生素，3ml LB2,pcr。
Pcr(50ul)反应体系：菌液1ul，2x PFU mix 25ul ，Primer 1ul；2d H2O 23ul。
Pcr温度体系：94℃ 30sec，94℃ 30sec 33cycles，58℃ 30sec 33cycles，72℃ X min；72℃ 5min。
（X是根据片段的长度设定，500-1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值2℃）3，跑胶、回收。
（1），配胶：1%的琼脂糖胶大块：称0.6g的琼脂糖，加入60ml的1X TAE，加入0.6ul的EB(待温度降到50-60℃左右时)煮沸3次；25分钟后，即可点样跑胶。
（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。
（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4，做胶回收（天根{TIANGEN}公司的DNA纯化回收试剂盒）:按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴，并且在加过EB后，放在37℃温箱中2min。
对胶回收的产物跑胶验证。
可建立10ul的体系：回收产物2ul、10xloading buffer 2ul、2d H2O 6ul。
质粒构建从入门到精通
质粒构建从入门到精通今天我们就来说说质粒构建——一名合格「快递员」的养成记。
质粒构建的原理外源 DNA 经 PCR 扩增后，用限制性内切酶分别切割载体和外源DNA 片段，DNA 连接酶将二者进行连接，然后转入宿主细菌，通过筛选鉴定获得重组克隆。
经过一系列的操作，「快递员」质粒就完成了呈递目标片段的工作。
质粒构建流程示意图质粒构建的步骤「快递」目标片段的过程主要有三个步骤：▼▼▼01PCR 扩增「快递」准备，首先要对目标片段进行扩增富集。
PCR 即聚合酶链式反应，它是一种用于扩增复制特定 DNA 片段的常用分子生物学技术。
PCR 的最大特点是能将微量的DNA 大幅扩增，在克隆前获得大量的目标基因片段。
PCR 扩增简要步骤：利用引物设计软件如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在线设计引物并合成后，配制PCR 反应体系：将模板、引物、dNTP、酶、反应缓冲液和 ddH₂O 按比例加入，加好后轻微点离，放入 PCR 仪中扩增目的片段，扩增后通过琼脂糖凝胶检测目的片段大小是否正确。
Tips▼扩增过程中的关键点▼QPCR 扩增中随着拷贝数的增加经常会出现二聚体、非特异性条带（大小不对）的现象。
答案点击下方空白处获得答案A：通过降低模板和引物浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量，提高退火温度，可以提高扩增特异性。
此外引物设计的好坏是关键。
除了按照常规引物设计规则外，构建载体时通常会在引物序列上添加酶切位点和保护碱基。
常规引物设计原则1.引物长度：18-30bp，常用 20-22bp 左右。
2.引物 Tm 值最好在60℃ 左右，两条引物间 Tm 值要保持接近，最好不超过5°C。
3.GC 含量 40%-60%，45-55% 为佳。
4.引物自身不应有连续4 个及以上碱基的互补，避免形成发卡结构。
5.引物之间不应有连续4 个及以上碱基的互补，避免形成引物二聚体。
6.3' 端避免连续碱基的重复，如 GGG 或 CCC 会导致错配的发生。
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重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。
所以其中其中还是有基本的技巧需要掌握。
在这里决定将我的心得分享于大家，以期能提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。
在本帖及之后继帖中将以一段PCR获得基因，以NdeI和HindIII位点克隆进入质粒为例来系统剖析重组质粒的构建中基本策略与技巧。
这作的经验积累与心得。
所涉及内容如下：
1) 克隆基因的酶切位点问题
2) 载体酶切的问题
3) 连接片段浓度比的问题
以上阐明上述问题同时，本人尽可能引入实验时会各种出现的问题予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题
1 对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识不赘述。
这里对NdeI和HindIII 为例。
2 设计PCR引物时的保护碱基数目。
这可能是初涉入未引起注意与重视问题。
NdeI需加入6个以上的保护碱基，而HindIII则要三个就可以。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA 片段上。
如NdeI就属这类。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数：
NcoI 4
NdeI 6
NheI 3
NotI 8
PmeI 6
SacI 3
SalI 3
SmaI 3
HindIII 3
BstI 8
SphI 4
XhoI 3
XbaI 3
SmaI 4
案例分析：本人最初用NdeI酶，未注意到该问题，只与普通酶一样引入两个保护碱基，一个月内没有进展。
后查文献得知症结所在，加下六个后，迎刃而解。
大家引以为戒啊。
现在普通酶我都引入三个保护碱基，现在合成价格不贵，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重要实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。
呵呵。
二、载体酶切的问题
1单切鉴定。
这个问题实是简单，但我认为很有着重强调之必要。
现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，在实验开始之前对质粒载体很有作单切鉴定之必要。
现在我每次构建之前，对所要用的酶切位点都作一一鉴定，比如要用到NdeI和HindIII，我就先对质粒该两个酶进行鉴定。
有效地切开后，再将引物发出合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。
2 质粒双切后对照连接。
实验中这是连接步骤，但实质还是质粒酶切问题。
一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但两种酶在通用缓冲液中中酶切效率不一样，可能导致部分只是单切缺口的质粒片段存在，这样，连接的对照实验在不加入外源片段时，质粒就会自连，长出菌斑，这种情况下，质粒酶切片段是不可能用于下一步真正连接实验。
案例分析：本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。
但就是没有阳性。
后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。
又是一个月没有进展，浪费精力和药品。
血的教训啊。
因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。
如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。
案例分析：本实验室一个号称实验严谨的大博士，有KpnI和HindIII构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑KpnI酶失效。
迁怒KpnI,在我不知情下扔掉实验室所满管KpnI酶。
我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，反而责备本人不早说出问题原因所在。
呵呵，他不自责自己只是闷头做实验，不早问，反倒咬一口解铃人。
呵呵，你说冤不冤？版主你的类似的冤可能更多吧，辛苦了!
两星期前写了前两问题后，终于能抽时间写第三个问题，在做好前述两个方面工作后，这个问题相对简单。
三、连接时两片段浓度比问题
一般实验指导手册上都说质粒：片段＝1：3（摩尔比），在实际操作中我以为在1：5甚至1：10为宜。
做好“一、二”，16℃10小时后，每次都能有效地连接上。
当然还有感觉态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，都用“天为时代公司”的产品，还不错（注明我不是天为公司内线，呵呵）。
这里介绍一个估测处DNA浓度的方法：DNA可以用紫外法检测，也可以电泳对比marker 估测，在要求不是很精确情况下，大家不妨试试下面方法：
1．取一平皿。
2．薄薄倒一层含有EB的琼脂糖胶，凝固(4 ℃可以存一个星期)。
3．平皿背面可以画成小方格。
4．一小格中点1 ul样品。
5．另一小格格点1 ul DNA标准品(我一般用Takara 2000 DNA lander，1 ul相当60 ng) 6．凉干后，紫外灯下根据亮度就可以估测了。
OK，我连接时这么估测浓度，5分钟就要可以知道两片段浓度。
其实连接片段浓度比可以充许在一个范围内，1：5至1：10都可以，所以上述估测方法在这种情况下是行得能的。